Программа вступительных экзаменов в аспирантуру направление
 Скачать 0.84 Mb.
|
|
Основные типы нуклеиновых кислот (ДНК и РНК). Природа межнуклеотидных связей. Номенклатура, сокращенные формулы и сокращенные обозначения. Первичная структура нуклеиновых кислот, как последовательность расположения мономерных звеньев в линейной полимерной цепи. Неисчерпаемость числа мыслимых первичных структур нуклеиновых кислот. Основные типы нековалентных взаимодействий в нуклеиновых кислотах: водородные связи; ван-дер-ваальсовы взаимодействия; электростатические взаимодействия. Гидрофобные и гидрофильные группы в нуклеиновых кислотах. Взаимодействия гидрофобных групп в водных растворах (гидрофобные взаимодействия). Межплоскостные взаимодействия между ароматическими структурами (стекинг-взаимодействия). Пространственная структура ДНК и РНК. Комплементарные основания в нуклеиновых кислотах. Комплементарные взаимодействия между участками одной полинуклеотидной цепи и их роль в формировании пространственной структуры однонитевых полинуклеотидов. Электрохимические и спектральные характеристики нуклеиновых кислот и их компонентов. Конформационная лабильность биополимеров и молекулярное узнавание - два главных общих свойства функционально значимых биополимеров, необходимых для их функционирования в живых организмах. Взаимодействие комплементарных последовательностей олиго- или полинуклеотидов, как пример взаимного узнавания структур. Нативное и денатурированное состояния. Потеря способности к специфическим взаимодействиям при денатурации. Обратимость перехода между нативным и денатурированным состояниями. Множественность функционально значимых состояний биополимеров. Денатурация и ренатурация белков. Направленные конформационные переходы в биополимерах при взаимодействии с низкомолекулярными лигандами и их функциональное значение. Роль молекулярного узнавания в функционировании белков. Биологическая роль белков. Белки - ферменты. Общая характеристика ферментов. Принципы ферментативной кинетики. Химия ферментов. Молекулярная асимметрия и прохиральность. Факторы, определяющие специфичность ферментов. Внутримолекулярный катализ. Полифункциональный катализ и простые модели. -Химотрипсин: тетраэдрические интермедиаты; абсолютная конформация связанного субстрата. Другие гидролитические ферменты: РНКаза А; ацетилхолинэстераза. Стереоселективный контроль в реакциях гидролиза. Белки - регуляторы физиологических процессов. Биосинтез гормонов. Механизм действия пептидно-белковых гормонов: взаимодействие гормонов с рецепторами; структура и свойства аденилатциклазной системы. Представители белковых гормонов: инсулин, соматотропин, пролактин, гликопротеиновые гормоны аденогипофиза. Белки - средство защиты организма. Белки иммунной системы: структура и функция антител. Антигены тканевой совместимости. Система комплемента: медиаторы иммунного ответа; интерфероны; лимфокины и монокины; фактор некроза опухолей (TNF). Белки систем свертывания крови и фибринолиза. Двигательная функция белков. Белки мышц и соединительных тканей. Коллаген. Строительная и энергетическая функции белков. Биологическая роль пептидов. Нейропептиды: энкефалины и эндорфины; окситоцин и вазопрессин; адренокортикотропный гормон; меланоцитстимулирующие гормоны; либерины и статины; вещество Р; пептиды-коннекторы; пептиды, действующие на сон; липотропины. Пептидные гормоны: тканевые гормоны; кальцитонин; глюкагон; гормоны желудочно- кишечного тракта. Пептидные токсины: пептиды из бледной поганки; пептидные токсины из яда пчел; нейротоксины из яда змей и скорпионов; пептидные токсины морских беспозвоночных. Пептидные антибиотики: грамицидин S; бацитрацины; полимиксины; актиномицины; эхиномицин. Пептиды - регуляторы иммунитета: циклоспорин А; тафцин; тимические гормоны. Пептиды с вкусовыми качествами: аспартам. Матричный биосинтез биополимеров. Наследственная информация и реализация ее в клетке: репликация, транскрипция и трансляция. Основные компоненты системы матричного биосинтеза: фермент, матрица и набор мономеров. Основные стадии матричного биосинтеза: инициация, элонгация и терминация. Сигналы инициации и терминации. Основные стадии каждого цикла элонгации: отбор мономера, присоединение его к растущей цепи и перемещение программирующей матрицы на одно звено относительно активного центра фермента (транслокация). Программирование первичной структуры белков в первичной структуре информационных РНК (мессенджер РНК или мРНК). Генетический код. Активация аминокислот: тРНК и аминоацил-тРНК-синтетазы. II. