Автореферат Гапон М.Н.. Показатели антиоксидантной защиты организма при экспериментальном дисбактериозе кишечника, обусловленном применением антибиотика широкого спектра действия 03. 00. 04 биохимия 03. 00. 07 микробиология

• Название: Показатели антиоксидантной защиты организма при экспериментальном дисбактериозе кишечника, обусловленном применением антибиотика широкого спектра действия 03. 00. 04 биохимия 03. 00. 07 микробиология
• Дата: 17.03.2018
• Размер: 154 Kb.
• Имя файла: Автореферат Гапон М.Н..doc
• Тип: Документы; #38693
• страница: 1 из 3

На правах рукописи
Гапон Марина Николаевна


ПОКАЗАТЕЛИ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ ОРГАНИЗМА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ДИСБАКТЕРИОЗЕ КИШЕЧНИКА,

ОБУСЛОВЛЕННОМ ПРИМЕНЕНИЕМ АНТИБИОТИКА ШИРОКОГО СПЕКТРА ДЕЙСТВИЯ

03.00.04 - биохимия

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Ростов-на-Дону

2007

Работа выполнена в лаборатории микробиологии и разработки иммунобиологических препаратов Федерального государственного учреждения науки «Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и на кафедре общей и клинической биохимии №1 Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Росздрава «Ростовский государственный медицинский университет».
НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: доктор биологических наук,

профессор Микашинович З.И.

доктор медицинских наук,

доцент Терновская Л.Н.
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук,

профессор Погорелова Т.Н.

кандидат медицинских наук

Валиева С.З.
ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Федеральное государственное учреждение здравоохранения «Ростовский-на-Дону Ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумной институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Защита состоится « 7 » ноября 2007 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 212.208.07 по биологическим наукам в Южном федеральном университете (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Б. Садовая, 105, аудитория ____ ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Южного федерального университета (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148).
Автореферат разослан «___» _________________ 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук Бабенко В.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Организм человека и населяющая его микрофлора представляют собой единую высокоорганизованную, саморегулирующуюся, эволюционно сложившуюся систему, где взаимодействие микрофлоры и макроорганизма обеспечивает поддержание гомеостаза и равновесия на метаболическом, клеточном и молекулярно-генетическом уровнях (Бухарин О.В. с соавт., 1996; Гриневич В.Б., Захарченко М.М., 2003). Участие микроорганизмов в обмене веществ, иммунной защите и других процессах, поддерживающих гомеостаз макроорганизма, позволило высказать предположение, что нормальная микрофлора представляет собой «метаболически и регуляторно весьма активный «дополнительный орган» человеческого организма» (Шендеров Б.А., 1998; Барановский А.Ю., Кондрашина Э.А., 2002). Взаимоотношения «хозяин-микрофлора» носят сложный характер и еще далеко не ясно, в каких формах они реализуются внутри эндоэкологической системы (Дубинин А.В. и др., 1991). Сбалансированность системы «хозяин-микрофлора» может нарушаться и «при превышении интенсивности негативных внешних воздействий над пороговыми значениями адаптационной системы организма» (Парфенов А.И., Осипов Г.А., Ручкина И.Н., 2003), и при сдвигах в метаболической активности самой микрофлоры (Уголев А.М., 1985). Известно и то, что состав и функционирование нормальной микрофлоры того или иного биотопа во многом определяется состоянием среды их обитания (Бабин В.Н., Минушкин О.Н., Дубинин А.В. и др., 1998; Маянский А.Н., 2002). Существенно влияют на качественный и количественный состав микрофлоры такие факторы как: состав и количество слизи, разнообразие жидких и плотных структур, температура, поступление пищевых ресурсов, состояние барьерных тканей макроорганизма, локальная концентрация протонов (рН), факторы неспецифической резистентности, окислительно-восстановительный потенциал, концентрация кислорода и активность свободно-радикальных процессов (Дубинина Е.Е., 2001; Захарченко М.П. с соавт., 2004; Голошва Е.В., 2005). Изменение этих параметров, независимо от причин, их вызывающих, отражаются на составе и функционировании нормальной микрофлоры. Одной из самых распространенных причин, вызывающих изменения этих параметров, является воздействие ксенобиотиков (в частности, антибиотиков). Существует мнение, что под действием ксенобиотиков в первую очередь наступает повреждение микрофлоры кишечника, так как именно она в виде биопленки препятствует их проникновению в макроорганизм (Воробьев А.А. с соавт.,1997). Однако, по мнению Бабина В.Н. с соавторами (1998), «дисбактериоз есть не только нарушение видового состава и абсолютной численности популяций, но и более или менее значительные нарушения в системе хозяин-микрофлора». Установление факта развития гипоксического состояния эпителиальных клеток кишечника, высказанное положение о способности колоноцитов продуцировать токсические формы кислорода, изменение физико-химических параметров контактной приэпителиальной зоны (Бабин В.Н., Минушкин О.Н., Дубинин А.В., и др., 1998) создают предпосылки для более углубленного исследования взаимоотношений «хозяин-микрофлора».

