Тема по микробиологии. Микроб тема 2. Простые и сложные методы окраски микроорганизмов. Способы окраски спор, жгутиков, капсул, включений
 Скачать 17.92 Kb.
|
|
Простые методы окраски Простые и сложные методы окраски микроорганизмов. Способы окраски спор, жгутиков, капсул, включений. Для окрашивания препаратов пользуются кислыми, щелочными и нейтральными анилиновыми красителями. Наиболее широкое применение нашли основной и кислый фуксин, метиленовый синий, генцианвиолет и везувин. Простой способ окраски мазков производится водным фуксином Пфейффера и метиленовым синим Леффлера. Готовят водный фуксин из фенолового фуксина Циля, разводя его дистиллированной водой в соотношении 1:10. Состав РАСТВОРА ФУКСИНА ЦИЛЯ: основной фуксин - 1 г; спирт этиловый 96 % - 10 мл; фенол кристаллический - 5 г; глицерин - несколько капель; вода дистиллированная - 100 мл. Метиленовый синий Леффлера готовят, прибавляя к 30 мл насыщенного раствора метиленового синего (10 г метиленового синего в 100 мл 96 % этилового спирта) 1 мл 1% NaOH или KOH и 100 мл дистиллированной воды. После окрашивания красители сливают, препарат промывают водой и высушивают между листками фильтровальной бумаги. На сухой мазок наносят каплю масла и микроскопируют с использованием иммерсионного объектива оптического микроскопа. Способность микробов воспринимать красители называется тинкториальными свойствами. При окраске щелочным метиленовым синим по Леффлеру (3-5 мин) гранулы волютина у дифтерийных коринебактерий приобретают темно-синий, а палочка - голубой цвет. Сложные методы окраскиПри сложных методах окраски мазков применяют два-три различных по цвету красителя, что позволяет дифференцировать микробы и выявить некоторые нюансы в деталях их строения. К таким методам относят окраску по Граму, Цилю-Нельсену, Нейссеру, Бурри-Гинсу, Романовскому-Гимзе и некоторые другие. При окраске по НЕЙССЕРУ гранулы ВОЛЮТИНА у дифтерийных коринебактерий окрашиваются в сине-черный, а бактерия - в желтый цвет. Мазок окрашивают: 1) 1 мин уксуснокислым метиленовым синим (метиленовый синий - 0,1 г, спирт - 2 мл, ледяная уксусная кислота - 5 мл, дистиллированная вода - 100 мл); 2) сливают краситель и мазок промывают водой; 3) на 20- 30 с наносят раствор Люголя; 4) 1 -3 мин окрашивают везувином (прокипяченная и отфильтрованная взвесь 2 г везувина в смеси 60 мл спирта и 40 мл дистиллированной воды). Количественное содержание ПЕПТИДОГЛИКАНА, содержащегося в # стенке, определяет характер окраски бактерий и других прокариот по ГРАМУ. Те из них, которые содержат в клеточной стенке большое его количество (около 90 % пептидогликана), окрашиваются по Граму в сине-фиолетовый цвет и их называют грамположительными, все другие, содержащие в оболочке 5-20 % пептидогликана, - в розовый цвет и их называют грамотрицательными. Толщина слоя пептидогликана в клеточной стенке грамположительных бактерий в несколько раз больше, чем у грамотрицательных. Техника окраски по Граму: 1. Фиксированный мазок 1-2 мин окрашивают раствором генцианвиолета (генцианвиолет - 1 г, этанол 96 % - 10 мл, фенол кристаллический - 2 г, вода дистиллированная - 100 мл; по методу Синева его покрывают пропитанной тем же красителем полоской фильтровальной бумаги, которую смачивают 2-3 каплями воды). 2. Слив генцианвиолет (сняв полоску бумаги Синева), мазок 1 мин обрабатывают раствором Люголя и, не промывая водой, сливают его. 3. Обесцвечивают спиртом в течение 0,5 мин, промывают водой. 4. Окрашивают 1-2 мин фуксином Пфейффера. 