Рейтинговая работа по общ. биотехнологии. Рейтинговая работа по общ биотех. Рейтинговая работа 2. Промышленная, сельскохозяйственная и экологическая биотехнология
 Скачать 24.18 Kb.
|
|
Рейтинговая работа №2. Промышленная, сельскохозяйственная и экологическая биотехнология Вариант № 20 Существуют различные методы иммобилизации ферментов и клеток, обладающих ферментативной активностью. В случае использования гидролаз часто наблюдается ингибирование действия фермента продуктом реакции. Предложите возможные способы иммобилизации фермента, наиболее пригодные для использования в промышленности. Использование иммобилизованных ферментов сегодня является рутинным процессом для производства многих промышленных продуктов в фармацевтической, химической и пищевой промышленности. Некоторые ферменты, такие как липазы, обладают природной прочностью и эффективностью, могут использоваться для производства множества различных молекул и имеют широкий спектр промышленного применения благодаря своей широкой селективности. Иммобилизация фермента означает объединение селективности, стабильности и кинетических свойств фермента с физическими и химическими свойствами носителя в специализированном составе, основной задачей которого является максимизация стабильности как физической, так и ферментативной биокатализатора. Существует множество различных методов, используемых для иммобилизации ферментов, и они дают важные промышленные и экологические преимущества, такие как упрощение последующей обработки или непрерывность процесса. Промышленность всегда будет отдавать предпочтение простым и экономически эффективным методам. Здесь я представляю серию методов, основанных на физической иммобилизации (адсорбция или физическое улавливание) и химической иммобилизации (ковалентное связывание и сшивание), которые имеют преимущества для пищевой, химической, фармацевтической, косметической промышленности и производства медицинского оборудования. Однако справедливо будет уточнить, что ни один метод и поддержка не являются наилучшими для всех ферментов и их различных применений. Это связано с широким разнообразием химических характеристик и состава ферментов, различными свойствами субстратов и продуктов, а также различными вариантами использования продукта. Тем не менее, все методы могут иметь ряд преимуществ и недостатков. Адсорбция проста, дешева и эффективна, но часто обратима; ковалентное присоединение и сшивание эффективны и долговечны, но дороги и легко ухудшают работу фермента. Широко применяются нековалентные методы иммобилизации белков, которые включают либо пассивную адсорбцию на гидрофобных поверхностях, либо электростатические взаимодействия с заряженными поверхностями. Использование нитроцеллюлозных мембран или покрытых полилизином предметных стекол для электростатического связывания, пожалуй, наиболее широко известно. Как отмечалось выше, основным преимуществом такого способа иммобилизации является то, что не требуется ни дополнительных реагентов для связывания, ни модификации интересующего белка. Иммобилизация белка путем абсорбции на мезопористых силикатах В последнее десятилетие была проведена большая работа по синтезу мезопористых силикатов и иммобилизации ферментов на этих опорах. В 1992 году исследовательская группа Mobil обнаружила семейство мезопористых силикатов с узким распределением размеров пор, аморфной поверхностью кремнезема и размерами пор в диапазоне 20-300 Å. Эти новые регулярно повторяющиеся мезопористые структуры открывали возможность адсорбировать или удерживать крупные молекулы в своих порах. С момента их разработки эти материалы обещали улучшение каталитических исследований иммобилизованных ферментов. Предполагалось, что мезопористые силикаты обеспечат защищенную среду, в которой могут протекать реакции с выбранными субстратами. После их первоначального открытия мезопористые структуры были синтезированы с использованием катионных, нейтральных и блок-сополимерных поверхностно-активных веществ. Эти сополимеры содержат органические функциональные группы и металлы, расположенные в их каркасе или привитые к их поверхности, и были использованы в качестве основы для разработки мезопористых углеродных материалов. Иммобилизация белков на поликетоновом полимере с помощью водородных связей Недавно был предложен инновационный процесс иммобилизации, который использует поликетоновый полимер, совершенно новую опору. Поликетоновый полимер -[-CO-CH2CH2-]n-, полученный сополимеризацией этана и монооксида углерода, был использован для иммобилизации трех различных ферментов, одной пероксидазы из хрена и двух аминоксидаз из бычьей сыворотки и проростков чечевицы. Простую процедуру иммобилизации проводили в разбавленном водном буфере, осторожно перемешивая белки с полимером. Для иммобилизации не требуются бифункциональные агенты или спейсеры, которая