изготовление гистологических препаратов. Занятие 1.Основы техники приготовления гистологических препарато. Занятие 1 Основы техники приготовления гистологических препаратов. Этические принципы при работе с лабораторными
 Скачать 156.55 Kb.
|
|
Модульная единица 1.1. Цитология. Общая гистология. Занятие 1.1.1. Основы техники приготовления гистологических препаратов. Этические принципы при работе с лабораторными животными Знакомство с оборудованием и аппаратурой гистологической лаборатории. Техника микроскопирования. 1.Введение. Овладение знаниями в области гистологии и эмбриологии не мыслится без изучения микроскопических и ультрамикроскопических структур с помощью светового и электронного микроскопов. Поэтому главным содержанием практических занятий является изучение с помощью светового микроскопа гистологических препаратов. Гистологический препарат является объективным из источников наших сведений о микроскопическом строении тканей и органов животных и человека и о процессах их развития. Основными видами работы на лабораторных занятиях по гистологии является самостоятельное микроскопирование гистологических препаратов, анализ структурных и тинкториальных особенностей препаратов, по которым можно судить о функциональном состоянии изучаемых клеток, тканей и органов. 2.Актуальностиь темы занятия. Успешное овладение микроскопической техникой и техникой гистологического исследования создает условия для более глубокого и успешного изучения материала. На практическом занятии приобретаются навыки работы с препаратом, умения анализировать наблюдаемые структуры, давать им оценку и делать правильные выводы. 3.Цель занятия. В результате работы на практическом занятии студент должен знать: − методы исследования в гистологии; − содержание основных этапов изготовления фиксированного и окрашенного гистологического препарата; − принципы окраски гистологических препаратов и тинкториальные свойства гистологических структур; − принципы работы приборов специальной микроскопии; уметь микроскопировать: − самостоятельно изготовленные гистологические препараты; − гистологические препараты почки; уметь рисовать схемы гистологического строения: − почки млекопитающего Задачи занятия. Получение представлений о предмете, освоение и закрепление в памяти техники микроскопирования гистологического препарата, выработка представлений о сущности и содержании основных этапов изготовления гистологического препарата, самостоятельное изготовление гистологического препарата, получение представлений о тинкториальных свойствах окраски животных клеток. 4.План изучения темы: 1.Контроль исходного и текущего уровня знаний (тесты, ситуационные задачи) 2.Теоретический блок: устное обсуждение контрольных вопросов, подлежащих рассмотрению с корректировкой уровня знаний 3.Практическая часть занятия - изучение гистологических препаратов и оформление рисунков в тетради 4.Итоговый контроль практической работы (проверка рабочих тетрадей обучающихся, контроль и оценивание выполнения практической части занятия) 5. Домашнее задание 4.1.Контроль исходного уровня подготовки обучающихся (тесты, ситуационные задачи) 4.2.Теоретический блок: 4.2.1. Теоретические вопросы, подлежащие рассмотрению: 1. Гистология и ее разделы. Основные методологические принципы отечественной гистологии. 2. Крупнейшие отечественные гистологические школы: Московская, Петербургская, Казанская, Киевская. История кафедры гистологии ТГМА и ее научное направление. 3. Экспериментальные методы исследования в гистологии (методы культуры тканей “in vivo” и ”in vitro”, методы трансплантации и др.). 4. Связь гистологии с медико-биологическими и клиническими дисциплинами. 5. Этические принципы при работе с лабораторными животными 6. Основные этапы приготовления гистологических препаратов. 7. Принципы окраски гистологических препаратов. Классификация красителей. Понятия оксифилии и базофилии. 8.Виды микроскопов. Основные части светового микроскопа. Правила микроскопии. 