гистотехника. Гистотехника. Реферат выполнил(а) студентк(а) группы 222 Побединская М. В
 Скачать 254.71 Kb.
|
|
Бюджетное профессиональное образовательное учреждение Воронежской области «Воронежский базовый медицинский колледж» Гистологическая техника РЕФЕРАТ
Воронеж 2021 г. Содержание Введение Гистологическая техника — это техника приготовления гистологического препарата. Гистологическим препаратом может быть срез органа, ткани, мазок, отпечаток, пленочный препарат, культура тканей. Во всех случаях гистологический препарат должен отвечать таким требованиям: 1. Быть прозрачным, т.е. пропускать поток света. Для этого изготав¬ливают достаточно тонкие срезы органов, тканей, клеток. 2. Быть контрастным, что достигается окрашиванием препарата. 3. Быть постоянным, т.е. сохраняться длительное время и служить в ка-честве своеобразного документа. Все эти требования к гистологическому препарату и выполняются в ходе гистологической техники. 1. Техника изготовления гистологических препаратов Гистология, как любая наука, имеет свои объекты и методы их изучения. Непосредственными объектами изучения являются клетки фрагменты тканей и органов, особым способом приготовленные для изучения их под микроскопом. 1.1 Взятие и фиксация материала Сбор материала является первым этапом в приготовлении гистологических препаратов, и от того, насколько правильно выполнена эта процедура, зависит успех всей работы. Существует несколько путей получения материала: 1) от животных, умерщвленных специально для этих целей; 2) от животных и людей в результате прижизненного оперативного иссечения кусочков тканей из органов живого организма (биопсия); 3) взятие материала от трупа. Следующий и очень ответственный этап в гистологической технике, призванный сохранить ткани и органы в состоянии, близком к тому, в котором они находились до момента смерти. В тканях при фиксации происходят сложные физико-химические изменения, в частности коагуляция (осаждение) белков. Фиксаторов, которые бы полностью сохраняли структуру, нет. Они существенно уплотняют ткани, уменьшают их объём, приводят к необратимым изменениям. Фиксатор в разной степени сохраняет разные структуры. Если при фиксации вещество разрушается, то нефиксированный материал замораживают и высушивают на холоде (лиофилизация). При этом не происходит денатурации белков, снижение активности ферментов, но изменяется форма клеток. Чтобы не произошло образования кристаллов, производят быструю заморозку при температуре от 30 до 60° С. Высушивание ускоряется в условиях вакуума (в специальных аппаратах). Заливку материала в среды проводят быстро, во избежание увлажнения Цель фиксации - убить клетку, прекратить происходящие в ней процессы (прежде всего ферментативные) и, по возможности, сохранить ее прижизненное строение. Существует ряд общих правил фиксации: 1) объем фиксирующей жидкости должен не менее чем в 20 раз превышать объем фиксируемого кусочка ткани; 2) фиксатор должен иметь доступ к фиксируемому материалу со всех сторон, по этому на дно сосуда кладут вату или кусочек фильтровальной бумаги или подвешивают кусочек на нитке; 3) продолжительность фиксации зависит от свойств фиксатора, прежде всего от скорости проникновения фиксатора в ткань; 4) различные фиксаторы сохраняют различные структурные и химические компоненты клетки. Большинство фиксаторов оказывает уплотняющее действие на обрабатываемый материал. Размер исследуемых кусочков должен быть таким, чтобы произошло полное его пропитывание в оптимальные для данного фиксатора сроки. В среднем для большинства фиксаторов берут кусочки толщиной 5-10 мм. Различают фиксирующие средства (простые фиксаторы) и фиксирующие смеси (сложные фиксаторы): Простые фиксирующие вещества 1. Формалин Формалин (формол) наиболее распространенная и универсальная жидкость с характерным резким запахом. Обычный продажный формалин представляет собой 40% водный раствор формальдегида. Формалин - хорошее фиксирующее средство и незаменим в повседневной работе патологоанатомических отделений. Его применяют не только для простой гистологической