Плазмиды. Плазмиды, используемые при молекулярном клонировании строение, свойства, функции. Плазмидные векторы
 Скачать 34.51 Kb.
|
|
1 слайд Плазмиды, используемые при молекулярном клонировании: строение, свойства, функции. Плазмидные векторы. 2 слайд Молекулярное клонирование (которое также называют технологией рекомбинантных ДНК или генной инженерией) — это совокупность экспериментальных процедур, позволяющих осуществить перенос генетического материала из одного организма в другой. Одним из наиболее распространённых методов молекулярного клонирования является метод получения рекомбинантных плазмид. 3 слайд Плазмиды — это внехромосомные автономно реплицирующиеся двухцепочечные кольцевые молекулы ДНК, размеры которых варьируют от менее 1 (одной) до более 500 тыс. пар нуклеотидов. Плазмиды есть практически у всех бактерий, а также в отдельных археях и в эукариотических клетках, коими обладают высшие растения и грибы. 4 слайд Плазмиды включают в себя ряд элементов, к которым относится: точка начала репликации (ori), представляющая собой фрагмент молекулы ДНК, с которого начинается её репликация. Количество таких точек в плазмидах бывает разным. Как правило, при наличии нескольких точек репликации функционирует преимущественно одна, а остальные являются резервными. В зависимости от специфичности точки начала репликации зависит спектр хозяев плазмиды. Если точка начала репликации обладает высокой специфичностью, то плазмида может реплицироваться только в клетках одного вида, если же специфичность низкая, то она реплицируются в самых разных бактериальных клетках. структурные гены репликации (rep). Они кодируют белки, которые участвуют в инициации репликации плазмиды, связываясь с точкой начала репликации. локус генов, ответственных за копийность (cop). В состав локуса входят один или два гена, отрицательно влияющих на количество копий плазмиды в клетке. Также в этом локусе находится пять повторов последовательностей нуклеотидов, связываясь с которыми белок-инициатор уже не может в дальнейшем инициировать процесс репликации. далее гены (par), контролирующие распределение плазмид между дочерними клетками при делении. и детерминанты (ccd). Они, по сути, представляют собой систему токсин-антитоксин, из-за которой клетки, не унаследовавшие плазмиду при делении, погибают. В разных плазмидах могут присутствовать и другие структурные гены помимо упомянутых. 5 слайд Некоторые плазмиды могут интегрироваться в бактериальную хромосому с помощью механизма сайт-специфической рекомбинации и длительное время существовать как составная часть её структуры. Такая форма существования плазмид называется интегрированным состоянием. При выходе из состава хромосомы под влиянием тех или иных индуцирующих агентов возможно правильное либо неправильное «вырезание» плазмиды. Во втором случае в хромосоме остаются фрагменты плазмидного генома, а сама плазмида приобретает участки ДНК бактериальной хромосомы. 6 слайд Для своей репликации плазмиды используют репликативный аппарат клетки-хозяина, однако репликация плазмид происходит независимо от хромосомы. Каждая плазмида является самостоятельным репликоном и сама контролирует собственную репликацию. Схема репликации плазмиды представлена на слайде. 7 слайд Плазмиды, имеющие значительные молекулярные размеры (более 10 мкм длины), обнаруживаются в бактериальных клетках в небольшом числе экземпляров (1 - 2 копии на хромосому), поэтому их называют малокопийными плазмидами. Автономная репликация и последующая сегрегация таких плазмид регулируются согласованно с репликацией бактериального генома и поэтому в каждой клетке содержится только одна или две копии плазмиды. О таком типе репликации говорят как о репликации со строгим контролем. Самостоятельная репликация более мелких плазмид (0,5 - 10 мкм) подвержена менее строгому контролю и их число может достигать нескольких десятков копий на хромосому, т.е. они являются многокопийными. Такой тип репликации называется репликация с ослабленным контролем. Обычно на долю плазмидной ДНК приходится 0,1—5,0 % суммарной клеточной ДНК. 8 слайд Главной функциональной особенностью плазмид является механизм горизонтального переноса генов, т.е. они могут передаваться другим бактериям, клеткам растений и грибов. При этом плазмиды вносят в клетку информацию о новых признаках, т.