4.2.2. Этические принципы при работе с лабораторными животными Для успешной борьбы с множеством болезней, поражающих человека, для расширения медицинских знаний и представлений о патогенезах, весьма важными являются экспериментальные исследования, проводимые на живых объектах – лабораторных животных. Такие исследования должны проводиться с соблюдением определенных нравственных норм, которые обязательны при проведении экспериментов на животных во всех цивилизованных странах мира. Основные этические принципы работы использования животных в экспериментах сформулированы в «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях» (Страсбург, 1987). В этом документе для научных работников и общественных организаций по защите животных, сформулированы теоретические принципы и этические правила, которые могут быть приняты за основу при разработке регламентирующих мер и нормативных документов в отношении использования животных для биомедицинских исследований. В нашей стране действует Федеральный закон о защите животных от жестокого обращения (1997) Важно, чтобы страдания животных при проведении экспериментов были минимальными. С этой целью, при проведении болезненных процедур используются анестетики. Показана эвтаназия – гуманное умерщвление животного, проводимое под руководством ответственного лица, в виде передозировки наркоза. Все эти обстоятельства необходимо учитывать при заборе морфологического материала от животных для изготовления гистологических препаратов с учебной или научной целью. 4.2.3.Знакомство с этапами приготовления гистологического препарата Процесс обработки материала для изготовления гистологических препаратов слагается из следующих этапов: 1. Взятие материала. Из органа вырезается кусочек, размеры которого не должны превышать 1-куб.см. 2. Фиксация материала. Фиксация проводиться для того, чтобы остановить в тканях протекающие жизненные процессы и предупредить последующий их распад. Фиксирующие жидкости: 10-12% водный раствор формалина, разные спирты, сложные фиксаторы: жидкости Карнуа, Буэна и т.д. 3. Обезвоживание, обезжиривание и уплотнение материала. Этот процесс осуществляется в спиртах возрастающей крепости и в растворах спирта с эфиром в следующей последовательности: Зафиксированный кусочек материала проводят через батарею спиртов: 50, 70, 96 градусов (две порции), абсолютный спирт, абсолютный спирт+хлороформ (две порции). В каждом отмеченном растворе кусочек находиться не менее суток. Непосредственно перед заливкой материал выдерживают в 2-х порциях чистого хлороформа по 3 часа, и в смеси парафина и хлороформа в равных пропорциях. 4.Заливка материала. Заливка материала производится в парафин, целлоидин или желатин. Заливка проводится с целью предать материалу такую консистенцию, чтобы можно было изготовить очень тонкие пластинки- гистологические срезы. Чаще всего заливают в парафин. Вначале материал пропитывают жидким парафином в термостатах при высокой температуре, а затем на воздухе при комнатной температуре заливают в парафин, который застывает и становиться твердым. Залитый материал называют гистологическим блоком. Гистологические блоки могут долго храниться. 5. Приготовление гистологических срезов. Залитый в парафин кусочек материала приклеивают на деревянную основу, укрепляют на предметном столике микротома. Микротом это прибор, оснащенный микротомным ножом, с помощью которого можно изготавливать очень тонкие гистологические срезы толщиной 3-5 микрометров. Полученные с помощью микротома тонкие гистологические срезы наклеиваются на обезжиренное чистое предметное стекло. 6. Окраска гистологических срезов. Различные тканевые элементы избирательно относятся к красителям, что позволяет их дифференцированно окрасить. Ядра клеток окрашиваются основными красителями- гематоксилином, азуром, кармином и др. Цитоплазма клеток, межклеточное вещество окрашиваются кислыми красителями- эозином, фуксином и др. Перед окраской препараты депарафинируют, выдерживая их в 2-х порциях ксилола или толуола, затем помещают в две порции абсолютного спирта, после чего их окрашивают, используя соответствующие методики. 