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ, ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ, ОЧИСТКИ БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Разделение белков и нуклеиновых кислот центрифугированием. Фракционирование клеточных структур методом центрифугирования. Выделение белков и нуклеиновых кислот в градиенте плотности. Выделение и фракционирование белков методом осаждения. Изоэлектрическое осаждение. Солевое фракционирование белков. Разделение белков с помощью органических растворителей. Осаждение белков органическими полимерами. Хроматографические методы разделения и анализа белков и нуклеиновых кислот. Метод гель-хроматографии. Ионообменная хроматография. Распределительная хроматография. Аффинная хроматография. Разделение белков и нуклеиновых кислот методом гель-электрофореза. III. ХИМИЯ КОФЕРМЕНТОВ Реакции окисления - восстановления. Ферменты, участвующие в окислительно- восстановительных процессах: дегидрогеназы; оксидазы; оксигеназы; пероксидазы и каталазы. NAD + , NADP + . Неферментативная регенерация коферментов и некоторые примеры использования коферментов в органическом синтезе. Химия флавинов. Реакции оксенов. Липоевая кислота. Пируватдегидрогеназный комплекс. Пиридоксальфосфат. Биологическая роль пиридоксальфосфата. Модельные системы. Самоуничтожающиеся инактиваторы ферментов и аффинные метки. Тиамин. Конструирование моделей тиамина. Биотин. Модельные исследования IV. ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ БЕЛКОВ Проблемы пептидного синтеза. Термодинамические аспекты синтеза. Проведение сопряженных термодинамически выгодных процессов - основной путь преодоления термодинамических затруднений при образовании пептидных связей в процессе конденсации аминокислот. Механизмы рацемизации производных аминокислот и пептидов. Способы активации карбоксильной группы в аминокислотах и пептидах. Карбодиимидный метод синтеза пептидов. Метод активированных эфиров для получения пептидов. Метод смешанных ангидридов: хлорангидридный метод синтеза пептидов; метод смешанных ангидридов аминокислот с угольной кислотой; карбоксиангидридный метод синтеза пептидов; азидный метод синтеза пептидов. Защита функциональных групп аминокислот. Требования, предъявляемые синтезом пептидов к защитным группам. Временная и постоянные защиты. Сравнительный анализ по получению пептидов с использованием в качестве временной защиты трет- бутилоксикарбонильной и 9-флуоренилметилоксикарбонильной групп. Общая стратегия выбора защитных групп при синтезе пептидов. Блокирование аминогрупп. Комплекс аминокислот с ионами меди - как одно из решений проблемы селективного введения защитных групп по -аминогруппе лизина. Защитные группы, удаляемые кислотами: группы уретанового типа - карбобензилокси и трет-бутил- оксикарбонильная группы; группы ацильного типа - формильная, о-нитрофенильная и дифенилфосфинамидная группы. Основные способы введения, удаления защитных групп и механизмы соответствующих процессов. Влияние заместителей на скорость отщепления защитных групп уретанового типа. Защитные группы, удаляемые основаниями: трифторацетильная и 9- флуоренилметилоксикарбонильная группы. Основные способы введения, удаления защитных групп и механизмы соответствующих процессов. Защитные группы, удаляемые каталитическим гидрированием: трифторацетильная и карбобензилоксикарбонильная группы. Основные способы введения, удаления защитных групп и механизмы соответствующих процессов. Защитные группы, удаляемые УФ-облучением: карбобензилокси- и о- нитробензилоксикарбонильная группы. Основные способы введения и удаления защитных групп. Механизмы соответствующих процессов. Защита карбоксильной группы. Защитные группы, удаляемые основаниями. Метиловые, этиловые, бензиловые, 9-флуоренилметиловые и 2-п-(толуолсульфо)этиловые эфиры. Основные способы введения и удаления сложноэфирных защитных групп. Присоединение аминокислотного остатка к полимеру как один из вариантов защиты. Требования, предъявляемые к нерастворимому полимеру. Способы присоединения С-концевой аминокислоты к полимерному носителю и снятия синтезированного пептида с полимера. Защитные группы, удаляемые кислотами: трет-бутильная и 2-(адамантил)-пропан-2- иловая группы. Основные способы введения и удаления защитных групп. Механизмы соответствующих процессов. Защитные группы, удаляемые каталитическим