происходит исключительно за счет большого количества водородных связей между карбонильными группами полимера и -NH группами полипептидной цепи. Классические методы ковалентной иммобилизации Для более стабильного прикрепления требуется образование ковалентных связей, которые обычно образуются в результате реакции с функциональными группами, присутствующими на поверхности белка. В отличие от нековалентной адсорбции, эти методы можно использовать на немодифицированных белках, поскольку они опираются только на естественно присутствующие функциональные группы. Например, открытые аминные группы остатков лизина легко реагируют с опорами, содержащими активные эфиры, наиболее распространенными из которых являются эфиры N-гидроксисукцинимида (NHS), образуя стабильные амидные связи. Однако одним из недостатков использования NHS-эфиров является их нестабильность в водных условиях, и поэтому присоединение белков в водных буферах будет конкурировать с гидролизом эфира, что может привести к низкому выходу иммобилизации. В качестве альтернативы альдегидные группы могут быть соединены с открытыми аминогруппами с последующим восстановлением с помощью цианоборогидрида натрия или другого реагента с образованием стабильной вторичной аминной связи. Нуклеофильность аминной группы также позволяет проводить реакцию с эпоксидно-функционализированными материалами (диглицидиловыми эфирами). Преимущество этих эпоксидов в том, что они относительно устойчивы к гидролизу при нейтральном pH, что позволяет легко работать с материалами, но может привести к медленному или неполному соединению. Более того, необходимо иметь опоры с наибольшим количеством эпоксидных групп, в условиях, когда они могут быть очень стабильными, чтобы обеспечить длительные реакции фермент-опора и иметь как можно более короткие спейсеры (в основном в третьем поколении эпоксидных опор) для эффективного замораживания структуры фермента. Новые гетерофункциональные опоры или новые варианты использования описанных выше опор могут ускорить реализацию многих промышленных биопроцессов, которые в настоящее время затруднены из-за отсутствия подходящих биокатализаторов. Иммобилизованные ферменты в пищевой промышленности В отличие от фармацевтической промышленности и некоторых отраслей химической промышленности, требования пищевой промышленности заключаются в производстве очень больших количеств продуктов, чувствительных к затратам. В этом случае стоимость биокатализатора (иммобилизованного фермента) должна быть низкой, поэтому он должен демонстрировать хорошую эксплуатационную стабильность, позволяющую проводить большое количество циклов. Очень часто в пищевой промышленности непрерывный поток предпочтительнее периодических процессов, особенно при производстве больших количеств продукции. D-изомераза глюкозы/ксилозы для производства ГФСК представляет собой самый крупный коммерческий процесс с использованием иммобилизованного фермента, как по количеству используемого фермента, так и по объему производимого продукта. Два коммерческих препарата иммобилизованной D-глюкозо/ксилозоизомеразы, которые в основном используются для этих производств, основаны на недорогих неорганических носителях, таких как бентонитовая глина и кизельгур, с ферментом, сшитым глутаровым альдегидом (реагент для иммобилизации фермента, одобренный FDA согласно 21 CFR 173.357). Полученный композит обезвоживается и подвергается механической экструзии перед сушкой в сушилке с псевдоожиженным слоем. Полученные иммобилизованные D-глюкоза/ксилоза изомеразы (Sweetzyme и GenSweet, выпускаемые компаниями Novozymes и Genencor, теперь DuPont Industrial Biosciences, соответственно) чрезвычайно стабильны, с периодом полураспада более одного года при использовании в реакторе с набивным слоем при 60 °C. Липаза CalB для получения этиловых эфиров омега'3 Процесс описывается следующим образом: исходный раствор, содержащий 14% EPA и 15% DHA, 3 эквивалента этанола и перемешивается при 40 °C в присутствии 5% масс/масс иммобилизованной CalB на стироле/дивинилбензоле (Novozym 435) в качестве биокатализатора. После 4 ч реакции было достигнуто более 78% конверсии этилового эфира (ЭЭ) и 22% остатка свободной жирной кислоты (СЖК), а остаток СЖК стал содержать 49% DHA и 6% EPA. Компания Ocean Nutrition Canada Ltd. сообщила о методе модификации омега-3 рыбьего жира с использованием иммобилизованной липазы из Thermomyces lanuginosus (EC 3.1.1.3.) для гидролиза глицерида, с последующим отделением свободных насыщенных жирных кислот FFA от глицеридов и окончательной ферментативной этерификацией гидролизованного глицерида иммобилизованным CalB с полиненасыщенной жирной кислотой в среде без воды. Иммобилизованные ферменты в химической промышленности в химической промышленности биокатализаторы должны генерировать продукты в масштабах тонны, поэтому перерабатываемость