ЛЕКЦИЯ иммунохимические методы. Применение иммунохимических методов в анализе наркотических средств и психотропных веществ
 Скачать 5.06 Mb.
|
ПРИМЕНЕНИЕ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ В АНАЛИЗЕ НАРКОТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ И ПСИХОТРОПНЫХ ВЕЩЕСТВПРИНЦИП ИММУНОАНАЛИЗАПРИМЕНЕНИЕ РЕАКЦИИ АНТИГЕНА С АНТИТЕЛОМ
ОДНОГО ИЗ ЭТИХ РЕАГЕНТОВ + = АНТИГЕНАНТИГЕН – вещество, способное вызывать биосинтез специфических антител (высокомолекулярные вещества-белки, полисахариды и т.д.).
АНТИГЕННОСТЬ – способность образовывать комплексы с антителами АНТИГЕННАЯ ДЕТЕРМИНАНТА (ЦЕНТР)- функциональные группы на поверхности антигена АНТИТЕЛААНТИТЕЛА – специфические антитела крови (иммуноглобулины).
МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ – полученные с помощью гибридом и гомогенные по специфичности и физико-химическим свойствам. ГАПТЕНГАПТЕН - низкомолекулярные вещества, не способные вызывать образование антител, но после коньюгирования с высокомолекулярными носителями, приобретающие иммуногенные свойства. Основные факторы, принимаемые во внимание при классификации методов1 .Основа метода 2.Стандартные препараты и матрикс 3.Характеристики используемых антител 4.Система разделения 5.Тип применяемой метки 6.Тип реакции и система детектирования Основа метода1. Конкурентное связывание: при этом достаточно одной антигенной детерминанты на определяемом веществе, анализ выполняется в условиях ограниченных количеств реагента 2. Неконкурентное связывание: на определяемом веществе должно быть две неперекрывающиеся антигенные детерминанты, анализ выполняется в условиях избытка реагента 3. Неравновесный режим: используется одна антигенная детерминанта и строго контролируемый избыток реагента. Стандартные препараты1. Применяются в качестве антигенов на твердой фазе 2. Для получения антител 3. Для определения выделенных гаптенов Характеристики используемых антител1. Поли" или моноклональные антитела 2. Различного типа (Jg G или Jg М) и подтипа (Jg G1 или Jg G 2a) 3. Моно- или поливалентные 4. Моно- или биспецифические 5. Нативные или полученные химическим или генно-инженерным путем 6. Антиаллотипические или антиидиотипические антитела 7. Меченные или связанные с твердым носителем Структурный фрагмент антител СИСТЕМА РАЗДЕЛЕНИЯТРУБКИ (СТЕКЛО,ПОЛИПРОПИЛЕН,ПОЛИСТИРОЛ) ГРАНУЛЫ (АКТИВИРОВАННЫЙ ПОЛИСТИРОЛ) ЧАСТИЦЫ (ПОЛИАКРИЛАМИД,ЦЕЛЛЮЛОЗА) ДИПСТИКИ (ПОЛИСТИРОЛ) ЭЛЕКТРОДЫ (ПЛАТИНОВЫЕ,УГЛЕРОДНЫЕ) ПЛЕНКИ ИЛИ ВОЛОКНА (КВАРЦЕВЫЕ,СТЕКЛЯННЫЕ) ТИП ПРИМЕНЯЕМОЙ МЕТКИЧАСТИЦЫ (ЭРИТРОЦИТЫ, ЛАТЕКС) ЗОЛИ МЕТАЛЛОВ (КОЛЛОИДНОЕ ЗОЛОТО) РАДИОНУКЛЕИДЫ (ИОД-125) ФЕРМЕНТЫ,СУБСТРАТЫ,КОФАКТОРЫ(ПЕРОКСИДАЗА ХРЕНА, ОКСИДАЗЫ) ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ ЛЮМИНОФОРЫ (ЭФИРЫ АКРИДИНА, ФЛУОРЕСЦЕИН) ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА (ДИМЕТИЛАМИНОМЕТИЛФЕРРОЦЕН) ПО ТЕХНИКЕ ВЫПОЛНЕНИЯЖИДКОФАЗНЫЕ И ТВЕРДОФАЗНЫЕ РУЧНЫЕ, ПОЛУАВТОМАТИЧЕСКИЕ ИЛИ АВТОМАТИЧЕСКИЕ С ЭКСТРАКЦИЕЙ ИЛИ БЕЗ НЕЕ Классификация иммунохимических методов анализа по способу детекцииМетод Способ детектирования Радиоиммунный анализ (РИА) Радиоактивность Иммуноферментный анализ (ИФА) Ферментная активность Поляризационный флуороиммуноанализ Интенсивность поляризованной (ПФИА) флуоресценции Люминесцентный иммуноанализ (ЛИА) Интенсивность люминесценции Спин-иммунологический анализ (СИА) Электронный спин-рсзонанс свободных радикалов Вироиммуноанализ (ВИА) Цитолиз бактериофагов Металлоиммуноанализ (МИА) Атомарные спектры поглощения Иммуноанализ с помощью частиц Турбодиаметрия и иммунодиффузия (ИД) Нефелометрические иммунометоды Преломление света Иммуносенсорные методы Электрический сигнал Иммунохимические методы, используемые во внелабораторных условияхИммунохроматографические методы (ИХА) ПРИНЦИП ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗАЗона С Зона Т Зона старта АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДА ИХАДОСТОИНСТВА
ВЫСОКАЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ (на осн. гр. 300-500 НГ/МЛ) ОПРЕДЕЛЯЮТСЯ ОСНОВНЫЕ ГРУППЫ НАРКОТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ (КРОМЕ ЛСД) И ПСИХОТРОПНЫХ ВЕЩЕСТВ. ПРОСТ И БЫСТР В ИСПОЛЬЗОВАНИИ НЕ ТРЕБУЕТ ТОЧНОГО ДОЗИРОВАНИЯ ПРОБ И РЕАГЕНТОВ И ИСПОЛЬЗУЮТСЯ ИХ МАЛЫЕ КОЛИЧЕСТВА РЕАГЕНТЫ СТАБИЛЬНЫ В ТЕЧЕНИЕ 1,5 ЛЕТ ПРОСТОТА В ИНТЕРПРЕТАЦИИ РЕЗУЛЬТАТА НЕДОСТАТКИ НИЗКАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ВЕДЕТ К УВЕЛИЧЕНИЮ ЛОЖНОПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ НИЗКОЕ КАЧЕСТВО ТЕСТОВ ГРУППОВОЙ АНАЛИЗ ВЫСОКАЯ ВЕРОЯТНОСТЬ ФАЛЬСИФИКАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ Drug Clean Inc. 409 N PCH # 411 Redondo Beach, Ca. 90277 sales.drugclean.com СПАСИТЕЛЬНЫЙ КРУГ Drug Clean Inc. 409 N PCH # 411 Redondo Beach, Ca. 90277 sales.drugclean.com СПАСИТЕЛЬНЫЙ КРУГ Clear Choice, Добавка к моче. Стоимость 30 долларов US. ОПИСАНИЕ: Эффективный способ фальсификации результатов исследования мочи. Разработан для случаев возможного внезапного тестирования. Этот продукт не содержит «нитратов», на которые обычно проводится проверка образцов в лаборатории. Этот тест «нейтрализует» ВСЕ токсины в моче, включая опиаты. Для этого достаточно добавить препарат в образец. Продукт не изменяет рН и температуру мочи. Drug Clean Inc. 409 N PCH # 411 Redondo Beach, Ca. 90277 sales.drugclean.com СПАСИТЕЛЬНЫЙ КРУГ Clear Choice, Растворимый газированный напиток. Стоимость 25 долларов US ОПИСАНИЕ: Эффективен в течение 5 часов! Содержит комплекс витаминов группы Б и креатинин. Достаточно добавить воды. Инструментальные иммунохимические методыИммуноферментный метод анализа (ИФА) гомогенный вариант гетерогенный вариант Поляризационный флуороиммуноанализ (ПФИА) ГОМОГЕННЫЙ ПФИАЭтапы проведения анализа НА ТДХ - АНАЛИЗАТОРЕ ФИРМЫ "АВВОТТ" 1. ВНЕСЕНИЕ ОБРАЗЦОВ, КАЛИБРАТОРОВ В КАТРИДЖИ КАРУСЕЛИ +70-200 мкл 2. ЗАГРУЗКА НАБОРА-РЕАГЕНТА Состав набора: 1) W - промывочный реагент 2) S - раствор антисыворотки 3) Т - раствор метки - антигена, меченого флуорсспеином 4) Р - подготовительный реагент 3. ИНКУБАЦИЯ И ИЗМЕРЕНИЕ 4 ВЕЩЕСТВО КОНЦЕНТРАЦИЯ «Сut – off» наборы ф. "Аbbоtt" наборы ММА АМФЕТАМИН - КЛАСС 500 НГ/МЛ 1000 НГ/МЛ АМФЕТАМИН / МЕТАМФЕТ. 