гидрированием: бензильные и п- нитробензильные защитные группы. Основные способы введения и удаления защитных групп. Механизмы соответствующих процессов. Защитные группы, удаляемые облучением: 5-бром-7-нитроиндольная защита. Основные способы введения и удаления защитной группы. Механизмы соответствующих процессов. Защита боковых функциональных групп. Основные способы введения и удаления защитных групп, механизмы соответствующих процессов. Защита боковых функциональных групп дикарбоновых аминокислот: бензиловый и трет- бутиловый эфиры. Другие защитные группы: бензилоксикарбонильная, трет- бутилоксикарбонильная, тозильная, трифторацетильная группы. Условия избитательного блокирования карбоксильных групп боковых радикалов. Защита гуанидиновой группы аргинина: -нитрогруппа, тозильная. Защита имидазольного кольца гистидина: трет-бутилокси-карбонильная, N - бензилоксиметильная, N -трет-бутоксиметильная, 2,4-динитрофенильная группы. Защита гидроксильной группы тирозина: бензильная, 2,6-дихлорбензильная, трет- бутильная. Защита гидроксильной группы серина и треонина: бензильная, трет-бутильная. Защита меркаптогруппы цистеина: бензильная, тритильная, ацетамидометильная. Защита индольного фрагмента триптофана: формильная, 2,4,6- триметоксибензолсульфонильная. Защита боковой группы метионина: сульфоксидная. Блокирование амидосодержащих аминокислот - 4-диметоксидифенил метильная защита. Классический синтез пептидов. Примеры синтеза пептидов и белков. Синтез циклопептидов. Твердофазный метод синтеза пептидов (метод Меррифилда) - как модель синтеза белка на рибосомах. Автоматизирование процесса. Требования к реагентам и методам при синтезе биологически активных пептидов. Выбор оптимальной стратегии синтеза. Зависимость степени рацемизации модельного пептида в присутствии нуклеофильных добавок. Жидкофазный способ синтеза пептидов. Синтез гетеродетных пептидов. (S S)-Пептиды. S-Пептиды. Депсипептиды. Ферментативный синтез пептидов и белков. Посттрансляционная модификация белков. V. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ АМИНОКИСЛОТ В ПЕПТИДАХ И БЕЛКАХ Задачи, на решение которых направлено определение первичной структуры пептидов и белков. Корреляция между структурой и биологической активностью белков. Общая стратегия определения первичной структуры белков. Основные этапы определения последовательности аминокислот в белках: выделение белка; получение кислотного гидролизата белка и определение мольного соотношение входящих в него аминокислот; определение молекулярной массы и вычисление количества всех присутствующих аминокислотных остатков; определение количества входящих в молекулу полипептидных цепей; разделение полипептидных цепей и расщепление каждой из них на фрагменты; секвенирование пептидных фрагментов. Метод перекрывающихся блоков и метод неполного гидролиза - основные подходы для восстановления порядка расположения фрагментов в исходной цепи белка. Определение состава белковых олигомеров: получение мономеров и полипептидных цепей. Методы идентификации олигомеров: электрофорез в полиакриламидном геле, гель- фильтрация. Идентификация индивидуальных полипептидных цепей. Определение состава олигомера по молекулярным массам мономеров. Определение числа мономеров в олигомере путем “сшивания” субъединиц бифункциональными реагентами. Фрагментация полипептидной цепи ферментативными методами. Гидролиз протеазами с высокой специфичностью (трипсин, тромбин, протеаза V8, клострипаин и др.). Гидролиз белка протеазами с низкой специфичностью (химотрипсин, термолизин, пепсин, папаин, эластаза и др.). Использование химических методов для изменения специфичности ферментативного гидролиза. Фрагментация полипептидов химическими методами. Частичный кислотный гидролиз. Расщепление связи Asp-Pro. N O-ацильная миграция. Расщепление пептидной связи по остатку триптофана. Окислительное галогенирование. Расщепление с помощью BNPS-скатола. Расщепление по остатку триптофана в системе ДМСО-галогенводородные кислоты. Расщепление по остатку триптофана бромцианом в гептафтормасляной кислоте. Расщепление о-иодозобензойной кислотой. Озонирование. Расщепление пептидной связи по остатку тирозина. Расщепление с помощью N- бромсукцинимида и N-иодосукцинимида Расщепление по остатку цистеина. Цианирование с помощью 2-нитро-5- тиоцианобензойной кислоты. Превращение цистеина в дегидроаланин с последующим расщеплением пептидной связи по -углеродному атому дегидроаланилпептида. Бромциановый