БТ антибиотики. Противоопухолевые антибиотики. Иммунобиотехнология
 Скачать 0.61 Mb.
|
Противоопухолевые антибиотики. Иммунобиотехнология.Из всех продуктов, получаемых с помощью микробиологических процессов, наибольшее значение имеют вторичные метаболиты. Вторичные метаболиты (идиолиты) – это низкомолекулярные соединения, не требующиеся микроорганизмам для роста, развития или размножения в чистой культуре. Идиолиты, или вторичные метаболиты, не играют явной роли в процессах метаболизма, они вырабатываются клетками для адаптации к условиям окружающей среды, например, для защиты. Их синтезируют не все микроорганизмы, а в основном нитчатые бактерии, грибыи спорообразующие бактерии. Микроорганизмы, производящие вторичные метаболиты, вначале проходят стадию быстрого роста, тропофазу, во время которой синтез вторичных веществ незначителен. По мере замедления роста из-за истощения одного или нескольких необходимых питательных веществ в культуральной среде микроорганизм переходит в идиофазу; именно в этот период синтезируются идиолиты. Особенности вторичных метаболитов: Относительная низкая молекулярная масса (исключения – высокомолекулярные полиизопреноиды: каучук, гуттаперча); Не обязательно присутствуют в каждом организме; Как правило, являются биологически-активными веществами Синтезируются из первичных метаболитов. К вторичным метаболитам относятся антибиотики, алкалоиды, гормоны роста растений и токсины. Получение антибиотиков Антибиотики – самый большой класс фармацевтических соединений, синтез которых осуществляется микробными клетками. Стоимость годовой продукции антибиотиков – 19 миллиардов $. Выпускаются антибиотики на рынок ежегодно сотнями тысяч тонн. За 50 лет развития антибиотиков возросла резистентность микроорганизмов (м/о) к ним. Антибиотики (от др.-греч. ἀντί — против + βίος — жизнь) — это низкомолекулярные соединения, которые синтезируются в живой клетке и способны в небольших концентрациях подавлять рост чувствительных к ним м/о или опухолевых клеток. Их продуцируют не только клетки микроорганизмов и растений, но и клетки животных. Антибиотики растительного происхождения называют фитонцидами. Это хлорелин, томатин, сативин, получаемый из чеснока, и алин, выделяемый из лука. Антибиотики являются «средством преодоления стрессовых ситуаций» для м/о. Антибиотики для почвенных м/о являются не только средствами борьбы, они также являются низкомолекулярными «эффекторами» м/о; с их помощью м/о меняет свой метаболизм при неблагоприятных условиях (например, спорообразование). Гипотезы возникновения антибиотиков 1. При происхождении жизни на земле антибиотики являлись стимуляторами или ингибиторами процесса матричного синтеза – они являлись «реликтовыми молекулами» у первичных форм жизни. Но при возникновении рибосом, появились другие регуляторы, они оказались вытесненными и сохранились только у некоторых м/о. У этих м/о из стимуляторов синтеза белка они превратились в ингибиторы. 2. Антибиотики – случайные продукты м/о. Плазмида – кольцевая ДНК – циркулирует по микробным популяциям. При передаче плазмиды другому м/о в результате рекомбинаций и мутаций могут синтезироваться «случайные вещества», из которых образовались антибиотики. Особенности культурального роста этих микроорганизмов необходимо учитывать при производстве. Например, в случае антибиотиков большинство микроорганизмов в процессе тропофазы чувствительно к собственным антибиотикам, однако во время идиофазы они становятся к ним устойчивыми. Чтобы уберечь микроорганизмы, продуцирующие антибиотики, от самоуничтожения, важно быстро достичь идиофазы и затем культивировать микроорганизмы в этой фазе. Это достигается путем варьирования режимов культивирования и составом питательной среды на стадиях быстрого и медленного роста. При биосинтезе антибиотиков целесообразно лимитирование роста продуцента. Таким лимитирующим фактором при биосинтезе пенициллина выступает глюкоза, тогда как при биосинтезе антибиотиков стрептомицетами – фосфаты. Выделения антибиотиков обусловлены многокомпонентностью культуральных жидкостей и малой концентрацией в них целевых продуктов. Так, пенициллин может накапливаться примерно до 30 г/л при 8%-м выходе от субстрата. Огромное разнообразие антибиотиков и видов их воздействия на организм человека явилось причиной классифицирования и разделения антибиотиков на группы. По происхождению антибиотики классифицируют: 1) Природные • из собственно бактерий • из актиномицетов • из грибов и лишайников 2) Полусинтетические – природные антибиотики, модифицированные ферментным или химическим путем. 3) Синтетические (сульфаниламиды) По характеру воздействия на бактериальную клетку антибиотики можно разделить на три группы: • бактериостатические (бактерии живы, но не в состоянии размножаться) тетрациклины, хлорамфеникол, макролиды, линкозамиды. • бактерициды (бактерии умертвляются, но физически продолжают присутствовать в среде), пенициллины, цефалоспорины, аминогликозиды, полимиксины., • бактериолитические (убивают бактерии, и бактериальные клеточные стенки разрушаются). По механизму биологического действия антибиотики делятся: 1. Антибиотики, ингибирующие синтез клеточной стенки (пенициллины, цефалоспорины, бацитрацин, ванкомицин). 2. Антибиотики, нарушающие функционирование цитоплазматической мембраны (полипептиды, полиены, грамицидин). 3. Антибиотики, разрушающие рибосомальные субчастицы и сдерживающие синтез белка (тетрациклины, хлормицетины, аминогликозиды, макролиды). 4. Антибиотики, избирательно подавляющие синтез нуклеиновых кислот: - ингибиторы синтеза РНК (актиномицин, гризеофульвин, канамицин, неомицин, новобиоцин и др.); - ингибиторы синтеза ДНК (брунеомицин, саркомицин). Антибиотики, нарушающие клеточную стенку бактерийБольшинство бактерий, кроме цитоплазматической мембраны, имеют снаружи клеточную стенку, которая содержит слои пептидогликана (муреин; длинные цепи дисахарида, соединенные пептидными мостиками). Пептидогликан состоит из цепочек, образованных повторяющимся (до 60 раз) комплексом двух аминосахаров — N-ацетилмурамовой кислоты и N-ацетилглюкозамина. К каждой молекуле N-ацетилмурамата присоединен пептид. Между тетрапептидами соседних цепочек при участии транспептидазы образуются пептидные мостики. Таким образом, пептидогликан образует прочный каркас клеточной стенки. Типичный пептид содержит L-аланин, D-глутаминовую кислоту, мезо-диаминопимелиновую кислоту, L-лизин, D-аланин (следует отметить, что мезо-диаминопимелиновая кислота и D-аминокислоты в составе клеточных структур встречаются только в прокариотических клетках). При делении микробных клеток активируется муреингидролаза, которая разрушает транспептидные мостики и таким образом расщепляет пептидогликан (муреин). Средства, нарушающие клеточную стенку бактерий, препятствуют синтезу пептидогликана или нарушают связи между цепями пептидогликана. При этом прочность клеточной стенки снижается и растущие бактерии гибнут. Так как клетки органов и тканей человека не имеют клеточной стенки, антибиотики, которые нарушают клеточную стенку бактерий, относительно мало токсичны для человека. К антибиотикам, нарушающим клеточную стенку бактерий, относятся и бета-лактамные антибиотики Молекулы этих антибиотиков (бета-лактаминов) содержат бета-лактамное кольцо — лактонный цикл, включающий азот. Они нарушают синтез пептидогликана клеточной стенки на последнем этапе, ингибируя транспептидазы. Транспептидазы соединяют концы пептидных цепочек, на концах которых находится D-аланин, а b-лектамные антибиотикиявляются аналогами D-аланина и связываются с активным центром фермента, тем самым инактивируя его. В результате пептидные цепочки не замыкаются. Блокирование