к. содержат особые гены, которые отвечают за улучшение показателей приспособленности к внешним воздействиям и раздражителям, предоставляя устойчивость к лекарственным препаратам, а также способность продуцировать экзотоксины, ферменты, бактериоцины и т.д. 9 слайд Одни плазмиды содержат информацию, обеспечивающую их собственный перенос из одной клетки в другую (F-плазмиды), другие несут гены устойчивости к антибиотикам (R-плазмиды) или специфические наборы генов, ответственных за утилизацию необычных метаболитов (плазмиды деградации). Также есть плазмиды, в которых не обнаружены гены, выполняющие какие-то определенные функции (критические плазмиды). 10 слайд Как уже было сказано, одно из основных свойств F-плазмид заключается в том, что они передают содержащим их бактериальным клеткам конъюгативность, т.е. возможность вступать в конъюгацию с бесплазмидными (реципиентными) клетками и передавать им свою генетическую информацию. Это свойство F-плазмид и других конъюгативных плазмид обеспечивается находящейся в их составе генетической областью trа, включающей более 20 генов. Помимо F-плазмид и ряда других плазмид, относимых к категории «чистых» факторов переноса, в клетках бактерий различных видов обнаружены конъюгативные плазмиды, представляющие собой комбинированные структуры, в которых лишь одна часть является фактором переноса, а другая состоит из генов, имеющих хромосомное происхождение. Наиболее изученными из них являются плазмиды, содержащие гены устойчивости к антибиотикам. Их называют R-плазмидами, или R-факторами. Как ясно из вышесказанного они дают клетке устойчивость к определённым антибиотикам. Сами по себе гены устойчивости очень разнообразны: от кодируемых плазмидами β-лактамаз, разрушающих пенициллин, до мембранных белков, которые не дают тетрациклину накапливаться в клетках. Бактерии могут приобретать устойчивость к нескольким антибиотикам одновременно из-за нескольких плазмид, защищающих от разных антибиотиков, или благодаря одной плазмиде, содержащей гены устойчивости к разным антибиотикам. В широком плане к R-плазмидам относят также те из них, которые обеспечивают бактериям устойчивость к ионизирующему излучению, солям тяжелых металлов, бактериофагам, бактериоцинам, сыворотке крови и некоторым другим факторам. Некоторые плазмиды способны синтезировать патогенные для отдельных бактерий и клеток вещества, такие как гемолизины (или гемотоксины), которые повреждают оболочку эритроцитов и приводят тем самым к их гемолизу. Ещё некоторые плазмиды осуществляют синтез энтеротоксинов, вызывающих, к примеру, пищевое отравление у животных. Нередко плазмиды обеспечивают своего обладателя новыми метаболическими путями. Например, вместе с плазмидами может передаваться способность сбраживать лактозу или сахарозу. Также гены, содержащиеся в плазмидах, могут давать возможность их обладателям разрушать потенциально токсичные соединения. Например, у Pseudomonas putida имеется плазмида, содержащая гены ряда ферментов, которые превращают циклические углеводороды толуол и ксилол в бензоат. В следующей таблицы приведены примеры отдельных естественных плазмид и функций, ими выполняемых. 11 слайд Плазмиды передаются от одной клетке другой в процессе конъюгации, т.е. прямого переноса фрагмента ДНК от донорской бактериальной клетки к реципиентной при непосредственном контакте. Процесс конъюгации идёт следующим образом, сначала на поверхности клетки-донора образуется пиль, к которому прикрепляется клетка-реципиент, на поверхности которой есть специальные рецепторы, имеющие сродство к пилю. Затем между клетками формируется конъюгационный мостик и через него передаютсятся плазмиды, автономно пребывающие в цитоплазме донора. 12 слайд Завладев бактериальной клеткой, плазмида старается предотвратить проникновение и размножение в ней любой другой плазмиды того же типа. Для этого используются два независимых механизма: поверхностное исключение и плазмидная несовместимость. Поверхностное исключение не позволяет плазмидам внедряться в клетки, уже несущие другую плазмиду того же типа. Такой эффект достигается двумя способами: Первый из них заключается в том, что при формировании конъюгационных пар «донор-реципиент» блокируется фиксация кончика пиля клетки-донора на определенном специфическом рецепторе клетки-реципиента, что делает невозможным конъюгационную передачу плазмидной ДНК. Второй же способ состоит в подавлении выхода ДНК из клетки донора. В том случае, если в бактериальную клетку, уже несущую