7. Обезвоживание и просветление окрашенных срезов и заливка их в бальзам. Окрашенные срезы обезвоживают в 2-х порциях 96 градусного спирта, просветляют в карбол-ксилоле. переносят посредством шпателя на предметное стекло, наносят на срез каплю бальзама и накрывают покровным стеклом. Препарат готов для исследования и может храниться долгое время. Каждый студент должен приготовить 2 препарата: один- из растительной, другой из животной ткани. 4.2.4. Цель и принципы окрашивания гистологических препаратов. Окрашивание срезов производят для того, чтобы в проходящем свете микроскопа можно было отчетливо рассмотреть только такие части, которые отличаются друг от друга различным преломлением световых лучей. Клетки и ткани животного происхождения обладают избирательной способностью воспринимать разные красители. Это позволяет определять в окрашенном препарате различные структуры. Свойства красителей, принципы окрашивания. Красители классифицируются по происхождению и химическим свойствам. По химическим свойствам они делятся на кислые и основные красители. К группе кислых красителей относятся кислый фуксин, пикрофуксин, пикриновая кислота и эозин. Чаще всего мы будем изучать срезы, обработанные эозином, который окрашивает протоплазму, оболочку клеток, межклеточное вещество соединительной ткани в розовый цвет. По происхождению эозин искусственный краситель. Микроскопические структуры окрашиваемые эозином и подобным ему структурами, называются эозиноофильными или оксифильными, или ацидофильными. Способность воспринимать эти красители называется эозинофилией или оксифилией, или ацидофилией. К группе основных красителей относятся: кармин, сафранин, метиловый синий, азур, гематоксилин, который по способу приготовления краски бывает гематоксилин Майера, Бемера, Вейгерта, железным гематоксилином Гейденгайна. Красящие свойствами обладают не сам гематоксилин, а продукт его окисления. Гематоксилин это краситель растительного происхождения. Гематоксилин окрашивает структуры в синий или фиолетовый цвет. Очень ярко гематоксилин окрашивает ядра клеток. Структуры, окрашиваемые основными красителями будут называться базофильными. Свойство воспринимать эти красители называется базофилией. Изучаемые нами препараты чаще всего будут окрашены гематоксилином. Кармин, также ядерный краситель, но животного происхождения, вырабатывается из насекомых кошенили, живущих на кактусовых деревьях. Большинство же красителей получены синтетическим путем (искусственные краски). Чаще всего на занятиях будут использоваться препараты, окрашенные гематоксилином и эозином. Это самая распространенная гистологическая обзорная окраска. Существуют красители со специальными свойствами, позволяющие выявлять разные вещества и структуры клеток. Судан-3 окрашивает жировые включения в оранжевый цвет. Осмиевая кислота окрашивает жир в черный цвет. Импрегнация азотнокислым серебром нервной ткани позволяет выявить ее компоненты, окрашиваемые черным цветом. Гликоген выявляется кармином Беста. Такие красители называются гистохимическими. Рецепт для самостоятельной окраски срезов А. Из животных тканей 0. Абсолютный спирт 2 мин. 1. Гематоксилин 2 мин. 2. Вода водопроводная 2 мин. 3. Эозин 1 мин. 4. Вода дистиллированная 2 мин. 5. Спирт 96 % 2 мин. 6. Спирт 96% 1 мин. 7. Карбол-ксилол 2 мин. 8. Заключить срез в бальзам Б.Из растительной тканей 1. Взятие материала ( вырезать пленку лука) 2. Фиксация лука в 96% спирте 2 мин 3. Гематоксилин 2 мин. 4. Вода водопроводная 1 мин. 5. Спирт 96 % 2 мин. 6. Спирт 96 % 1 мин. 7 Карбол-ксилол 3 мин. 8. Заключить срез в бальзам 4.2.5. Освоение принципов микроскопирования и зарисовки гистологических препаратов. Правила работы с микроскопом. 1. Установить микроскоп у края стола напротив левого плеча. С правой стороны расположить открытую тетрадь для практических занятий. Протереть окуляр марлевой салфеткой. Обратить зеркало микроскопа вогнутой стороной к источнику света. 