300 300 БАРБИТУРАТЫ 200 500 БЕНЗОДИАЗЕПИНЫ 200 500 ДИАЗЕПАМ —— 300 КАННАБИНОИДЫ 25 75 КОКАИНА МЕТАБ. 300 300 МЕТАДОН 250 300 ОПИАТЫ 200 300 ФЕНЦИКЛИДИН 75 100 ЭФЕДРИН — 500 Принцип поляризационного флуороиммуноанализа ПОТЕРЯ ИЗБЫТОЧНОЙ ЭНЕГИИ ПРОИСХОДИТБез излучения, за счет соударений или выделения тепла Путем излучения (флуоресценция) Через промежуточное триплетное состояние (фосфоресценция) Степень поляризации зависит от многих факторов и описывается уравнением Перрена: 1 /Р = 1 / Р0 + [ 1 / P0 – 1 / 3 ] x [ RT / V] x t / n где Р - наблюдаемая поляризация, Р0 - максимальная поляризация, R - газовая постоянная, T - абсолютная температура, t - среднее время жизни молекулы в возбужденном состоянии, V - молекулярный объем флуоресцирующего вещества, n - вязкость растворителя. Принцип поляризационного флуороиммуноанализа. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ КАЛИБРОВОЧНАЯ ЗАВИСИМОСТЬ В КОНКУРЕНТНОМ ПФИА АНАЛИЗЕОбразец № 8 содержит опиаты выше установленного предела обнаружения Образец № 10 образец содержит опиаты ниже установленного предела обнаружения 8 718.65 >=Т 106.50 406.16 10 252.30>=Т 131.39 478.60 Исследование биообъекта методом поляризационного флуороиммуноанализа Общее число TDxFLxСхема приобретения1. Покупка прибора и реагентов 2.Установка прибора «под реагенты» на сумму 10 тыс. долларов в год Бочкова Наталья Александровна (095)_723-30-61 моб. (095) 258-42-70 тел., (095)258-42-71 факс - офис Наш импортер: «Сервис Инструмент Плюс» (095) 921-38-67 тел,/факс ПФИА технология Поляризационный флуоресцентный иммуноанализтехнология ПФИА используется на анализаторах TDx и AxSym 95% Confidence Limits
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДА ПФИАДОСТОИНСТВА
ОТСУТСТВИЕ СТАДИИ ПРОБОПОДГОТОВКИ И КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ МЕНЬШАЯ ПОДВЕРЖЕННОСТЬ ВЛИЯНИЮ ТЕМПЕРАТУРЫ И рН СРЕДЫ ВЫСОКАЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ (300-500 НГ/МЛ) СЕРИЙНОСТЬ И ЭКСПРЕССНОСТЬ АНАИЗА СТАБИЛЬНОСТЬ РЕАГЕНТОВ В ТЕЧЕНИЕ ГОДА НЕДОСТАТКИ СТОИМОСТЬ РЕАГЕНТОВ ВОЗМОЖНОСТЬ ЛОЖНОПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ ГРУППОВОЙ АНАЛИЗ Иммуноферментный метод анализаПринцип действия гомогенного иммуноферментного метода анализаS P антиген антитело ферментная метка S P Взаимодействие ферментной метки с субстратом ПРИНЦИП ГЕТЕРОГЕННОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО МЕТОДА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АНТИВИДОВЫХ АНТИТЕЛ, МЕЧЕНЫХ ФЕРМЕНТОМ1 ПОДЛОЖКА,НА КОТОРУЮ НАНЕСЕН ГАПТЕН 2АНТИТЕЛА АНТИВИДОВЫЕ АНТИТЕЛА ФЕРМЕНТ Пероксидаза Хрена S-субстрат (ОФД) Р-измененный субстрат ПРИНЦИП ГЕТЕРОГЕННОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО МЕТОДА АНАЛИЗАS P 1 2 4 3 1-АНТИГЕН 2-АНТИТЕЛО С ПРИШИТОЙ ФЕРМЕНТНОЙ МЕТКОЙ 3 4-СУБСТРАТ ПРИНЦИП ГЕТЕРОГЕННОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО МЕТОДА АНАЛИЗА ПРИ КОНКУРЕНЦИИ И БЕЗ НЕЕ Результат исследованияАНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДА ИФАДОСТОИНСТВА
СТАБИЛЬНОСТЬ РЕАГЕНТОВ В ТЕЧЕНИЕ ГОДА ВЫСОКАЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ
ГОМОГЕННЫЙ ВАРИАНТ ДО 300-500 НГ/МЛ ВОЗМОЖНОСТЬ ЛОЖНОПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ ГРУППОВОЙ АНАЛИЗ ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ, КАК ПРИ ХРАНЕНИИ РЕАГЕНТОВ, ТАК И НА ПРОТЕКАНИЕ ПРОЦЕССОВ ПРИ АНАЛИЗЕ ВЛИЯНИЕ Рн СРЕДЫ НЕПРЕРЫВНОСТЬ СТАДИЙ ТРУДНОСТЬ АВТОМАТИЗАЦИИ В ГЕТЕРОНЕННОМ ВАРИАНТЕ ДЛИТЕЛЬНОСТЬ АНАЛИЗА В ГЕТЕРОГЕННОМ ВАРИАНТЕ ИЗМЕНЕНИЕ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ПРИ ВОЗМОЖНОМ ЗАГРЯЗНЕНИИ ВЫСОКИЙ ПРОЦЕНТ СУБЪЕКТИВНЫХ ОШИБОК Отрицательный результат Контрольный образец А. Предварительное исследование иммунохимическими методами Отбор образцов разделение на аликвоты, кодирование гидролиз Положительный результат В. Подтверждающие методы исследования ферментный кислотный Пробоподготовка Твердофазная экстракция Жидкость-жидкостная экстракция Извлечение ТСХ Токси-Лаб ЛТД Опиаты Газожидкостная хроматография Высокоэффективная жидкостная хроматография Хроматомасс-спектрометрия Заключение ОДНА ИЗ ОСНОВНЫХ ПРОБЛЕМ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ НАРКОТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ И ПСИХОТРОПНЫХ ВЕЩЕСТВ ПРАВИЛЬНАЯ ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ЯВЛЯЕТСЯ ЛИ РЕЗУЛЬТАТ ИСТИННЫМ ?! ИНСТИННОПОЛОЖИТЕЛЬНЫМ ИЛИ ИСТИННООТРИЦАТЕЛЬНЫМ УСТАНОВЛЕНИЕ ФАКТА УПОТРЕБЛЕНИЯ НАРКОТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ И ПСИХОТРОПНЫХ ВЕЩЕСТВ В СЛУЧАЯХ:
ПОТРЕБЛЕНИЕ НАРКОТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ И ПСИХОТРОПНЫХ ВЕЩЕСТВ В ОБЩЕСТВЕННЫХ МЕСТА (ст. 20.20. и 20.22. Кодекса об административных правонарушениях) ВЫЯВЛЕНИЕ СОСТОЯНИЯ ОПЬЯНЕНИЯ ИЛИ ИНЫХ СВОЙСТВ И ПРИЗНАКОВ, ИМЕЮЩИХ ЗНАЧЕНИЕ ДЛЯ УГОЛОВНОГО ДЕЛА (ст. 179 Уголовно-процессуального Кодекса РФ) ВЫБОР ОБЪЕКТА ИССЛЕДОВАНИЯ
МОЧА
ОТБОР ОТ СРЕДНИХ ДО БОЛЬШИХ КОЛИЧЕСТВ ОБЪЕКТА СОДЕРЖАНИЕ ВЕЩЕСТВ В СРЕДНИХ И ВЫСОКИХ КОНЦЕНТРАЦИЯХ АНАЛИЗИРУЕМЫЕ СОЕДИНЕНИЯ:
Рекомендованный уровень предела обнаружения (Cut-off) наркотических средств и психотропных веществ методом иммуноанализа