плазмидную ДНК, тем или иным способом внедряется дополнительная чужеродная плазмида, могут иметь место два исхода. При одном из них обе плазмиды могут нормально реплицироваться и переходить в дочерние клетки. В другом случае наблюдается подавление репликации одной плазмиды в присутствии другой, что приводит к тому, что в процессе размножения клетки наследуют только одну из двух плазмид либо избирательно, либо случайно. Данное явление получило название «плазмидная несовместимость». Несовместимость связана с жесткой регуляцией числа копий плазмид. Данный контроль достигается путем синтеза репрессора, определяющего число точек начала репликации. При внедрении в клетку другой, сходной плазмиды появляется новая точка репликации, т.е. точек репликации становится больше, чем нужно. В результате любая дальнейшая репликация плазмид предотвращается до тех пор, пока они не разойдутся в разные клетки или одна из плазмид не разрушится, т.е. пока не пропадёт избыток точек репликации. 13 слайд Явление несовместимости используют для классификации плазмид. Применяя несовместимость в качестве критерия, многие из известных плазмид были распределены на ряд групп несовместимости, члены которых не способны сосуществовать в одной клетке. К настоящему времени известно более 30 групп несовместимости, в состав которых входят от одной до нескольких десятков плазмид, на слайде представлены примеры некоторых из них. 14 слайд Как автономно реплицирующиеся генетические элементы плазмиды обладают всеми основными свойствами, которые позволяют использовать их в качестве векторов для переноса клонируемой ДНК. К таким важным свойствам относятся: 1) небольшой размер, поскольку эффективность переноса экзогенной ДНК в клетку-реципиент значительно снижается при длине плазмиды более 15 т. п. н.; 2) наличие уникального сайта рестрикции, в который может быть осуществлена вставка трансгена; 3) и наличие одного или более генетических маркеров для идентификации реципиентных клеток, несущих рекомбинантную ДНК. Но довольно часто природные плазмиды бывают лишены некоторых из вышеперечисленных свойств. Поэтому плазмидные векторы приходится создавать с помощью генной инженерии. 15 слайд Так что такое плазмидные векторы? Плазмидные векторы - это построенные на основе природных плазмид небольшие кольцевые молекулы ДНК (чаще до 10 т.п.н.), имеющие встроенный чужеродный ген (трансген), который будет внедряться в геном другого вида или экспрессироваться в клетках про- или эукариот. Плазмидные векторы содержат в своём составе только самые необходимые элементы, а именно: точку начала репликации (origin, oriV); гены rер, ответственные за автономную репликацию вектора; последовательности, обеспечивающие стабильное поддержание вектора в бактериальном потомстве; детекционный маркер (чаще это ген устойчивости к антибиотику); гены trа, ответственные за способность обеспечивать перенос генетического материала в процессе конъюгации; полилинкер, представляющий собой компактный фрагмент ДНК, буквально напичканный последовательностями, распознаваемыми рестриктазами. и собственно трансген. Большинство плазмидных векторов получено на основе природных плазмид ColE1, pMB1 и p15A. Название плазмидных векторов включает строчную английскую букву р (от англ. plasmid) и еще несколько букв, имеющих отношение к описанию вектора или к истории его создания. Так, например, буквы BR в обозначении плазмиды pBR322 указывают на авторство Ф. Боливара и Р. Родригеса, сконструировавших эту плазмиду, а число 322 — цифровое обозначение, взятое из их исследовательских протоколов. 16 слайд Для конструирования вектора природную плазмиду обрабатывают рестриктазой, расщепляющей ее в специальном сайте, подходящем для вставки требуемого фрагмента чужродной ДНК, в результате чего образуется линейная молекула с липкими концами, которые можно искусственно «сшить» между собой. Такие молекулы смешивают с донорной ДНК, содержащей нужный ген и предварительно обработанной такой же рестриктазой. Поскольку липкие концы этих двух ДНК взаимно комплементарны, они спариваются с образованием гибридных молекул. Далее смесь обрабатывают ДНК-лигазой в присутствии АТФ, в результате чего образуется множество разных комбинаций фрагментов. Концы фрагментов замыкаются с помощью водородных связей и ковалентно «сшиваются» ДНК-лигазой, образуя готовый плазмидный вектор. 17 слайд Ну и на этом у меня всё, спасибо за внимание. |