Общепринятое представление о том, что нарушения в антиоксидантной защите макроорганизма лежат в основе развития многих патологических состояний, послужило основанием для выявления связи изменения микрофлоры толстого кишечника животных и состояния антиоксидантной защиты макроорганизма в динамике экспериментального дисбактериоза, обусловленного применением антибиотика широкого спектра действия - гентамицина.

Цели и задачи. Целью настоящего исследования явилось определение состояния антиоксидантной защиты макроорганизма в динамике экспериментального дисбактериоза, обусловленного применением антибиотика широкого спектра действия (гентамицина).

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать качественный и количественный состав микрофлоры кишечника в динамике экспериментального дисбактериоза, обусловленного введением гентамицина.

2. Исследовать состояние антиоксидантной защиты крови и колоноцитов в динамике экспериментального дисбактериоза.

3. Установить связь между состоянием микрофлоры кишечника и состоянием антиоксидантной защиты эритроцитов и колоноцитов при экспериментальном дисбактериозе.

4. Изучить влияние продукта функционального питания «Наринэ» на состояние микрофлоры и на некоторые показатели антиоксидантной защиты эритроцитов, колоноцитов в динамике экспериментального дисбактериоза.

Научная новизна. Впервые установлена взаимосвязь между нарушениями антиоксидантной защиты и нарушением микроэкологического равновесия в кишечном биоценозе.

Впервые установлено, что при дисбактериозе кишечника более выражены нарушения в состоянии антиоксидантной защиты эпителиоидных клеток кишечника.

Впервые показано, что увеличение содержания условно-патогенной микрофлоры сочетается с повышенным содержанием ТБК-продуктов в копрофильтратах, что может свидетельствовать о повышенной агрессивности местной среды и являться дополнительным диагностическим тестом.

Экспериментально обоснованы пути коррекции дисбактериоза кишечника и

нарушений антиоксидантной защиты организма кисломолочным продуктом «Наринэ».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. При экспериментальном дисбактериозе, обусловленном применением антибиотика широкого спектра действия - гентамицина, происходят изменения в составе микрофлоры кишечника, выражающиеся в изменении состава эшерихий и увеличении содержания условно-патогенных микроорганизмов, при умеренном снижении численности нормальных эубионтов.

2. При экспериментальном дисбактериозе, обусловленном применением гентамицина, развивается дисбаланс всех звеньев АОЗ. Выявляется связь между состоянием антиоксидантной защиты макроорганизма, содержанием ТБК-активных продуктов в копрофильтратах и характером микрофлоры в динамике дисбактериоза.

3. Кисломолочный продукт функционального питания «Наринэ» можно расценивать как препарат профилактического действия. Использование «Наринэ» одновременно с применением антибиотика предотвращает изменения состава микрофлоры, способствует стабилизации окислительно-восстановительного гомеостаза макроорганизма.