ВЕЛИЧИНА ПРЕДЕЛА ОБНАРУЖЕНИЯ (Cut-off) ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ИССЛЕДОВАНИЙ ИММУНОХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДОМ0 -25 % + 25 % Негатив S1 Cut-off S2 S3 Токсикологич. концентрация Уровень S1 – содержание наркотических средств ниже на 20-25 % гарантированного порога обнаружения иммуноанализом (определен SAMHSA*) S2 - содержание наркотических средств выше на 20-25 % гарантированного порога обнаружения иммуноанализом (определен SAMHSA) S3 - содержание наркотических средств превышает гарантированный порог обнаружения более чем в 3 раза * - United States Substance Abuse and Mental Services Administration (ранее NIDA) ВЕЛИЧИНА ПРЕДЕЛА ОБНАРУЖЕНИЯ (Cut-off) ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ИССЛЕДОВАНИЙ ГХ/МС МЕТОДОМУровень С1- содержание наркотических средств намного ниже предела определения ГХ/МС анализа С2 – содержание наркотических средств ниже на 20-25 % гарантированного порога обнаружения ГХ/МС (определен SAMHSA*) С3 - содержание наркотических средств выше на 20-25 % гарантированного порога обнаружения иммуноанализом (определен SAMHSA) С4 - содержание наркотических средств превышает гарантированный порог обнаружения ГХ/МС более чем в 3 раза * - United States Substance Abuse and Mental Services Administration (ранее NIDA) 0 -60 % -25 % + 25 % Негатив С1 С2 Cut-off С3 С4 Временной интервал обнаружения наркотических средств и психотропных веществ в моче на уровне установленного предела обнаружения (Cut-off)
Соотношение доз приема кодеина к концентрации в плазме и мочеДоза приема, мг Терапевтич. Токсич. Летальная 8 50 60 750 1 Концентрация, мкг/мл в крови в моче 0,01 29 0,03 0,3 8.8 229 0,3 2 34 ПРОВЕДЕНИЕ МЕДИЦИНСКОГО ОСВИДЕТЕЛЬСТВОВАНИЯ НА СОСТОЯНИЕ НАРКОТИЧЕСКОГО ОПЬЯНЕНИЯ В СЛУЧАЯХ: ОТСТРАНЕНИЕ ОТ УПРАВЛЕНИЯ ТРАНСПОРТНЫМ СРЕДСТВОМ (ст. 27.12 Кодекса РФ об административных правонарушениях и Приказ МВД № 297 с дополнениями от 10.09.2001 г.) НЕСЧАСТНЫЕ СЛУЧАИ НА ПРОИЗВОДСТВЕ (ст. 230 Трудового кодекса РФ) ПОЯВЛЕНИЕ НА РАБОТЕ В СОСТОЯНИИ НАРКОТИЧЕСКОГО И ТОКСИЧЕСКОГО ОПЬЯНЕНИЯ (ст. 81 Трудового кодекса РФ) ВЫЯВЛЕНИЕ СОСТОЯНИЯ ОПЬЯНЕНИЯ ИЛИ ИНЫХ СВОЙСТВ И ПРИЗНАКОВ, ИМЕЮЩИХ ЗНАЧЕНИЕ ДЛЯ УГОЛОВНОГО ДЕЛА (ст. 179 Уголовно-процессуального Кодекса РФ) ВЫБОР ОБЪЕКТА ИССЛЕДОВАНИЯПРОВЕДЕНИЕ МЕДИЦИНСКОГО ОСВИДЕТЕЛЬСТВОВАНИЯ НА СОСТОЯНИЕ НАРКОТИЧЕСКОГО ОПЬЯНЕНИЯ
Ограниченное использование при определении фармакокинетических параметров КРОВЬ (СЛЮНА) Корреляция с состоянием Анализируемые вещества:
Определение фармакокинетических параметров при проведении количественного определения веществ Ценность объекта при интерпретации результатов анализа
По данным Steven ST и др. 1998 г. Исследование выборки 2525 смертельных случаев при ДТП, где 32,3 % содержание алкоголя 24,8 % наркотических средств и психотропных веществ 43,9 % совместное присутствие алкоголя и наркотических средств Относительное содержание нативных веществ и метаболитов биологических жидкостях и тканях
ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ОСНОВНЫХ НАРКОТИЧЕСКИХ СРЕДСТВДоза 10 мг героина гидрохлорида Схема химико-токсикологического исследования при медицинском освидетельствовании на состояние наркотического опьянения1 этап