работы (имеются в виду общие краски), но и при многих специальных методах исследования. Большим достоинством формалина является возможность сохранять в нем кусочки довольно долгое время и после окончания фиксации. Необходимо заметить, что при длительных сроках хранения (месяцами) кусочков в растворах формалина образуются большие осадки, которые на срезах симулируют пигментные отложения и этим затрудняют микроскопическое исследование. Иногда такие осадки появляются очень скоро, например, при фиксации объектов с большим кровенаполнением или при фиксации в небольшом количестве жидкости. Впрочем, эти осадки сравнительно легко удаляются. 2. Этиловый спирт Для фиксации тканей и органов применяют как абсолютный, так и 96° этиловый спирт. По сравнению с формалином спирт обладает меньшей проникающей способностью, и поэтому кусочки для фиксации берут не толще 0,3-0,5 см. Продолжительность фиксации - от нескольких часов и до суток, в зависимости от характера ткани и толщины кусочков. Хорошо фиксированный кусочек должен быть равномерно уплотнен и имеет одинаковый вид как с поверхности, так и на контрольном разрезе. Работая со спиртом как с фиксатором, далеко не всегда можно пользоваться им столь широко, как это рекомендуется с другими фиксирующими жидкостями. Спирт употребляется как фиксирующее средство редко (когда нет формалина) и притом только для плотных и тканей. Сложные фиксирующие жидкости 1. Жидкость Карнуа Из числа сложных фиксирующих жидкостей наибольшее практическое значение в работе патологоанатомического отделения имеет жидкость Карнуа. 1.2 Обезвоживание После фиксации, для которой применялся формалин, кусочки промывают в течение 6,12 или 24 ч в проточной воде: на водопроводный кран надевают резиновую трубку, конец которой опускают в широкогорлую банку, закрытую марлей. Для промывки удобно использовать эксикаторы разных размеров, снабженные краном: в отверстие крышки эксикатора опускают шланг, по которому подают воду, а через кран эксикатора ее сливают. В том случае, если в состав фиксатора входила пикриновая кислота, материал следует промыть в нескольких сменах 70% спирта, после фиксации с использованием сулемы в йодированном 70% спирте. Материал, фиксированный для некоторых гистохимических реакций, электронномикроскопического и иммуноцитохимического исследований, отмывают от фиксаторов в различных буферных смесях. В случае необходимости кусочки тканей перед обезвоживанием можно уменьшить, подровнять. Если материал после фиксации не сразу подлежит проводке, то его можно оставить в 70-80% спирте. Способы обезвоживания тканей Перед заливкой материала в парафин пли целлоидин его необходимо обезводить. Существует несколько традиционных способов обезвоживания. Самым распространенным является обезвоживание в спиртах восходящей концентрации, начиная с 70%. Обычно применяют батарею спиртов, состоящую из двух порций 96% и двух - 100% спирта. Продолжительность процесса обезвоживания в спиртах в среднем 48 ч в зависимости от качества материала (содержания жира в ткани) и размера кусочков, а также от их количества. При использовании автомата для заливки количество спиртов увеличивают, а при проведении кусочков по спиртовой батарее вручную их осторожно промокают фильтровальной бумагой или салфеткой из марли, что позволяет реже менять спирты в батарее. Процесс обезвоживания можно ускорить, периодически встряхивая кусочки в банках со спиртами или поместив их в термостат при 37°С. Спирты в батарее необходимо своевременно заменять. Контролировать пригодность спирта позволяет проба с водой. В отлитое из банки небольшое количество спирта добавляют 1 каплю воды. Помутнение раствора свидетельствует о необходимости замены спирта в батарее. С целью ускорения обезвоживания применяют ацетон без примесей (ЧДА), предварительно добавив в него силикагель для удаления остатков воды или дистиллированный ацетон. Обезвоживание проводят в 2-3 сменах ацетона от нескольких часов до 1 суток в зависимости от величины объектов. Обезвоживание тканей возможно с помощью 99% изопропилового спирта, который непосредственно смешивается с парафином без промежуточных растворителей (ксилол, хлороформ и др.). Таким же свойством обладает диоксан, однако в связи с высокой токсичностью он не нашел широкого применения в патогистологической технике Для обезвоживания глицерином кусочки ткани последовательно помещают в 60%, 80% и 100% глицерин на 3-4 ч, а затем в смесь, состоящую из равных частей 100% глицерина и ксилола. 