метод расщепления по остаткам метионина. Другие методы расщепления пептидных связей. Расщепление связи Asn-Gly гидроксиламином. Расщепление по остатку гистидина под действием N-бромсукцинимида. Превращение серина в дегидроаланин с последующим расщеплением пептидной связи по - углеродному атому дегидроаланилпептида. Расщепление дисульфидных связей. Определение аминокислотного состава. Исчерпывающий гидролиз белков для аминокислотного анализа. Колоночная хроматография аминокислот. Постколоночная и предколоночная модификация. Газожидкостная хроматография аминокислот. Этерификация карбоксильных групп и ацилирование других реакционноспособных групп с целью получения летучих производных аминокислот. Определение триптофана в интактном белке. Методы анализа фосфорилированных аминокислот и -карбокси-глутаминовой кислоты. Определение ацетильной и формильной группы. Анализ остатков амидов дикарбоновых кислот. Идентификация N- и C-концевых аминокислотных остатков. Реагент Сэнгера для определения N-концевой аминокислоты. Дансилирование. Определение С-концевых групп. Селективное введение трития. Гидразинолиз. Селективное восстановление. Определение С- концевых аминокислот в виде альдегидов. Определение С-концевых аминокислот путем алкоголиза оксазолов. Методы анализа аминокислотной последовательности пептидов. Метод Эдмана для секвенирования пептидов. Определение последовательности пептидного фрагмента в ручном варианте. Автоматический анализ аминокислотной последовательности: жидкофазный вариант секвенатора; газофазный вариант секвенатора; твердофазный вариант секвенатора. Методы присоединения пептидов к носителю. Присоединение лизилсодержащих пептидов с помощью п-фенилендиизоцианата. Присоединение пептида по карбоксильной группе с использованием N,N’-замещенных карбодиимидов. Присоединение по лактону гомосерина. Идентификация и локализация цистинсодержащих пептидов. Расщепление дисульфидных связей. Идентификация по известной аминокислотной последовательности. Идентификация дисульфидных связей у белков с неизвестной аминокислотной последовательностью. Применение масс-спектрометрии для определение аминокислотной последовательности пептидов и белков. Особые случаи применения метода. Пептиды с защищенной N-концевой аминогруппой. Определение N-концевой аминокислотной последовательности. Белки, содержащие остатки -карбоксиглутаминовой кислоты. Роль масс-спектрометрии при секвенировании пептидов с модифицированными остатками аминокислот. Установление первичной структуры белков по кодирующей последовательности в ДНК. Скрининг банков генов. Секвенирование кодирующей последовательности. Сопоставление структуры пептидов с кодирующими последовательностями. Анализ посттрансляционного процессинга методом масс-спектроскопии. VI. ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ АМИНОКИСЛОТ И БЕЛКОВ Селективная модификация аминокислотных остатков. Аналитическое применение. Модификация аминогруппы. Взаимодействие с нингидрином. Отличительные особенности первичной и вторичной аминогрупп. Механизм реакции. Взаимодействие нуклеофильных центров белков с реагентом Сэнгера и реагентом Бергмана. Модификация флуоресцирующими реагентами. Модификация групп, содержащих серу. Взаимодействие с п-хлормеркурийбензоатом. Взаимодействие с реагентом Эллмана. Модификация индольного остатка триптофана. Взаимодействие с 2-гидрокси-5- нитробензилбромидом. Модификация гуанидиниевой группы в аргинине. Взаимодействие с -нафтолом. Взаимодействие с п-нитрофенилглиоксалем. Модификация имидазольного остатка в гистидине. Взаимодействие с реагентом Паули. Модификация белков с целью изменения биологической функции. Взаимодействие белков с диэтилпирокарбонатом. Инактивация РНказы А - как следствие модификации остатков гистидина. Взаимодействие белков с циклофосфаном. Использование его в химиотерапии злокачественных опухолей. Модификация функциональных групп белков флуостигмином. Взаимодействие его с ацетилхолинэстеразой. Взаимодействие белков с 2,4-пентадионом. Дискриминация остатков аргинина и лизина на примере модификации фенилаланин-тРНК-синтетазы. Механизмы реакций. Модификация белков с целью структурно-функциональных исследований. Введение метки по остаткам тирозина и лизина. Бифункциональные реагенты. Выбор спейсера, соединяющего реакционноспособные группы бифункционального реагента. Типы реакционноспособных групп. Реагенты на аминогруппы. Реакции с имидоэфирами. Взаимодействие с |