2 этап При положительном результате подтверждение специфичными методами Проведение исследования крови Проведение исследования крови и мочи на наличие наркотических средствв случаях:
Проведение медицинского освидетельствования при уголовных правонарушениях Несчастные случаи на производстве, повлекших за собой тяжелые телесные повреждения и смертельный исход ФОРМИРОВАНИЕ БИООБРАЗЦА ДЛЯ АНАЛИЗАПРОЦЕДУРА АНАЛИЗА ТКАНЕЙ И ОРГАНОВПРОБА ТКАНЕЙ ОРГАНОВ ВОДНЫЙ ЭКСТРАКТ Жидкостная экстракция Энзимный гидролиз Аликвота Твердо-фазная экстракция Аликвота экстракта Скрининг ТСХ Аликвота экстракта Иммуно-химический скрининг Подтверждающие методы ТСХ, ГЖХ, ВЭЖХ Элюат вещества ГХ/МС ЗАКЛЮЧЕНИЕ Дериватизация Позитивный результат Позитивный результат Центрифугирование Энзимный гидролиз и центрифугирование СХЕМА АНАЛИЗА БИООБЪЕКТОВ (ТКАНЕЙ ОРГАНОВ) ИММУНОХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИОБЪЕКТ 5 ГРАММ (печень или почки) ЭКСТРАКЦИЯ 45 МЛ 6 % р-ром ТРИХЛОРУКСУСНОЙ КИСЛОТЫ рН 1,0 ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ 10 МИНУТ ПРИ 6000 ОБ/МИН НЕЙТРАЛИЗАЦИЯ 22 % р-ром Na2CO3 до рН 6,0 -7,0 (4 мл) И ДОВЕДЕНИЕ ОБЪЕМА ДО 50 МЛ ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ АЛИКВОТ МЕТОДАМИ ПФИА, ИФА АНАЛИТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ РАЗРАБОТАННЫХ МЕТОДИКЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ
БАРБИТУРАТЫ 85 НГ/МЛ БЕНЗОДИАЗЕПИНЫ 2 НГ/МЛ ВЕЛИЧИНА ПОРОГОВОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ ОПИАТЫ 20 НГ/МЛ БАРБИТУРАТЫ 250 НГ/МЛ БЕНЗОДИАЗЕПИНЫ 6 НГ/МЛ КОЭФФИЦИЕНТ ВАРИАЦИИ ОПИАТЫ 4,3 % БАРБИТУРАТЫ 7,0 % БЕНЗОДИАЗЕПИНЫ 4,9 % ОТКЛОНЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИЙ ОТ ТЕОРЕТИЧЕСКИХ ЗНАЧЕНИЙ ОПИАТЫ 4,2 % БАРБИТУРАТЫ 4,9 % БЕНЗОДИАЗЕПИНЫ 5,1 % ПРОЦЕНТ АНАЛИТИЧЕСКОГО ОТКРЫТИЯ ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ ЭКСТРАКТОВ ТКАНЕЙ, СОДЕРЖАЩИХ ИЗВЕСТНЫЕ КОЛИЧЕСТВА ВЕЩЕСТВ ИССЛЕДУЕМЫХ ГРУПП ОПИАТЫ 91,2-101,2 % БАРБИТУРАТЫ 90,2-103,6 % БЕНЗОДИАЗЕПИНЫ 91, 5-102,6 % ПЕРЕКРЕСТНОЕ РЕАГИРОВАНИЕ РАЗЛИЧНЫХ СОЕДИНЕНИЙ С НАБОРАМИ РЕАГЕНТОВ ф. «ФАРМАТЕХ» и ф. «ЭББОТТ»
СРАВНЕНИЕ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ И ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ПРИ АНАЛИЗЕ ТРУПНОГО МАТЕРИАЛА НА БЕНЗОДИАЗЕПИНЫ
* - Данные лаборатории судебно-химического отделения городского бюро СМЭ г. Москвы СРАВНЕНИЕ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ И ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ПРИ АНАЛИЗЕ ТРУПНОГО МАТЕРИАЛА НА ОПИАТЫ
* - Данные лаборатории судебно-химического отделения городского бюро СМЭ г. Москвы Расчеты основных величин
*- П - Преобладание положительных результатов в выборке, рассчитанное по результатам исследования выборки хромато-масс-спектрометрией в процентах.