синтеза пептидогликана приводит к гибели бактерии. Среди бета-лактамных антибиотиков выделяют: 1) пенициллины, 2) цефалоспорины, 3) карбапенемы, 4) монобактамы. Пенициллины Пенициллины. Пенициллин впервые получен Флемингом, Флори и Чейном в 1940 г. В 1928 году Александр Флеминг проводил рядовой эксперимент в ходе многолетнего исследования, посвященного изучению борьбы человеческого организма с бактериальными инфекциями. Вырастив колонии культуры Staphylococcus, он обнаружил, что некоторые из чашек для культивирования заражены обыкновенной плесенью Penicillium — веществом, из-за которого хлеб при долгом лежании становится зеленым. Вокруг каждого пятна плесени Флеминг заметил область, в которой бактерий не было. Из этого он сделал вывод, что плесень вырабатывает вещество, убивающее бактерии. В последствии он выделил молекулу, ныне известную как «пенициллин». Это и был первый современный антибиотик. Пенициллины, как и цефалоспорины относятся к группе b-лектамных антибиотиков. Первичные метаболиты (предшественники) b-лектамных антибиотиков – три аминокислоты: цистеин, валин, аминоадипиновая кислота. Продуцентами пенициллинов и цефалоспоринов являются грибы. Пеницилины вырабатываются колониями плесневого грибка Penicillinum. Цефалоспорины— обладают схожей структурой с пенициллинами. Используются по отношению к пенициллинустойчивым бактериям. До сих пор пенициллиновые антибиотики составляют наиболее важную группу химиотерапевтических средств. Ядром пенициллинов является 6-аминопенициллановая кислота, или 6-АПК. Биосинтез пенициллина осуществляется в три стадии: На первой стадии происходит конденсация трех аминокислот: L-α-аминоадиповой кислоты, L-цистеина, L-валина в трипептид (ACV). Перед конденсацией в трипептид аминокислота L-валин превращается D-валин. Вторая стадия биосинтеза пенициллина это окисление линейной молекулы ACV в двуциклический интермедиат изопенициллин N Изопенициллин N — очень слабый интермедиат, так как он не обладает противомикробной активностью. На заключительной стадии происходит трансаминирование ферментом изопенициллин N N-ацилтрансферазой, при этом α-аминоадипиловая боковая цепь изопенициллина N удаляется и заменяется на фенилуксусную кислоту. Промышленный щтамм выращивают в присутствии фенилуксусной кислоты в условиях дозированной подкормки – раствор сахара подается постоянно в очень малых количествах. Потом загустевшую жидкость пропускают через вращающийся фильтр. Затем клетки, содержащие пенициллин, промываю. Фильтрат обрабатывают К+, образуется калиевая соль пенициллина. В настоящее время большое значение имеет так называемый полусинтетический (биологический + химический) способ получения аналогов природного пенициллина, обладающих рядом ценных свойств. Один водород в аминогруппе 6-АПК может быть заменен на какой-либо радикал (R), усиливающий или расширяющий антимикробный спектр полусинтетического производного. Так, ацилированием аминогруппы 6-АПК получен ряд новых полусинтетических антибиотиков, которые кислотоустойчивы в желудке, не подвергаются деструкции в организме пенициллиназой, обладают более широким спектром действия: Для преодоления широко распространенной среди микроорганизмов приобретенной устойчивости, связанной с продукцией особых ферментов — β-лактамаз, разрушающих β-лактамы, — были разработаны так называемые защищённые пенициллины, включающие соединения, способные необратимо подавлять активность β-лактамаз (ингибиторы β-лактамаз) — клавулановую кислоту, сульбактам и тазобактам. Также возможен другой путь образования устойчивости — изменение характерных частей пенициллиносвязывающих белков. Поскольку пептидогликан и пенициллиносвязывающие белки отсутствуют у млекопитающих, пенициллины практически не имеют серьёзных побочных эффектов. Однако у некоторых больных могут развиться аллергические реакции на пенициллин. Цефалоспорины Основными особенностями цефалоспоринов по сравнению с пенициллинами являются их большая резистентность по отношению к β-лактамазам — ферментам, вырабатываемым микроорганизмами. Известно около 20 цефалоспоринов, созданных методом полусинтеза из АЦК.  