2. Привести микроскоп в рабочее состояние: а) установить объектив малого увеличения на расстоянии 1-1,5 см от предметного столика; б) поднять конденсор до предела; в) глядя в окуляр одним глазом, не закрывая другого, равномерно и интенсивно осветить поле зрения микроскопа, настраивая зеркало на источник света 3. Поместить препарат на предметный столик микроскопа покровным стеклом кверху (обратить на это внимание). Передвигать препарат большим и указательным пальцами за ребро с тем, чтобы найти место, подлежащее к изучению; средний палец должен упираться в предметный столик. 4. Опустить конденсор до положения, обеспечивающего наилучшее освещение препарата на “малом” увеличении. 5. Рассмотреть препарат с помощью 8- или 10-кратного объектива, который чаще будет называться “малым увеличением”. Найти место, подходящее для изучения при большом увеличении, поставить его в центр поля зрения. Отрегулировать резкость микровинтом. 6. При переходе с малого увеличения на большое, необходимо, не меняя фокусного расстояния, повернуть револьверную головку объективов так, чтобы в рабочее положение встал 40-кратный объектив, который чаще будет называться “большим увеличением”. Микровинтом добиться четкого изображения. Работа с макровинтом на большом увеличении запрещается, т.к. легко можно раздавить препарат. 7. Левая рука должна находится на микрометрическом винте, слегка поворачивая его в обе стороны для просматривания деталей среза, лежащих на разной глубине. 8. Уяснив пространственное положение, пропорции и взаимоотношения деталей изучаемого объекта, приступить к зарисовке. 9. Запрещается убирать препарат из под объектива большого увеличения! Для того, чтобы убрать препарат с предметного столика микроскопа, в рабочее положение ставится объектив малого увеличения и только после этого препарат снимается с предметного столика микроскопа. 10. Запрещается развинчивать какие-либо части микроскопа. В случае неисправности микроскопа обращаться к преподавателю. Реконструктивный подход к изучаемым структурам. При изучении гистологического препарата необходимо помнить, что в поле зрения микроскопа элементы тканевых структур представляются, за небольшим исключением, в разрезе. Воссоздание целостности структур необходимо путем воображаемой реконструкции в сознании исследователя. В отдельных случаях структура, в целом, может быть воспроизведена посредством графической или пластической реконструкции по многим строго последовательным или серийным срезам. Желающий научиться микроскопировать должен стремиться выработать у себя трехмерное представление о микроскопических структурах. При анализе полых органов необходимо учитывать характер среза (поперечный, продольный, тангенциальный). Цель зарисовки. Изучение препаратов должно сопровождаться их зарисовкой. Зарисовка микроскопических картин представляет важный методический прием при исследовании клеток, тканей, органов. Зарисовка помогает сосредоточить внимание на изучаемых объектах, выделить их детали, которые являются очень важными, но могут остаться незамеченными при простом просмотре препарата. Процесс зарисовки учит студента «читать» препарат, понимать своеобразие и общность различных клеток и тканей, глубже осмысливать их морфологические, генетические и функциональные особенности. Рисунок препарата позволяет лучше запомнить препарат, закрепляется его зрительное представление, что способствует лучшему и более глубокому восприятию фактического материала. Зарисовка включает в себя элемент самоконтроля. Кроме того, зарисовка препарата это способ документирования и подтверждения факта микроскопии и освоения студентом препарата. 4.3. Практическая работа обучающихся. Изучение и зарисовка гистологических препаратов. ПРЕПАРАТ № 65. Кубический эпителий канальцев почки Окраска: гематоксилин и эозин. 1. Протереть поверхность препарата марлевой салфеткой. Осмотреть препарат, прочесть название и номер препарата. 