гистологическая техника. Гистологическая техника. Самостоятельная работа по подготовке к занятию контрольные вопросы по теме занятия
 Скачать 203.69 Kb.
|
|
ЗАНЯТИЕ № 1 ТЕМА ГИСТОЛОГИЧЕСКАЯ И МИКРОСКОПИЧЕСКАЯ ТЕХНИКА. ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ Знать этапы гистологической и микроскопической техники. ЗАДАЧИ ЗАНЯТИЯ Изучить этапы гистологической и микроскопической техники САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА ПО ПОДГОТОВКЕ К ЗАНЯТИЮ КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ПО ТЕМЕ ЗАНЯТИЯ. 1. Определение гистологии как науки, ее разделы и задачи. 2. Значение гистологии, ее место среди биологических и клинических дисциплин. 3. Объекты исследования в гистологии. 4. Краткая история развития гистологии, цитологии и эмбриологии. 6. Научные методы исследования в гистологии. Определение и содержание гистологической техники. Этапы приготовления гистологического препарата. 8. Микроскопическая техника. Правила микроскопирования. 9. Разрешающая способность светового и электронного микроскопа. Гистологическая техника - совокупность способов обработки биологических объектов (клеток, тканей, органов) для исследования их микроскопического строения. Живые ткани доступны прямому наблюдению в прижизненных условиях ив культурах тканей, когда кусочки органов выращиваются в искусственной питательной среде или в организме подопытного животного (например, в подкожной клетчатке. Для изучения фиксированных препаратов используют кусочки ткани и органа, полученные вовремя операции (биопсия) или при вскрытии аутопсия. Для исследования берут как можно более свежий материал. Исследуемые кусочки ткани не должны быть большими, иначе фиксирующая жидкость не проникнет в их толщу. При приготовлении препаратов следует предупредить сморщивание и деформацию кусочков, особенно оболочек. Фиксация объектов исследования является одним из важнейших этапов обработки. Правильная фиксация тканей облегчает последующую гистологическую их обработку, позволяет максимально сохранить структуру объектов и предупредить ее изменения в дальнейшем. По характеру взятого материала различают следующие виды гистологических препаратов а) срезы органов (толщиной 5-15 мкм) б) мазки крови, костного мозга и т.д.) и отпечатки (напр, селезёнки), в) плёнки (брюшины, мягкой мозговой оболочки, или тотальные препараты Чаще всего используются срезы. Приготовление гистологического препарата Приготовление препарата обычно включает 4 следующих этапа а) взятие и фиксация материала б) обезвоживание и уплотнение материала в) приготовление срезов г) окрашивание препаратов и заключение в консервирующую среду. Взятие и фиксация материала 1. Из соответствующего органа вырезают небольшие кусочки (0,5 x 1 x 1 см) и погружают их в фиксатор (формалин, метанол и т.д.) - обычно нач. Фиксация производится для предупреждения процессов аутолиза (самопереваривания) тканей. Это достигается путём денатурации коагуляции) белков. После фиксации образцы промывают проточной водой в течение нескольких часов. Обезвоживание и уплотнение материала 1. Затем образцы уплотняют - чтобы в последующем их можно было резать на микротоме. Часто в качестве уплотнителя используют парафин или целлоидин. 2. Предварительно образцы обезвоживают иначе гидрофобный уплотнитель не сможет проникнуть в ткань. Для этого их проводят по батарее спиртов - 70% , 80% , 96% , 100% этанол - по 24 часа в каждом спирте. Т.к. парафин нерастворим ив этаноле, образцы выдерживают потом в смеси этанол-ксилол ив чистом ксилоле. 3. Заливка помещают образцы в смесь ксилол-парафин и затем в жидкий парафин нач при 52-56 о С. Дают парафину, остывая, затвердеть вырезают из него блок с заключённым образцом и закрепляют на деревянном кубике. Приготовление срезов 1. Кубики вставляют в специальный прибор - микротом, - служащий для приготовления срезов. 2. С помощью микрометрической механической системы объектодержатель вместе с кубиком перемещается за каждый шаг на определённое расстояние напр, 10 мкм. А микротомный нож, направляемый под углом к поверхности парафинового блока, срезает с него тонкой слой органа (срез) заданной толщины. 3. Срезы помещают на поверхность тёплой воды для их расправления, а затем - на предметное стекло. Окрашивание препаратов и заключение в консервирующую среду 1. Перед окрашиванием образцы освобождают от парафина, проводя по батарее растворителей ксилол, спирт 100%, 96%, 80%, 70%, 60%, вода (помин. Этот ряд кончается водой в том случае, если затем используется водорастворимый краситель) 2. Для окрашивания предметные стёкла со срезами помещают на короткое время в раствор красителя, промывают водой, обрабатывают раствором другого красителя (если таковой используется тоже) и вновь промывают водой. 3. Препарат опять обезвоживают проводя по батарее спиртов с возрастающей концентрацией, а затем просветляют в карбол-ксилоле и ксилоле) - для удаления лишней краски. 4. Наконец, на препарат наносят каплю канадского бальзама (в случае среза) или кедрового масла (на мазки крови) и накрывают покровным стеклом. Мазки и тотальные препараты особенности приготовления Примеры тотального препарата - участки сальника или мягкой мозговой оболочки, растянутые на предметном стекле. В подобных случаях, а также при приготовлении мазков, из х перечисленных этапов опускаются два - уплотнение материала и приготовление среза (с последующим освобождением от уплотнителя. Остаются фиксация, окраска и заключение в консервирующую среду. В остальных же случаях (те. при получении срезов) приготовление гистологического препарата - весьма долгая и трудоёмкая процедура. Но при правильном её выполнении полученный препарат может храниться неопределённо долгое время. Методы окрашивания гистологических препаратов Типы красителей Все красители, используемые в гистологической технике, подразделяются на типы Тип красителя Пример Окрашиваемые структуры Кислые красители Кислоты и кислые соли Эозин искусственная краска название - от греч. эос - заря кислый фуксина) Окрашиваемые структуры называются оксифильными имеющими сродство к кислым красителям. б) Это белковые компоненты цитоплазмы и неклеточные структуры (коллагеновые волокна. При использовании эозина приобретают оттенки красного цвета Основные красители Основные соли Гематоксилин (точнее, продукт его окисления - гематеин); азур 2, кармина) Красящиеся структуры базофильные сродство к основным красителям. б) Это структуры, богатые нуклеиновыми или иными кислотами – ядра, рибосомы, аморфный компонент межклеточного вещества. При использовании гематоксилина приобретают оттенки синего цвета Нейтральные красители Смесь двух красителей основного ( азур 2 ) и кислого (эозина) Структуры, воспринимающие кислые красители, окрасятся эозином пример - специфические гранулы в эозинофильных лейкоцитах. б) Ядра всех клеток окрашиваются азуром 2. Специальные красители Судан III, Судан IV, осмий, орсеин. Суданом и осмием окрашиваются жировые капли в которых они растворяется. Орсеином выявляют эластические волокна Существует большое количество различных способов окраски. Те из них, которые встречаются в нашем курсе, перечислены ниже. Общие методы окраски 1. Окраска гематоксилин – эозином 1.а) Самый распространённый метод окраски б) Сочетает основной и кислый красители. в) Поэтому позволяет выявить почти все клетки и многие неклеточные структуры. 2. Ядра приобретают сине-фиолетовый цвет, цитоплазма - желтовато- розовый цвет. 3. Замечание используемый гематоксилин готовится по методу Эрлиха: окисляется до гематеина калийными квасцами. 2. Окраска железным гематоксилином по методу Генденгайна) 1. Препарат предварительно обрабатывают (протравляют) железноаммиачными квасцами, а потом обрабатывают гематоксилином. 2. Структуры приобретают коричневато-серый цвет. 3. Хорошо выявляются структуры ядра, границы клеток, мышечные волокна. Выявление неклеточных структур соединительной ткани 1. Окраска по методу ван Гизона а) Краситель - смесь растворов пикриновой кислоты и кислого фуксина. б) Коллагеновые волокна (содержащиеся в межклеточном веществе соединительной ткани) окрашиваются в ярко-красный цвета элементы других тканей (напр, мышечные волокна) – в жёлтый цвет. 2. Окраска по методу Маллори 1. Краситель является трёхцветным: это смеськислого фуксина, анилинового синего, оранжевогo G, а также двух кислота) Коллагеновые волокна соединительной ткани окрашиваются в тёмно- синий цвет б) многие другие структуры (ядра, мышечные волокна, эритроциты) - в оранжевый или красный цвет. Импрегнация серебром 1. а) Препарат обрабатывают аммиачным раствором серебра, а затем - восстановителями. б) В итоге, выделяющееся серебро осаждается на определённых волокнах соединительной ткани. 