Полимиксины Бактерии – также способны к образоыванию антибиотиков. Образуют антибиотики и большинство бацилл, которые являются спорообразующими бактериями. В медицине применяют полимиксины, продуцируемые спорообразующими почвенными бактериями Bacillus polymyxa. Полимиксины (полимиксин, грамицидин) по химическому строению являются сложными соединениями, включающими остатки полипептидов. Они нарушают развитие цитоплазматической мембраны у бактерий, повышают ее проницаемость. Всего имеется 12 тысяч природных антибиотиков, из них 9 тысяч антибиотиков продуцируют актиномицеты. Актиномицеты продуцируют антибиотики, ингибирующие синтез белка на рибосомах бактериальных клеток. Такой же механизм у противогрибковых и противоопухолевых антибиотиков. Актиномицеты продуцируют следующие группы антибиотиков: • Аминогликозиды (канамицин, неомицин) – ингибируют синтез белка у бактерий, связываясь с малой рибосомной субъединицей, нарушая правильность считывания кодонов иРНК антикодонами тРНК. -канамицин - Actinomyces kanamycetus -неомицин - Actinomyces iracie. • Тетрациклины (окситетрациклин, линкомицин, левомицетин) ингибируют белковый синтез, связывая аминоацил–тРНК с рибосомно-матричным комплексом, окситетрациклин – Аctinomyces ninesus макролиды гр. эритромицина – связываются с большой субъединицей рибосомы. пиранозиды (группы линкомицина – сходны с макролидами, они связываются с большой субъединицей рибосомы. - линкомицин – Streptomyces linconiensis/ левомицетин (получают химическим путем) – ингибирует пептилтрансферазу большой рибосомальной субъединицы. Природный левомицетин (хлорамфеникол) продуцируется Streptomyces venezuelae. Рифамицин – Streptomyces mediterranei, на основе рифамицина получен рифампицин. Рифампицин подавляет активность ДНК-зависимую РНК-полимеразу и тем самым блокирует синтез белка на уровне транскрипции. • противогрибковые - (полиеновые) антибиотики (нистатин, леворин, амфотерцин)– образуют поры в цитопластической мембране грибов, взаимодействуя с ее стерольным компонентом (эргостеролом). - нистатин - Streptomyces noursei - леворин – Actinomyces levorus - амфотерцин - Streptomyces nodosus противоопухолевые антибиотики - угнетают синтез нуклеиновых кислот клеток микро- и макроорганизмов. - брунеомицин – Actinomyces albusvar bruneomycini - митомицин – Streptomyces caespitosus. • противоопухолевые антибиотики (брунеомицин, митомицин)– угнетают синтез нуклеиновых кислот клеток микро- и макроорганизмов. Количество открываемых антибиотиков постоянно растет. В 1940 г. было известно всего 6 антибиотиков, а в настоящее время описано более 12 000 аналогичных соединений, из которых в клинике применяют около 200 препаратов. 97% известных антибиотиков токсичны, поэтому в практике не используются. Поиск новых антибиотиков обусловлено как потребностями практики, так и накоплением резистентных форм микроорганизмов по отношению ко многим антибиотикам. Главное направление получения новых антибиотиков состоит в химической трансформации природных молекул для создания полусинтетических антибиотиков. Методы получения антибиотиков путем химического синтеза чрезвычайно сложны и не могут конкурировать с их биосинтезом методами биотехнологии. Существует несколько способов получения как природных, так и полусинтетических антибиотиков: 1) ферментация микроорганизма-продуцента с подходящим предшественником, что индуцирует синтез антибиотиков в идиофазе; Вводимый предшественник должен лимитировать скорость биосинтеза антибиотика. Например, производство бензилпенициллина в значительной степени стимулируется добавками его метаболического предшественника – фенилуксусной кислоты. 