Результаты исследования
Результаты исследования
экстрактов тканей почек Исследование волос иммунохимическими методамиВолосы срезают как можно ближе к коже, предварительно связав (по возможности) в пучок в количестве приблизительно 300 мг. По возможности отмечают проксимальный конец (если длинные) и, завернув фольгу, чтобы устранить внешнее загрязнение, опечатывают и хранят в сухом месте при комнатной температуре до проведения анализа. Таким же образом забирают в качестве объекта и ногти, срезая верхний отросший край. МЕТОДИКА ПРОБОПОДГОТОВКИ ПРОИЗВОДНЫХ КОЖИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ИММУНОХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИДля удаления внешних загрязнений пробы волос и ногтей отмывают трижды порциями по 10 мл смеси, содержащей метанол и 5 М раствор хлороводородной кислоты в соотношении 20:1, встряхивая в течение 2 минут и затем трижды после этого промывают дистиллированной водой порциями по 10 мл. В случае, если необходимо провести обнаружение психоактивных веществ в смывах (метанольная смесь), их маркируют и проводят операции далее аналогично пробам. После отмывки волосы сушат в выпарительных чашках под феном таким образом, чтобы избежать потерь за счет разлета (прикрывая выпарительные чашки мелкой металлической сеткой). Потери в массе при проведении отмывки составляют 30 - 50 % . Затем навеску образцов мелко измельчают ножницами, берут 40 мг и вносят в виалы на 2 мл, добавляют 1,5 мл смеси, содержащей метанол и 5 М раствор хлороводородной кислоты в соотношении 20 : 1 и обрабатывают ультразвуком не менее 1 часа с подогревом до 45 ± 1 0С. После этого центрифугируют 3 минуты при 14000 об./мин и надосадочную жидкость переносят в выпарительные чашки. Образцы промывают 0,5 мл метанола и объединенные метанольные экстракты сгущают приблизительно до 50 мкл и доводят фосфатным буфером рН 7,4 до 200 мкл. Время пробоподготовки одного объекта без учета времени отбора и доставки образца до 90 минут, затраты на большее количество объектов определяются увеличением затрат времени на пипетирование и взвешивание. Установление уровня определяемой концентрацииДЛЯ ПОЛЯРИЗАЦИОННОГО ФЛУОРОИММУНОАНАЛИЗА Обнаружение исследуемой группы психоактивных веществ проводится на уровне установленной пороговой концентрации (Cut-off), т.е. достоверно определяемой концентрации. Количественное определение проводится суммарное (как нативных соединений, так и метаболитов) по отношению к концентрации вещества, используемого в качестве стандартного образца сравнения. Установление значения Cut-off проводится, используя обычную процедуру анализа (построение калибровочного графика). Производят 10 измерений (в дубле) поляризации флуоресценции «отрицательного» контроля (проба, в которой достоверно установлено отсутствие психоактивных веществ). На основании полученных данных вычисляют среднее квадратичное отклонение σ по формуле: где Вi – значение поляризации флуоресценции для «отрицательного» контроля; - средне арифметическое значение поляризации флуоресценции «отрицательного» контроля; Σ - знак суммирования, n-число определений. Значение поляризации флуоресценции «отрицательного» контроля минус три среднеквадратичных отклонения откладывают на оси ординат калибровочного графика, проводят из этой точки прямую до пересечения с калибровочной кривой и перпендикуляр на оси абсцисс, опущенный из точки пересечения определяет значение достоверно определяемой концентрации. Учет результатов исследования иммуноферментным методом Результаты учитываются спектрофотометрически при длине волны 492 нм. Учет результатов осуществляют, исходя из разности величин оптической плотности, выявляемых при исследовании экстрактов волос лиц, злоупотребляющих психоактивными веществами и лиц, не употребляющих психоактивные вещества («отрицательный» контроль), при этом разность величин оптической плотности должна быть не менее 0,1. Оценку диагностических параметров тест-систем, определяющих надежность получаемых результатов, осуществляют по методикам, предложенной ВОЗ и требованиям ГОСТа 51352-99 для наборов реагентов, используемых в клинической лабораторной ВРЕМЕННЫЕ ЗАТРАТЫ НА ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА БИООБЪЕКТОВ |