1.3 Уплотнение Уплотнение материала, необходимое для приготовления срезов, производится путем пропитывания предварительно обезвоженного материала парафином, целлоидином, органическими смолами. Более быстрое уплотнение достигается применением метода замораживания кусочков, например, в жидкой углекислоте Заливка: помещают образцы в смесь ксилол-парафин и затем в жидкий парафин на 1-2 ч при 52-56°С. Дают парафину, остывая, затвердеть; вырезают из него блок с заключённым образцом и закрепляют на деревянном кубике. Также используют заливку в смолы, желатин и замораживание. После окончательного пропитывания объекта его заливают расплавленным парафином, специально приготовленным для этих целей и хранящимся в термостате. В качестве формочек для заливки используют разнообразные приспособления. Г-образные гладкие угольники изготовляют из металла (латунь, свинец, сталь). Рекомендуется применять угольники, длинная сторона которых равна 8-10 см, короткая - 3 см, высота - 1,5-2 см. Угольники кладут на отполированную металлическую или стеклянную пластину и, сдвигая углы, создают формочку нужных размеров. Заливка в парафин Этот метод широко распространен в исследовательских гистологических лабораториях благодаря относительной быстроте заливки (в течение 1—2 дней после обезвоживания), возможности приготовления серийных срезов, а также тонких срезов для цитологических исследований (толщина 1-3 мкм), удобству хранения блоков и неокрашенных срезов (практически неограниченное время). К недостаткам метода следует отнести значительное сжатие исследуемого материала (до 20%), вызываемое воздействием высокой температуры в процессе пропитывания парафином. Богатые водой, рыхлые ткани малопригодны к заливке в парафин. Существует несколько сортов парафина: мягкие (точка плавления 45—54°С) и твердые (точка плавления 58—60°С). В большинстве случаев для заливки применяют парафин с точкой плавления 54—56°С. Удаление спирта Для удаления спирта и подготовки к пропитыванию парафином материал обрабатывают одним из растворителей парафина, обладающим способностью вытеснять спирт. К таким веществам относятся хлороформ, бензол, толуол, ксилол, сероуглерод и др. Чаще используют хлороформ и бензол. Толуол и ксилол делают кусочки более твердыми. Получение срезов Толщина парафиновых срезов колеблется от 3-5 до 15 мкм и зависит как от качества заливки материала, так и от ножа. Если заливка произведена правильно и качественно, парафиновые блоки готовят для приготовления тонких срезов, необходимых для исследования под микроскопом, достигается это резкой кусочков на особых приборах, называемых микротомами (Рис.2 .). Подобные приборы обеспечивают получение срезов нужной толщины. Микротом – это специальное механическое устройство, предназначенное для приготовления гистологических срезов определенной толщины. В работе часто используется санный микротом (МС-2). Прибор получил название благодаря тому, что нож и механизм подачи с зажимом для блока (объектодержателем) движутся на специальных салазках.   Рис. 2. Правила резания на микротоме Предпосылкой для получения хороших гистологических срезов служит правильный выбор угла наклона ножа и угла резания. Под углом наклона понимают угол, образуемой нижней поверхностью ножа с плоскостью резания. Наилучший считается такой угол наклона, при котором плоскость заточки ножа расположена параллельно верхней поверхности блока. Обычно он равен . Если нож установлен так, что угол наклона больше оптимального, то срез будет крошиться, если меньше – резка невозможна, так как лезвие ножа будет лишь скользить по поверхности блока. Под углом резания подразумевают угол между длинной осью ножа и воображаемой линией, идущей через центр блока параллельно движению салазок, несущих нож. Величина угла резания зависит от свойств обрабатываемого материала: чем он мягче, тем угол меньше, и, наоборот, чем тверже, тем угол больше. При косом расположении ножа уменьшается сопротивление его режущего края поверхности блока, что облегчает резку мягких блоков. Микротом замораживающий  Рис . 