2. Ретикулярные (аргирофильные) волокна приобретают чёрный цвет, коллагеновые волокна - коричневый, ядра клеток - светло-коричневый 4. Окраска орсеином Эластические волокна соединительной ткани окрашиваются в тёмно- красный цвет остальные структуры - в слабо - розовый цвет. 5. Окраска гематоксилин-пикрофуксином Эластические волокна окрашиваются пикриновой кислотой в жёлтый цвет, коллагеновые волокна - в красный цвет, ядра клеток - окрашиваются гематоксилином в тёмно-фиолетовый цвет. 6. Окраска по методу Шморля 1. Используется для окраски костей и дентина. 2. а) Предварительно кусочки материала - подвергают декальцинации (с помощью кислоты, а затем выдерживают в растворе алюмокалиевых квасцов. б) Краситель - раствор тионина. 3 . а) Стенки костных полостей и канальцев (выстланные сетью коллагеновых волокон) окрашиваются в тёмно-коричневый цвет б) остальной фон - светло-коричневый Окраска клеток соединительной ткани и крови 1. Окраска азур 2 – эозином Базофильные элементы окрашиваются азуром 2 в тёмно-синий, а оксифильные - в светло-красный цвет. 2. Окраска мазков по методу Романовского. а) Краситель - тот же, что ив предыдущем случае (азур 2 – эозин. б) Отличия же от приготовления срезов таковы фиксацию мазков проводят чистым метанолом окрашивание продолжают всего 30-45 мина не ч для заключения под покровное стекло используют кедровое масло, а не канадский бальзам. 2. Эритроциты приобретают бледно-красный цвет, цитоплазма лейкоцитов - голубой или синий цвет, цитоплазматические гранулы окрашиваются в зависимости от их природы. Выявление элементов нервной системы 1. Импрегнация нитратом серебра. Особенности предварительной обработки препарата. - Фиксацию материала в формалине проводят не менее 7 дней- Уплотнение образца осуществляют не путём заливки в парафин (или целлюлозу, а путём замораживания. Срез готовят на специальном замораживающем микротоме. 2. При окрашивании срез последовательно обрабатывают растворами азотнокислого серебра, формалина, аммиачного серебра. 3. а) Элементы нервной системы (волокна, клетки и т.д.) окрашиваются в чёрный цвет, б) окружающие ткани - в светло-коричневый цвет. 2. Окраска толуидиновым синим по методу Ниссля 1. Толуидиновый синий окрашивает умеренно базофильные соединения в синий цвет 2. Сего помощью в цитоплазме нервных клеток обнаруживаются глыбки базофильного вещества (т.н. субстанция Ниссля). 3. Окраска метиловым зелёным - пиронином по методу Браше 1. Метод служит для выявления РНК. а) Как и предыдущий метод, относится к гистохимическим методам исследования. б) Поэтому подробней описывается ниже. Гистохимические методы исследования Гистохимические методы основаны на специфической реакции между химическим реактивом и определённым компонентом препарата. б) Образующийся продукт реакции имеет окраску, отличную от окраски исходного реактива. РНК Реакция Браше. 1. Реактив (смесь двух красителей метилового зелёного и пиронина). 2. а) Пиронин специфически окрашивает РНК в красный цвет. Поэтому на препарате ядрышки (в составе ядра) и рибосомобогатые участки цитоплазмы имеют красный цвет. б) Другие структуры ядра (помимо ядрышек) - зелёные 3. Обычно делают и контрольный препарат, который перед окрашиванием обрабатывают рибонуклеазой. ДНК Реакция Фёльгена. 1. Основной реактив - фуксинсернистая кислота (реактив Шиффа). 2. ДНК-содержащие структуры окрашиваются в пурпурно-красный цвет Белки Используются различные реакции, в том числе ас бромфеноловым синим (у белков - тёмно-фиолетовая окраска б) со смесью нингидрин-реактив Шиффа (белки приобретают красный цвет. Полисахариды ШИК-реакция. 1. Реактив - Ш ифф-пер и одная кислота (выделенные буквы и составляют аббревиатуру ШИК. 2. Периодат способствует образованию в субстрате альдегидной группы, которая взаимодействует с реактивом Шиффа. 3. На препарате ШИК-положительные компоненты (например, гранулы гликогена) имеют тёмно-красный цвет. Гликозаминогликаны Реакция с толуидиновым синим 1. При взаимодействии толуидинового синего с веществами, содержащими много кислотных групп, наблюдается метахромазия - изменение окраски с синей на фиолетовую и красную. Подобным свойством обладают, в частности, компоненты аморфного вещества соединительной ткани – гликозамингликаны (являющиеся гетерополисахаридами с высоким содержанием кислотных радикалов. Нейтральный жир Реакция с суданом Капли жира в жировой клетке окрашиваются в яркий оранжево-красный цвет благодаря растворению в них красителя. Электронная микроскопия