Главная страница
Навигация по странице:

  • Работа 108. Определение скорости пероксидного окисления липидов в биомембранах

  • практикум строев. Практикум по биологической химии, изданный в 1986 году, подвергся существенной переработке, а также дополнен новыми лабораторными работами в разделах белки, липиды,


    Скачать 1.74 Mb.
    НазваниеПрактикум по биологической химии, изданный в 1986 году, подвергся существенной переработке, а также дополнен новыми лабораторными работами в разделах белки, липиды,
    Анкорпрактикум строев.docx
    Дата18.05.2017
    Размер1.74 Mb.
    Формат файлаdocx
    Имя файлапрактикум строев.docx
    ТипПрактикум
    #7805
    страница36 из 39
    1   ...   31   32   33   34   35   36   37   38   39

    А100


    ————— .

    х
    Оформление работы. Провести необходимые расчеты и сделать вывод о причинах спонтанного гемолиза, а также о действии изучаемых прооксидантов и антиоксидантов.

    Практическое значение работы. По степени гемолиза эритроцитов можно судить о состоянии антиокислительных систем клетки, в частности, об обеспеченности организма витамином Е. При нормальной обеспеченности спонтанный гемолиз, как правило, составляет 2-10%. Недостаток витамина Е резко повышает этот показатель. Имеется соответствие между спонтанным или индуцированным гемолизом и содержанием токоферолов в сыворотке крови. Способность витамина D2 ускорять пероксидное окисление липидов в мембранах эритроцитов и других клеток свидетельствует о его прооксидантных свойствах.

    Работа 108. Определение скорости пероксидного окисления

    липидов в биомембранах
    Реактивы. Трис-HCl буфер, 0,04 М раствор с рН 7,4*; соль Мора – Fe(NH4)2(SO4)2, 4·10-5 М свежеприготовленный раствор; трихлоруксусная кислота, 40%-ный раствор; тиобарбитуровая кислота, 0,8%-ный свежеприготовленный раствор; оксалат натрия, 1,34%-ный раствор; хлорид натрия, 0,9%-ный раствор; хлорид калия, 1,2%-ный раствор.

    Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1; 1 и 5 мл; пастеровские пипетки; резиновая груша; водяная баня с термометром или водяная баня аппарата Варбурга; аптечные весы с разновесами; спектрофотометр или ФЭК типа КФК-2.
    Материал.

    1. Кровь, взятая в смеси с раствором оксалата натря в соотношении 10:1 (по объему).

    2. Печень свежезабитого животного.


    а. Определение скорости пероксидного окисления липидов в мембранах эритроцитов. Метод основан на определении содержания конечного продукта пероксидного окисления липидов – малонового диальдегида, который при взаимодействии с тиобарбитуровой кислотой образует окрашенный в розовый цвет триметиновый комплекс, имеющий максимум поглощения при 530-532 нм:
    Окраска раствора пропорциональна концентрации малонового диальдегида. Молярный коэффициент экстинкции 1,56·10-5л·моль-1·см-1.

    Ход определения. Оксалатную кровь центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин, осаждая эритроциты. Верхний слой отсасывают, а осадок эритроцитов трижды промывают раствором хлорида натрия и переосаждают при том же режиме центрифугирования.

    Отбирают 0,5 мл осадка эритроцитов в чистую центрифужную пробирку, приливают равный объем дистиллированной воды и оставляют стоять 30 мин для полного гемолиза.

    Пробу центрифугируют 30 мин при 3000 об/мин, осторожно отсасывают пастеровской пипеткой надосадочную жидкость с серой прослойкой мембран эритроцитов и переносят в другую пробирку.

    Берут три чистые пробирки. В первую опытную вносят по 0,3 мл растворов соли Мора, трис-буфера, аскорбиновой кислоты и 0,1 мл полученной взвеси мембран эритроцитов. Во вторую опытную приливают 0,3 мл трис-буфера, 0,1 мл взвеси мембран эритроцитов и 0,6 мл дистиллированной воды. В третью (контроль) добавляют те же реактивы, что и в первую пробирку, после чего сразу приливают 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты.

    Все пробирки помещают в водяную баню (или в баню аппарата Варбурга) и инкубируют пробы 20 мин при 37˚С. Реакцию в опытных пробах останавливают, добавляя в обе пробирки по 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты.

    Все пробы центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин. Сливают надосадочную жидкость (ее объем 2 мл) в три другие пробирки, прибавляют по 1 мл раствора тиобарбитуровой кислоты и помещают пробы на 10 мин в кипящую водяную баню. Затем пробирки охлаждают в ледяной воде.

    Измеряют экстинкцию полученных проб против контроля на спектрофотометре при 532 нм или на ФЭКе (светофильтр зеленый) в кювете с толщиной слоя 1 см.