является ключевым фактором наряду с селективностью и высоким оборотом реакции. Аминоацилаза для L-аминокислот ранним промышленным применением иммобилизованного фермента было использование аминоацилазы из Aspergillus oryzae (EC 3.5.1.14) для разрешения рацемических смесей аминокислот. Химически синтезированные рацемические N-ацил-DL-аминокислоты гидролизуются при pH 8,5 с получением свободных L-аминокислот и негидролизованных N-ацил-D-аминокислот. Эти продукты легко разделяются дифференциальной кристаллизацией, а N-ацил-D-аминокислоты далее рацемизируются химически (или ферментативно) и перерабатываются. Иммобилизованные ферменты в фармацевтической промышленности Иммобилизация трансаминаз (EC 2.6.1) для промышленного производства API представляет собой первый успешный промышленный пример использования фермента, отличного от серии гидролаз. Первоначальная разработка фермента с использованием комбинации моделирования и направленной эволюции привела к созданию активной и стабильной R-селективной аминной трансаминазы для синтеза ситаглиптина, ключевого блокбастера компании Merck для лечения диабета. Использование органических растворителей необходимо для повышения плохой растворимости ситаглиптина и его производных, поэтому использование неиммобилизованной трансаминазы ограничивает выбор водой и смешивающимися растворителями, такими как диметилсульфоксид (ДМСО), что затрудняет последующую обработку. Напротив, использование иммобилизованной трансаминазы (иммобилизованной путем адсорбции на функционализированном октадецилметакрилате) открывает возможность использовать чистые органические растворители и перерабатывать иммобилизованную трансаминазу без потери активности фермента. Компания Merck сообщила о конверсии >80% в изопропилацетате при очень высокой концентрации субстрата (200 г/л кетоамида и 80 мл/л изопропиламина) при 60 °C. Это отличный пример успеха комбинированного подхода к ферментативной инженерии и оптимизации процесса с использованием иммобилизованных ферментов: этот подход позволил заменить химический процесс, основанный на гидрировании энамина при высоком давлении, на биокаталитический процесс, способный дать 99,5% энантиомерного избытка и конвертировать очень высокие концентрации (до 200 г/л) прозитаглиптина в конечный продукт, используя иммобилизованный фермент в присутствии ДМСО в качестве сорастворителя. ВЫВОД: Иммобилизованные ферменты обеспечивают существенные преимущества для промышленных процессов, в которых они используются в настоящее время. Некоторые из этих преимуществ: упрощение процесса, снижение воздействия на окружающую среду и более устойчивый процесс по сравнению с химическим синтезом. Необходимость разработки более устойчивых и экономичных процессов в сочетании с быстрым прогрессом в разработке ферментов и белковой инженерии, а также преимущества технологии иммобилизованных ферментов показывают светлое будущее для использования биокатализа в промышленных процессах. ЛИТЕРАТУРА: Rodrigues R. C. et al. Immobilization of lipases on hydrophobic supports: immobilization mechanism, advantages, problems, and solutions //Biotechnology advances. – 2019. – Т. 37. – №. 5. – С. 746–770. Beck, J. S., Vartuli, J. C., Roth, W. J., Leonowicz, M. E., Kresge, C. T., Schmitt, K. D., ... & Schlenker, J. (1992). A new family of mesoporous molecular sieves prepared with liquid crystal templates. Journal of the American Chemical Society, 114(27), 10834–10843. Bai, Y., Huang, H., Meng, K., Shi, P., Yang, P., Luo, H., ... & Yao, B. (2012). Identification of an acidic α-amylase from Alicyclobacillus sp. A4 and assessment of its application in the starch industry. Food Chemistry, 131(4), 1473–1478. Schückel, J., Matura, A., & Van Pee, K. H. (2011). One-copper laccase-related enzyme from Marasmius sp.: purification, characterization and bleaching of textile dyes. Enzyme and microbial technology, 48(3), 278–284. Savile, C. K., Janey, J. M., Mundorff, E. C., Moore, J. C., Tam, S., Jarvis, W. R., ... & Hughes, G. J. (2010). Biocatalytic asymmetric synthesis of chiral amines from ketones applied to sitagliptin manufacture. Science, 329(5989), 305–309. DiCosimo, R., McAuliffe, J., Poulose, A. J., & Bohlmann, G. (2013). Industrial use of immobilized enzymes. Chemical Society Reviews, 42(15), 6437–6474. Crabb, W. D., & Shetty, J. K. (1999). Commodity scale production of sugars from starches. Current opinion in Microbiology, 2(3), 252–256. Chen, W. P. (1980). Glucose isomerase. Process Biochem., 30-41. CHIBATA, I. (1982). Application of immobilized enzymes for asymmetric reactions, 195-203 Basso, A., Neto, W., Serban, S., & Summers, B. D. (2018). How to optimise the immobilization of amino transaminases on synthetic enzyme carriers, to achieve up to a 13-fold increase in performances. CHIMICA OGGI-CHEMISTRY TODAY, 36(3), 40-42. |