Если в световом микроскопе увеличение составляет 100-1000 раз, тов электронном микроскопе - 10.000 –100.000 рази выше, те. примерно враз больше ТИНКТОРИАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ СТРУКТУР Для того, чтобы хорошо научиться читать гистологические препараты и грамотно их описывать, необходимо иметь представления о тинкториальных свойствах тканей. Под тинкториальнымп свойствами понимают способность тканей и клеток окрашиваться красителями. Для обозначения тинкториальных свойств используют такие термины 1. ОКСИФИЛИЯ - способность клеток и тканей окрашиваться кислыми красителями. Сами структуры при этом имеют основные свойства. Например, эритроциты обладают оксифилией за счет содержания в них основного белка гемоглобина. 2. ЭОЗИНОФИЛИЯ (вариант оксифилии) - способность структур окрашиваться кислым красителем эозином. Эозинофилией обладает цитоплазма многих клеток. 3. АЦИДОФИЛИЯ - тоже, что и оксифилия. 4. БАЗОФИЛИЯ - способность структур окрашиваться основными красителями. При этом сами структуры должны иметь кислую реакцию. Например, нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК) обладают базофилией, т.к. по химическим законам могут связывать красители- основания. Благодаря этому ядро любой клетки в той или иной степени базофильно. Базофилией обладает также цитоплазма белоксинтезирующих клеток из-за содержащейся в рибосомах РНК. 5. ПОЛИХРОМАТОФИЛИЯ - способность структур клетки окрашиваться и кислыми, и основными красителями. Таким качеством обладают, например, гранулы нейтрофильных лейкоцитов. 6. МЕТАХРОМАЗИЯ - способность гистологических структур при связывании красителя изменять его цвет. При этом сами структуры окрашиваются в цвет, который отличается от цвета красителя в растворе. Чаще всего метахромазией обладают углеводные соединения, и появление метахромазии говорит о присутствии сложных углеводов в клетке. 7. АРГЕНТОФИЛИЯ - способность структур окрашиваться солями серебра. 8. ХРОМОФИЛИЯ - способность структур окрашиваться солями хрома. При применяемой в гистологии окраске гематоксилин-эозином ядра клеток окрашиваются в синий или темно-синий цвет, цитоплазма в разные оттенки розового (красного) цвета. В розовый цвет при окраске гематоксилин-эозином красится межклеточное вещество с волокнами, 16 '^ З б З 'З гладкомышечные клетки, поперечно-полосатые мышечные волокна и т.д. Основные этапы приготовления препаратов для электронномикроскопического исследования 1. Взятие и фиксация кусочков тканей и органов. Кусочки тканей размером не более 1 мм быстро помещают в специальные фиксаторы - глутаральдегид, а затем через 1,5 ч - в четырехокись осмия. Для создания оптимального pH (7,3-7,4) используют буферные растворы. Фиксация проводится при комнатной температуре в течение нескольких часов. 2. Промывание кусочков в буферном растворе с pH 7,3-7,4. 3. Обезвоживание в спиртах возрастающей концентрации - 50°, 60°, 70°, 80, 90°, 100°. 4. Заливка производится в специальные синтетические смолы (эпоксидные, эпон+аралдит), которые способны полимеризоваться и затвердевать. Для этого кусочки помешают в капсулы, заливают жидкой эпоксидной смолой, помещают в термостат при С, где смола затвердевает. Таким образом получают блоки. 5. Приготовление срезов. Ультратонкие срезы толщиной 400-800 нм получают на ультратомах с помощью стеклянных или алмазных ножей. 6. Окрашивание (контрастирование) срезов производят солями тяжелых металлов - свинца, вольфрама, уранилацетата. Соли этих металлов осаждаются на структурах клеток и задерживают электроны, проходящие через объект в электронном микроскопе, что обеспечивает появление более темных участков в изображении, те. создание контрастности. МИКРОСКОПИЧЕСКАЯ ТЕХНИКА Микроскопическая техника - техника исследования гистологического препарата в световом или электронном микроскопе. Световая микроскопия подразделяется на стандартную световую микроскопию и специальные методы световой микроскопии. В обеих случаях световой поток, проходя через конденсор микроскопа, концентрируется, далее проходит через гистопрепарат, изменяясь за счет различий преломления гистоструктур препарата. Затем пучок света идет через объектив, в котором формируется изображение. Далее изображение увеличивается системой линз окуляра, после чего воспринимается глазом. Любой микроскоп имеет два основных показателя, характеризующих его возможности 1. Общее увеличение