5. Мазок ополаскивают водой и высушивают. Для выявления грамположительных КИСЛОТО- И СПИРТОУСТОЙЧИВЫХ микобактерий туберкулеза и лепры, которые из-за большого количества в клеточных оболочках жировосковых веществ, миколовой кислоты и других оксикислот непроницаемы для разведенных растворов красителей, используют окраску по методу ЦИЛЯ - НИЛЬСЕНА. Окрашивание их по этому способу достигается при помощи концентрированного фенолового фуксина Циля с подогреванием над пламенем горелки до закипания и отхождения паров. Окрашенные с применением термокислотной обработки микобактерии не обесцвечиваются слабыми растворами минеральных кислот и этилового спирта. Техника окраски. 1. Фиксированный мазок покрывают полоской фильтровальной бумаги, на которую наносят фуксин Циля, и несколько раз подогревают над пламенем горелки до появления паров, подливая краситель, далее бумагу снимают и промывают водой. 2. Препарат обрабатывают (обесцвечивают) 5 % раствором серной кислоты и промывают водой. 3. На мазок наливают водно-спиртовой раствор метиленового синего, спустя 3-5 мин промывают водой и высушивают. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в интенсивно красный цвет, остальные виды микробов, обесцвечивающиеся в процессе обработки препарата кислотой, - в светло-синий. Окраска структурных элементов микробной клеткиДля обнаружения КАПСУЛ бактерий, плохо воспринимающих красители, используют метод БУРРИ-ГИНСА: в каплю туши, разведенной в 10 раз водой, вносят исследуемые бактерии и равномерно распределяют их петлей по предметному стеклу; мазок высушивают, фиксируют (наносят 2-3 капли спирта и сжигают его на стекле), окрашивают в течение 3-5 мин фуксином Пфейффера, промывают водой, высушивают; на темном фоне препарата капсулы видны в виде светлых ореолов вокруг красных бактерий. О наличии ЖГУТИКОВ чаще всего судят по направленному характеру движения бактерий в раздавленной и висячей каплях. Но можно использовать и некоторые методы окраски, например по МОРОЗОВУ: 1) обработка препарата кислотой, при этом оболочки и жгутики разрыхляются; 2) закрепление разрыхленных структур танином; 3) обработка азотнокислым серебром, оно окутывает каждый жгутик и саму # толстым слоем, давая различные оттенки от жёлтого до тёмно-коричневого. СПОРЫ. Эндоспоры бактерий выдерживают длительное кипячение, действие горячего воздуха (140-150°С) и химических дезинфицирующих веществ, многие годы сохраняются в почве, на растительности и предметах. Попадая в организм человека и животных, споры патогенных бактерий прорастают в материнские клетки за несколько часов. Водным фуксином, водно-спиртовым метиленовым синим и по Граму эндоспоры не окрашиваются, так как их плотная многослойная оболочка непроницаема для обычных красителей. В мазках из патологических материалов, культур бацилл и клостридии, окрашенных простыми красителями, споры выглядят в виде бесцветных телец внутри окрашенных в соответствующий цвет вегетативных клеток или вне их. Окрашивать их можно по методу Циля-Нельсена, используя для обесцвечивания мазков после обработки их фуксином Циля не 5%, а 1% серную кислоту. При этом эндоспоры, так же как микобактерии туберкулеза, красятся в розовый цвет и будут хорошо видны на синем фоне бактерий. Для окрашивания спор можно использовать метод по ОЖЕШКО: 1) протравка оболочки споры горячей кислотой; 2) окраска по Цилю-Нильсену. При исследовании морфологии паразитов крови (спирохеты - бледная трепонема, простейшие - малярийный плазмодий), а т/же ФЭ, используют окраску по РОМАНОВСКОМУ-ГИМЗА. Краска состоит из смеси азура, эозина и метиленовой сини. Окрашивает ЦИТОПЛАЗМУ в голубой, а ЯДРА в красно-фиолетовый цвет. Этот метод позволяет обнаружить различные цитологические детали. Мазок для люминесцентной микроскопии готовят обычным образом, фиксируют в ацетоне и наносят на него флюорохром на 20-30 мин. Сделанный препарат промывают проточной водой, покрывают покровным стеклом и микроскопируют. |