Теоретическая и практическая значимость. В теоретическом плане работа расширяет представления о механизмах развития дисбактериоза, обусловленного применением антибиотика широкого спектра действия. Работа выполнена в рамках договора № 034/201/003 (2001-2005г.г.) в соответствии с планом научно-исследовательских работ Рост НИИМП по теме «Отношение паразит-хозяин в биотопах кишечника при лекарственном дисбактериозе». Материалы диссертационной работы представлены в медицинской технологии «Диагностика местных метаболических и иммунологических нарушений при дисбактериозе», утвержденной Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития (2006). Полученные результаты позволили обосновать новые подходы к диагностике и профилактике дисбактериоза кишечника и использованы в аналитическом обзоре «Новые подходы к коррекции и профилактике дисбактериозов» (2004), получившем положительную оценку Департамента организации медицинской помощи населению и профилактики неинфекционных заболеваний Минздрава России и рекомендованном для использования практическими врачами. Результаты экспериментальной работы используются в лекционном курсе по дисбактериозу кишечника на факультете усовершенствования врачей в Рост ГМУ.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на Международной конференции «Пробиотики, пребиотики, симбиотики и функциональные продукты питания: Современное состояние и перспективы» (Москва, 2004), 69-ой итоговой научной сессии КГМУ (Курск, 2004), 4-ой межвузовской международной биохимической научно-практической конференции «Обмен веществ при адаптации и повреждении» Рост ГМУ (Ростов-на-Дону, 2005), Всероссийской научной конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня основания филиала «Иммунопрепарат» ФГУП НПО «Микроген» МЗ и СР РФ (Уфа, 2005), 71-ой итоговой научной конференции сотрудников КГМУ и Центрально-Черноземного научного Центра РАМН (Курск, 2006), 1-ой научно-практической конференции по рациональному и лечебному питанию Южного Федерального Округа «Теоретические основы рационального и лечебного питания» РостГМУ и МЗРО (Ростов-на-Дону, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных публикаций, в том числе в изданиях, рекомендованных ВАК – 2, личный вклад 80%, 0,6 п.л. Получен патент на изобретение «Питательная среда для выделения лактобактерий» № 2202609 от 20.04.2003 г.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 171 отечественных и 37 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 23 таблицами и 10 рисунками.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы, объем и методы исследования. Модель экспериментального лекарственного дисбактериоза (Кашкин К.П., Караев З.О., 1984) воспроизводили на белых беспородных мышах, полученных из питомника ФГУН «РостовНИИМП» Роспотребнадзора. В работе были задействованы половозрелые особи (самцы) весом 16-18 г в количестве 400 штук.

Проведено 4 серии экспериментов в осенний и весенний периоды, что обусловлено высокой чувствительностью организма мышей к сезонным колебаниям. В работе исследовали полостную и мукозную микрофлору кишечника, эритроциты, плазму, колоноциты и копрофильтраты мышей.

Все исследования проводили в динамике лекарственного дисбактериоза на 3, 10, 17, 24, 30 сутки после окончания введения антибиотика.

Биологические методы. Для воспроизведения экспериментального дисбактериоза мышам вводили в терапевтической дозе (в объеме 0,2 мл) внутрибрюшинно антибиотик широкого спектра действия (гентамицин) в течение 5 дней.

Эритроциты получали из крови, стабилизированной гепарином (10 ед./мл), отделяя от лейкоцитов и тромбоцитов в 3% желатиновом растворе с последующим центрифугированием (при 320 g в течение 15 мин). После отделения плазмы и верхнего слоя клеток, эритроциты отмывали физиологическим раствором. Для определения активности ферментов использовали 20% гемолизат, приготовленный на бидистиллированной воде.

Колоноциты выделяли из участка толстого кишечника (длиной 5 см), который трижды промывали стерильным физиологическим раствором. Выделенные с внутренней поверхности кишечника колоноциты вносили в фосфатно-буферный раствор (рН=7,2), подсчитывали в камере Горяева и доводили их концентрацию до 1×10⁶ /мл. Все дальнейшие расчеты производили в пересчете на мг белка.

Копрофильтраты готовили в соответствии с методическими рекомендациями «Применение сигнального способа диагностики острой дизентерии по определению количества лизоцима в копрофильтратах» (Оренбург, 1979).

Микробиологические методы. Состав полостной микрофлоры кишечника изучали в соответствии с методическими рекомендациями «Бактериологическая диагностика дисбактериоза кишечника» (Москва, 1991). Подсчет колоний микроорганизмов производили в натуральных числах, умноженных на 10 в степени, равной разведению бактериологического материала, с последующим традиционно принятым выражением их через десятичный логарифм.

Для исследования состава мукозной микрофлоры лоскут кишечника длиной 5-6 см трижды промывали фосфатно-буферным раствором (рН=7,2). Гомогенизированный в ступке с кварцевым песком отрезок кишечника переносили в стерильный физиологический раствор (рН=7,2). Характер микрофлоры определяли по той же методике (Москва, 1991).

Выделенные чистые культуры идентифицировали по морфологическим, тинкториальным, биохимическим, культуральным свойствам в соответствии с рекомендациями «Краткий определитель бактерий Берги» (1980).

Биохимические методы.Состояние системы АОЗ эритроцитов, колоноцитов и копрофильтратов экспериментальных животных оценивали по активности ферментов различных линий защиты.

Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли по методу Misra H.P. и Fridovich I. (1972) в модификации кафедры общей и клинической биохимии №1 Ростовского государственного медицинского университета (Саркисян О.Г., 2000). Метод основан на определении степени ингибирования восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) в присутствии супероксидного анион-радикала, генерируемого в реакции окисления адреналина в адренохром в щелочной среде. Активность фермента эритроцитов выражали в усл. ед./г Hb/час, колоноцитов - в усл. ед./мг белка/час.