микроскопа - соотношение между линейными размерами полученного в микроскопе изображения объекта и истинными размерами этого объекта. Оно определяется как произведение увеличения объектива на увеличение окуляра микроскопа. Общее увеличение светового микроскопа может теоретически достигать 2500 разно полезное увеличение, те. увеличение, позволяющее выявить детали строения гистологического объекта, составляет не более 1500 раз. 2. Разрешающая способность - наименьшее расстояние между двумя точками объекта, на котором они видны раздельно. Разрешающая способность является более важным показателем микроскопа, чем его увеличение. Повышая разрешающую способность, те. уменьшая расстояние раздельного восприятия двух точек гистологического объекта, исследователь будет видеть все более мелкие детали. Разрешающая способность микроскопа определяется по формуле d = λ/2, где d - расстояние раздельного видения точек объекта, λ - длина волны. СИТУАЦИОННАЯ ЗАДАЧА № 1. Нейтрофильный лейкоцит имеет диаметр около 10 мкм. В его цитоплазме содержатся гранулы размером от 0,1 до 0,5 мкм. Можно ли увидеть их с помощью светового микроскопа Контрольные вопросы 1. Укажите правильное чередование основных этапов приготовления гистологических препаратов 1) фиксация, промывка, обезвоживание, изготовление срезов, заливка в специальные среды, окрашивание срезов и заключение срезов 2) обезвоживание, фиксация, промывка, заливка в специальные среды, изготовление срезов, окрашивание срезов и заключение срезов 3) фиксация, обезвоживание, заливка в специальные среды, промывка изготовление срезов, окрашивание срезов и заключение срезов 4) фиксация, промывка, обезвоживание, заливка в специальные среды, изготовление срезов, окрашивание срезов и заключение срезов 5) фиксация, обезвоживание, промывка, изготовление срезов, окрашивание срезов, заливка в специальные среды и заключение срезов. 2. На каком этапе приготовления гистологических препаратов сохраняется прижизненная структура ткани путём быстрой коагуляции её белков 1) обезвоживание 2) заливка в специальные среды 3) фиксация 4) изготовление срезов 5) окрашивание и заключение срезов 3. На каком этапе приготовления гистологических препаратов придается контрастность структурам ткани 1) фиксация 2) обезвоживание 3) заливка в специальные среды 4) изготовление срезов 5) окрашивание и заключение срезов. 4. На каком этапе приготовления гистологических препаратов придается плотность и однородность взятому материалу 1) фиксация 2) обезвоживание 3) заливка в специальные среды 4) изготовление срезов 5) окрашивание и заключение срезов. 5. На каком этапе приготовления гистологических препаратов достигается определённая толщина взятого материала 1) фиксация 2) обезвоживание 3) заливка в специальные среды 4) изготовление срезов 5) окрашивание и заключение срезов. ЭТАЛОНЫ ОТВЕТОВ НА ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ 1. - 4, 2. - 3, 3. - 5, 4. - 3, 5. – 4 1. Методы окрашивания гистологических препаратов основаны на 1) различной кислотности (рН) ядра и цитоплазмы 2) осаждении металлов из солевых растворов на плотных структурах клетки 3) химическом взаимодействии красящих реактивов с определёнными компонентами клетки 4) прижизненном окрашивании клеток и тканей 5) всё вышеперечисленное. 2. Избирательная окраска ядра и цитоплазмы основана на 1) разнице рН структур клетки 2) осаждении металлов из солевых растворов 3) химическом взаимодействии красящих реактивов с определёнными компонентами клетки 4) прижизненном окрашивании 5) всё вышеперечисленное. 3. Импрегнация основана на 1) разнице рН структур клетки 2) осаждении металлов из солевых растворов 3) химическом взаимодействии красящих реактивов с определёнными компонентами клетки 4) прижизненном окрашивании 5) всё вышеперечисленное. 4. Выявление химического состава клеток и тканей основано на 1) разнице рН структур клетки 2) осаждении металлов из солевых растворов 3) химическом взаимодействии красящих реактивов с определёнными компонентами клетки 4) прижизненном окрашивании 5) всё вышеперечисленное. 5. Метод изучения гистологических препаратов, основанный на различном преломлении света в зависимости от плотности структур 1) темного поля 2) фазового контраста 3) радиоавтографии 4) цитофотометрии; 5) морфометрии. ЭТАЛОНЫ ОТВЕТОВ НА ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ 1. – 5, 2. – 1, 3. – 2, 4. – 3, 5. – 2. |