3. Микротом для резки замороженной ткани Микротом-криостат (МК-25)  Рис.4.Широкое развитие гистохимических методов исследования ферментов и других быстро разрушающихся веществ потребовало создания специального аппарата для приготовления свежезамороженных срезов — криостата. Микротомные ножи Резку исследуемого объекта на микротоме производят с помощью специальных микротомных ножей. Существует несколько разновидностей микротомных ножей. В основу их классификации положена форма лезвия. Ножи типа А имеют одну поверхность вогнутую, а другую ровную. У ножей типа В вогнутость менее выражена. Ножи типа С имеют ровную поверхность с обеих сторон. Сужение ножа от спинки к режущему краю довольно значительное, благодаря чему торцовая часть имеет характерный вид, по которому легко определить тип ножа ( Рис..). Ножи типа А делают из относительно мягкой стали, применяют при резке мелких объектов, залитых в целлоидин и состоящих из тканей малой и средней плотности (железы, стенка внутренних органов и т. д.). Ножи типа В (имеющие меньшую вогнутость лезвия, чем тип А) изготовляют из более твердой стали и употребляют как для приготовления целлоидиновых срезов, так и при резке материала, залитого в целлоидин-парафин. Ножи т и п а С (из твердой стали) служат для резки наиболее плотного материала (кость, хрящ, кожа), залитого в различные среды, парафиновых блоков, а также для получения срезов при работе на замораживающем микротоме. Длина ножей может быть различной — от 10 до 50 см.   Рис .5 . Размещение срезов на стекле Обучающимся лаборантам лучше начинать с приготовления гистологических срезов толщиной 14—16 мкм и лишь постепенно, по мере освоения техники резки, уменьшать толщину срезов. Правильно залитые небольшие кусочки органов и тканей при оптимальном температурном режиме в помещении режутся хорошо, и срез, как правило, ложится на нож в расправленном состоянии (угол резания прямой). Готовый срез осторожно снимают с ножа влажной кисточкой (в направлении от спинки к лезвию) и переносят либо на подготовленное предметное стекло. Помещают срезы на воду (предметное стекло) обязательно поверхностью, прилежащей к ножу, определить которую можно по характерному блеску (верхняя сторона всегда матовая). Очень важно не перепутать очередность серийных срезов при наклеивании на предметное стекло. Для этого ленту срезов разрезают скальпелем на отдельные фрагменты длиной около 3/4 предметного стекла и укладывают всегда в определенном порядке вдоль или поперек стекла(Рис.6 . )  Рис .6. Порядок расположения серийных срезов на стекле Окрашивание и заключение срезов В основе окрашивания тканевых микроструктур лежат физико-химические процессы. Из физических факторов в первую очередь следует отметить явления диффузии (проникновение), адсорбции (поверхностное впитывание) и абсорбции (глубокое пропитывание) красителя, а также его растворимость, из химических — электролитические свойства красящих растворов и самих тканей. Немаловажное значение имеют плотность тканей и дисперсность красителя. Красители Первое свойство определяет последовательность окрашивания отдельных структур, второе — скорость процесса окрашивания. Именно на электролитических свойствах основано разделение применяемых в гистологической практике красителей на три группы: основные, кислотные и нейтральные. Основной краситель представляет собой красящее основание или его соль и окрашивает клеточные и тканевые структуры кислой природы, например хроматин ядра, содержащий ДНК, и ядрышко, содержащее РНК. Отсюда и термин базофилия (любящий основание) для обозначения тканевых компонентов, окрашивающихся основными красителями (тионин, гематоксилин, метиловый зеленый и др.). Кислотный краситель — это красящая кислота или ее соль, в силу чего он окрашивает вещества и частицы основной природы, например гранулы эозинофильных лейкоцитов, цитоплазму некоторых клеток передней доли гипофиза и др. Отсюда и термин оксифилия (ацидофильный — любящий кислоту) для тканевых элементов, красящихся кислотными красителями. В эту группу веществ входят эозин, эритрозин, кислотный фуксин, конго красный и др. Нейтральный краситель образуется при соединении водных растворов кислотного и основного красителей (соединение красящей кислоты с красящим основанием). К этой группе относятся судан, эозиновокислый метиленовый синий и др. Не следует путать нейтральный краситель с нейтральной красящей смесью, для которой характерно одновременно присутствие в растворе основного и кислотного красителей. Термин же нейтрофилия применим к результатам окрашивания обеими группами красителей, так как отражает не свойство красителя, а равновесие между кислотными и основными свойствами окрашиваемых элементов. Следует помнить, что на качество окраски и ее стойкость значительное влияние могут оказывать способ фиксации, предварительная и последующая обработка препаратов. 1.5 Окрашивание Окраска гистологических срезов основана на неодинаковом сродстве тканевых элементов к определенным красителям. Ядра клеток более способны окрашиваться основными, а цитоплазма - кислыми красками. Соответственно этому различают основные, или ядерные, и кислые, или диффузные, краски. Наиболее часто в обычной патологоанатомической практике применяются окраски срезов гематоксилин-эозином по Ван-Гизону, Перлсу, Суданом III и др. Окраска гематоксилин-эозином. Окрашивают срезы в маленьких чашках Петри или на стеклах. Этот метод применяется для окраски срезов, приготовленных любым способом. При этом ядра клеток приобретают фиолетово-синий или густо-синий цвет, а цитоплазма и волокнистое вещество - светло-синий или розово-красный. Жиры и липоиды не окрашиваются. Эритроциты млекопитающих, поскольку они ядер не содержат, окрашиваются только эозином. Заключение Благодаря контролю качества мы можем узнать, насколько качественно были выполнены гистологические срезы. Так как в дальнейшем при выдачи результатов врачом патологоанатомом будет зависеть дальнейшее лечение больного. Из всего этого следует, что особое место занимает контроль качества среза, так как он важен для гистологического исследования и позволяет уточнить диагноз. Список литературы 1. Приказ МЗ РФ №220 от 26.05.2003 г. об утверждении отраслевого стандарта «Правила проведения внутрилабораторного контроля качества количественных методов клинических лабораторных исследований» 2. Бойчук А.В. Гистология. Атлас для практических занятий. - Изд.: ГОЭТАР-Медиа, 2008 3. Гистология: Учебник / Ю.И. Афанасьев, Н.А. Юрина, Е.Ф. Котовский и др.; Под ред. Ю.И. Афанасьева, Н.А. Юриной. - 5-е изд., перераб. доп. - М., Медицина, 2006. - 744 с.; ил. 4. Гунин А.Г. Гистология в таблицах и схемах. - Изд.: МИА, 2005. 5. Данилов Р.К. Гистология человека. - Изд.: ЭЛБИ-СПб, 2004 6. Крстич Радивой В. Иллюстрированная энциклопедия по гистологии человека. / Р.В. Крстич - СПб.: СОТИС, 2007. - 536 с.; 1576 ил. 7. Кузнецов С.Л. Гистология, цитология и эмбриология. Учебник для студентов медицинских ВУЗов / С.Л. Кузнецов, Н.Н. Мушкамбаров. - Москва: МИА, 2007. - 600 с.; ил., табл. 8. Кузнецов С.Л. Лекции по гистологии, цитологии и эмбриологии / С.Л. Кузнецов, М.К. Пугачев. - Москва: МИА, 2004. 9. Самусев Р.П. Атлас по цитологии, гистологии и эмбриологии: Учебное пособие для студентов высший мед. заведений / Р.П. Самусев, А.В. Смирнов. / Под ред. Р.П. Самусева. - 2-е изд., испр. - Москва: ООО «Издательство Оникс»; ООО «Издательство «Мир и Образование», 2006. - 400 с.; ил. 10. Семченко В.В., Барашкова С.А., Артемьев В.Н. Гистологическая техника: учебное пособие. - Омск: Омская медицинская академия, 2004. - 115 с. 11. Семченко В.В., Барашкова С.А., Ноздрин В.Н., Артемьев В.Н. Гистологическая техника: учебное пособие. - 3-е изд., доп. и перераб. - Омск-Орел: Омская областная типография, 2006. - 290 с. | ||||||||||