Активность каталазы определяли по методу Королюк М.А. с соавт. (1988), основанному на способности пероксида водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс, интенсивность которого определяли на ФЭК при длине волны 410 нм. Активность фермента эритроцитов выражали в мКатал/г Hb/час, колоноцитов - в мКатал/мг белка/час.

Содержание восстановленного глутатиона (GSH) определяли по методу, предложенному Ellman G.L. (1959), основанном на реакции 5,5-дитиобис(2-нитробензойной) кислоты с восстановленным глутатионом, в результате которой образуется окрашенное соединение с максимумом поглощения при длине волны 412 нм. Концентрацию восстановленного глутатиона в эритроцитах выражали в мкмоль/г Hb, в колоноцитах – в мкмоль/мг белка.

Активность глутатионпероксидазы(ГПО) определяли по скорости окисления восстановленного глутатиона в присутствии гидроперекиси третичного бутила по методу Моина В.М. (1986). Определение проводили при 37⁰ С. Инкубационная среда включала 0,1 М трис-HCl буфер (рН=8,5), 5,2 ммоль этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) (для связывания ионов переменной валентности, ускоряющих разложение трет-бутила), 10,4 ммоль азида натрия (ингибитор каталазы), 4,2 ммоль восстановленного глутатиона и 1,4 ммоль гидроперекиси трет-бутила. Использование гидроперекиси трет-бутила в качестве субстрата позволяет определять глутатионпероксидазную активность, включающую липопероксидазную активность глутатион-S-трансфераз (Ланкин В.В., 1981). Реакцию останавливали добавлением 10 % раствора ТХУ. Концентрацию восстановленного глутатиона определяли спектрофотометрически при длине волны 412 нм до и после инкубации. В основе развития цветной реакции лежит взаимодействие SH-группы глутатиона с 5,5-дитиобис (2-нитробензойной) кислотой с образованием окрашенного продукта – тионитрофенильного аниона (Торчинский Ю.М., 1976; Торчинский Ю.М., 1977). Активность фермента эритроцитов выражали в мкмоль/г Hb/час, колоноцитов - в мкмоль/мг белка/час.

Активность глутатионредуктазы (ГР) определяли по скорости окисления НАДФН+Н методом Юсуповой Л.Б. (1989). Инкубационная среда состояла из 0,04 М Na,K – фосфатного буфера, 0,05 М KCl, 4 мМ ЭДТА, 0,3 мМ окисленного глутатиона и 0,08 мМ НАДФН+Н. Реакцию проводили при 37^º в течение 10 минут и регистрировали уменьшение поглощения НАДФН+Н при 340 нм. Активность фермента эритроцитов выражали в мкмоль/г Hb/мин, колоноцитов - в мкмоль/мг белка/мин.

В плазме крови, колоноцитах и копрофильтратах мышей определяли ТБК-активные продукты по концентрации вторичного перекисного метаболита - малонового диальдегида (МДА), как показателя свидетельствующего о возможном повреждении клеточных мембран.

Метод определения содержания МДА основан на том, что при нагревании в кислой среде, часть продуктов ПОЛ, относящихся к классу эндоперекисей, разлагаются с образованием МДА, молекула которого взаимодействует с 2 молекулами тиобарбитуровой кислоты (ТБК) с образованием окрашенного триметинового комплекса (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1977). Пробы фотометрировали при длине волны 535 нм. Содержание МДА выражали в нмоль/мг белка.

Содержание общего белка определяли по методу Lowry C. с соавторами (1953). Метод основан на образовании комплекса, который дает характерную синюю окраску, пропорциональную количеству белка. Интенсивность окраски измеряли на ФЭК при длине волны 750 нм. Результаты выражали в мг/мл гомогената.

Содержание гемоглобина (Hb) определяли по методу, описанному Лугановой И.С., Блиновым М.Н. (1975), при длине волны 540 нм на ФЭК в аммиачном растворе, концентрацию Hb выражали в г/л.

Статистические методы.Статистическую обработку данных проводили с помощью компьютерной программы STATISTICA (Statsoft). Достоверность различий между исследуемыми группами определяли с помощью t-критерия Стьюдента после проверки распределения на нормальность. Статистически достоверными считали отличия, соответствующие величине ошибки Р<0,05.

В разделе автореферата «Результаты исследования и их обсуждение» приводятся только статистически достоверные отличия.