2) использование блокированных мутантов, у которых блокирован синтез нужного антибиотика. Используя низкую субстратную специфичность ферментов и вводя аналоги предшественников антибиотика, их переводят в аналоги самого антибиотика. Этот процесс называется биосинтез, или мутасинтез: а) предполагается последовательность реакций, ведущая к синтезу антибиотика; б) отсутствие синтеза антибиотика у «блокированного» мутанта; в) синтез модифицированного антибиотика после введения аналога предшественника (D*). Так, мутанты Nocardia mtditerranei, у которых нарушена способность к ацилированию, образуют аналог предшественника рифамицина В-рифамицин SV. Определение антимикробной активности антибиотиков Для определения антимикробной активности антибиотиков используют тест-микроорганизмы, в качестве примеров которых можно привести: Aspergilus niger Bacillus subtilus Pseudomonas aerogenosa. Определение активности антибиотиков проводится методом биологического титрования. Существует так называемый трехдозный метод с использованием испытуемого и стандартного раствора раствора). Метод описан в ГФ ХI, т.2. Применяется также и однодозный метод – с использованием стандартной кривой по логарифмической сетке. Антибиотики– вторичные вещества, т.е. они не всегда выделяются микробной клеткой. Задача биотехнолога состоит в подборе концентрации питательных веществ в среде таким образом, чтобы не было слишком большого роста биомассы, но антибиотик бы продуцировался в достаточных количествах. • в среде не должно быть глюкозы (нельзя использовать легко усвояемые источники углеводов), используют трудно усвояемые источники углеводов – например, крахмал. • в качестве источника аммонийного азота используют соевую муку; • должна быть небольшая концентрация фосфора. Любые предшественники для получения антибиотической структуры надо добавлять не в «0» точке ферментации, а на 2-е, 3-и сутки (если продуцент – грибы или актиномицеты), когда антибиотики начинают синтезироваться (это относится, например, и к фенилуксусной кислоте при синтезе пенициллина, которую добавляют на вторые или третьи сутки биосинтеза пенициллина). Предшественники β-лактамных антибиотиков. β-лактамные антибиотики синтезируются из аминокислот L-цистеин, L - валин, L -аминоадипиновая кислота, из которых синтезируется LLD- трипептид (L –валин превращается в D-валин). Из линейного LLD-трипептида образуется лактамное кольцо, затем образуется пятичленное серосодержащее кольцо и т.д. Антибиотики не являются продуктом матричного синтеза. Аминогликозиды синтезируются из глюкозы. Тетрациклины и макролиды синтезируются с помощью ацетилкоэнзима наподобие жирных кислот (с участием приблизительно 22-х ферментов). Ферменты синтезирующие антибиотики образуют мультиферментные комплексы (засчетводородныхсвязей),вкоторые«входят»предшественники антибиотика, а «выходит» целая молекула антибиотика (вовнешнюю среду). Эти комплексы располагаются по периферии клеткипродуцента. Таким образом, антибиотики отделяются от других системсинтеза в клетке, и антибиотик никак не воздействует на свой продуцент (неингибирует и не активирует другие процессы). К тому же мембраныпродуцента непроницаемы для вышедшего продуцента, тем самым создаваяусловия одностороннего движения антибиотика только во внешнюю среду. Механизмы защиты продуцентов от антибиотиков 1. антибиотик, синтезируемый продуцентом, не находит в клетке продуцента мишени (например, это грибы, синтезирующие β-лактамные антибиотики); 2. антибиотик синтезируется в мультиферментных комплексах, находящихся на периферии и отделенных от других жизненно важных систем клетки; 3. находящийся внутри клетки антибиотик временно инактивируется с последующей активацией при выходе из клетки (например, неомицин фосфорилируется