    Расчет по формулам
    Е13∙6 Е23∙6

    х1 = ———— и х2 = ———— ,

    0,156 0,156
    где х1 – скорость образования в пробе малонового диальдегида в присутствии прооксидантов (индуцированное пероксидное окисление липидов), нмоль∙ч-1;

    х2 – скорость образования в пробе малонового диальдегида в отсутствие прооксидантов (спонтанное пероксидное окисление липидов), нмоль∙ч-1;

    3 – объем пробы, мл;

    6 – коэффициент пересчета на 1 час;

    0,156 – экстинкция 1 нмоля при 532 нм;

    Е1 и Е2– экстинкции соответственно первой и второй проб против контроля.

    б. Определение скорости пероксидного окисления липидов в гомогенатах тканей. Принцип метода описан выше.

    Ход определения. Навеску 0,5 г печени гомогенизируют в 19,5 мл охлажденного до 0-4˚С раствора хлорида калия, поместив стакан гомогенизатора в лед или снег. Полученный гомогенат сливают в пробирку.

    В одну пробирку наливают 2,0 мл гомогената и 0,2 мл дистиллированной воды, во вторую – 2 мл гомогената и по 0,1 мл растворов аскорбиновой кислоты и соли Мора, в третью – те же вещества, что и во вторую, и, кроме того, добавляют 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты.

    Все пробирки помещают на 10 мин в водяную баню при 37˚С, после чего прибавляют в первые две пробирки по 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Далее все пробы центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин.

    По 2 мл надосадочной жидкости отбирают в три чистые пробирки, приливают по 1 мл раствора тиобарбитуровой кислоты и помещают пробы в кипящую водяную баню на 10 мин. После этого их охлаждают в ледяной воде до комнатной температуры.

    Измеряют экстинкцию всех проб против контрольного раствора (2 мл раствора хлорида калия, 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты и 1 мл раствора тиобарбитуровой кислоты, выдерживают 10 мин на кипящей водяной бане и охлаждают в ледяной воде до комнатной температуры) на спектрофотометре при 532 нм или ФЭКе (светофильтр зеленый) в кювете с толщиной слоя 1 см.

    Расчет проводят по формулам:
    Е12)3∙3,2∙6 Е33∙3,2

    х12)= —————— и х3 = —————— ,

    0,156∙2 0,156∙2
    где х1 – скорость спонтанного пероксидного окисления липидов в гомогенатах, измеряющаяся в наномолях образовавшегося малонового диальдегида в пробе за час инкубации;

    х2 – скорость аскорбат-зависимого неферментативного пероксидного окисления липидов в наномолях образовавшегося малонового диальдегида в пробе за час инкубации;

    х3 – содержание малонового диальдегида в исходном гомогенате, нмоль;

    Е1, Е2 и Е3экстинкции соответственно первой, второй и третьей проб;

    3,2 – общий объем исследуемых проб, мл;

    2 – объем надосадочной ждкости, взятой на определение малонового диальдегида, мл;

    3 – объем проб, взятых на фотометрию, мл;

    0,156 – экстинкция 1 нмоль малонового диальдегида в 1 мл при 532 нм;

    Оформление работы. Рассчитать полученные результаты, дать сравнительную характеристику скорости спонтанного и индуцированного пероксидного окисления липидов, сделать вывод о возможности использования метода для оценки скорости пероксидного окисления липидов и его применимости на практике.

    Практическое значение работы. Методы определения скорости пероксидного окисления липидов биомембран важны для оценки действия на эту систему природных веществ и ксенобиотиков, среди которых могут быть как прооксиданты, так и антиоксиданты. Эти исследования дают возможность практически использовать выявленный эффект различных соединений, в том числе лекарственных средств.

    Увеличение скорости пероксидного окисления липидов возможно при старении, гиповитаминозе Е, дефиците селена, действии ионизирующего облучения, гипербарической оксигенации (действии кислорода под повышенным давлением), при некоторых заболеваниях и патологических состояниях (сердечно-сосудистых заболеваниях, гипоксии, отравлении четыреххлористым углеродом, гипервитаминозах А и D и т.д.).

    Гемоглобин и кислород, содержащиеся в эритроцитах, ускоряют пероксидное окисление липидов, что вызывает повреждение мембран эритроцитов и их гемолиз. Защита эритроцитарных мембран осуществляется системой антиоксидантов: токоферолами, имеющимися в мембранах и плазме крови, глутатионпероксидазой, обезвреживающей гидропероксиды липидов, и альбумином плазмы, который связывает пероксиды липидов.

    При недостаточности антиоксидантной системы развиваются гемолитические состояния, которые часто провоцируются некоторыми пищевыми факторами и лекарственными средствами.


    1   ...   31   32   33   34   35   36   37   38   39


    написать администратору сайта