в клетке фосфатазой мембраны). По выходе из клетки, он дефосфорилируется и активизируется. Очень важно бороться с ретроингибированием. Механизм ретроингибирования антибиотиков Когда аминоадипиновая кислота накапливается в достаточном количестве для клетки, она начинает реагировать с первым ферментом цепочки (ключевым ферментом), связывается с его аллостерическим центром, в результате чего изменяется структура активного центра фермента и синтез прекращается. Когда концентрация аминоадипиновой кислоты снижается, синтез начинается снова. Если лизина в клетке много, он также может выключить процесс своего образования, а так как аминоадипиновая кислота – его предшественник и образуется с лизином в одном метаболическом пути, то ее образование также прекращается. Биотехнологу для достижения большого выхода целевого продукта следует работать со штаммами, где разрегулирована (нарушена) система ретроингибирования. Механизмы развития резистентности у бактерий Плазмиды – носители генов информации (всего около 30 генов). Плазмиды автономно реплицируются (размножаются) независимо от деления клетки. Плазмиды могут содержать гены резистентности (устойчивости) к разным антибиотикам. Плазмиды с генами резистентности легко передаются из клетки в Резистентность может существовать также за счет генов клетки У некоторых клеток есть гены, которые делают мембраны непроницаемыми для антибиотиков (сужаются поры или снижается их количество). Способы борьбы с этой резистнтностью 1. Создан β-лактамный антибиотик Имипинем, который в растворе образует цвиттер-ион, меньший по размерам, чем пенициллин и легко проникает через узкие пориновые каналы. 2. Могут быть созданы структуры, которые проникают не через пориновые каналы, а другим способом, например, с помощью имитации структуры переносчика. Есть цефалоспорин, имитирующий переносчик железа и, попадая в клетку, он угнетает синтез пептидогликана, ингибируя транспептидазу). -цефалоспорины Ш поколения не расщепляются β-лактамазами, но они являются индукторами выработки β-лактамаз, - цефалоспорины 1У поколения (Цефепим) не являются индукторами β-лактамаз. 3. аминогликозидный антибиотик Амикацин имеет фрагмент гаммаоксимасляной кислоты в структуре канамицина защищающий этот антибиотик от инактивации со стороны изоферментов этого антибиотика, поэтому этот антибиотик отличается высоким терапевтическим эффектом. Механизмы развития резистентности у бактерий Плазмиды – носители генов информации (всего около 30 генов). Плазмиды автономно реплицируются (размножаются) независимо от деления клетки. Плазмиды могут содержать гены резистентности (устойчивости) к разным антибиотикам. Плазмиды с генами резистентности легко передаются из клетки в Резистентность может существовать также за счет генов клетки У некоторых клеток есть гены, которые делают мембраны непроницаемыми для антибиотиков (сужаются поры или снижается их количество). Способы борьбы с этой резистнтностью 1. Создан β-лактамный антибиотик Имипинем, который в растворе образует цвиттер-ион, меньший по размерам, чем пенициллин и легко проникает через узкие пориновые каналы. 2. Могут быть созданы структуры, которые проникают не через пориновые каналы, а другим способом, например, с помощью имитации структуры переносчика. Есть цефалоспорин, имитирующий переносчик железа и, попадая в клетку, он угнетает синтез пептидогликана, ингибируя транспептидазу). -цефалоспорины Ш поколения не расщепляются β-лактамазами, но они являются индукторами выработки β-лактамаз, - цефалоспорины 1У поколения (Цефепим) не являются индукторами β-лактамаз. 3. аминогликозидный антибиотик Амикацин имеет фрагмент гаммаоксимасляной кислоты в структуре канамицина защищающий этот антибиотик от инактивации со стороны изоферментов этого антибиотика, поэтому этот антибиотик отличается высоким терапевтическим эффектом. |