2. Расположить препарат на предметном столике микроскопа покровным стеклом вверх. 3. Макровинтом отрегулировать резкость изображения при “малом” увеличении микроскопа. 4. Обратить внимание на избирательность окраски структур препарата. Фиолетовым или темно-синим цветом с помощью гематоксилина окрашены ядра клеток (базофильные свойства), которые выявляются в различных участках препарата и имеют округлую, овальную или уплощенную форму. Розового цвета - эозином, окрашены большинство структур препарата и их содержимое, проявляющие оксифильные свойства. 5. Помня о том, что мы изучаем плоскостной срез, необходимо представить видимые структуры в объемном изображении. В поле зрения изучаемого препарата видны множественные структуры – эпителиальные трубочки округлой формы – это почечные канальцы. Их стенка образована эпителиальными клетками и окрашена в розовый цвет эозином. Между канальцами расположена соединительная ткань, также окрашенная в розовый цвет эозином, в ней располагаются клетки, волокна и аморфное вещество, а также здесь имеются кровеносные сосуды. 6. После общего обзора препарата, необходимо изучить его при большом увеличении. Разрешающая способность микроскопа не позволяет в большинстве случаев рассмотреть оболочки клеток. В связи с этим необходимо помнить закон: “Форма ядер повторяет форму клеток”. В каждой клетке имеется округлой формы ядро, окрашенное гематоксилином в фиолетовый цвет. С учетом формы ядра, очевидно, что стенка почечных канальцев образована одним слоем кубических клеток. Формируя слой, круглые клетки сдавливают друг друга, превращаясь в кубические. Между канальцами в соединительной ткани по форме окрашенных ядер можно установить наличие веретенчатых клеток. Рассматривая кровеносные сосуды, обратите внимание, что они имеют вид полых трубочек, с тонкой стенкой. В стенке видны ядра уплощенной формы, окрашенные гематоксилином в фиолетовый цвет, а цитоплазма и границы клеток окрашены эозином в розовый цвет. Следуя заключению о соответствии формы ядра и формы клетки, можно предположить, что клетки стенки сосуда имеют уплощенную форму. Таким образом, окрашенный препарат дает возможность убедиться в наличии тинкториальных свойств у клеток животного происхождения, а также позволяет изучать особенности структуры органов, тканей и клеток. Чтобы подойти осмысленно к изучению препаратов, необходимо знать теоретический материал по их строению имеющихся в нем структур. Следующим этапом вашей работы является оформление рисунка с изученного препарата. Зарисовку целесообразней проводить непосредственно с самого препарата, а не с готового рисунка, атласа или таблицы. Рисовать сразу в тетрадь без черновиков. При зарисовке надо соблюдать соотношения в размерах отдельных частей объекта. Размер рисунка должен примерно занимать 1/4 часть страницы. Зарисовка производится только цветными карандашами. Зарисовать 2-3 канальца. Стенку канальца и элементы соединительной ткани изобразить при большом увеличении полусхематично, вырисовывая при этом границы клеток, волокна, аморфное вещество, кровеносные сосуды. Последним этапом при оформлении рисунка обозначение основных структурных компонентов изучаемого объекта. Рядом с рисунком описать последовательно все структуры объекта, изученные в срезе, обозначить их на рисунке. При этом можно использовать различные буквенные и цифровые символы: I. Каналец: 1. Клетка канальца: а- оболочка б- ядро в- цитоплазма 2-Базальная мембрана II. Соединительная ткань. III. Кровеносный сосуд 4.4.Итоговый контроль. Проверка рабочих тетрадей обучающихся, контроль и оценивание выполнения практической частизанятия. 4.5.Домашнее задание. 1.Самоподготовка по контрольным вопросам темы следующего занятия 6. Рекомендуемая литература Основная литература (О.Л.) 1. Гистология цитология и эмбриология: учебник /Ю.И..Афанасьев [и др.]; ред. Ю.И.Афанасьев, Н.А. Юрина.- 6-е изд., перераб. И доп. – М.: ГЭОТАР-Медиа,2013, 2014, 2016 – http://www.studmedlib.ru 2. Гистология, цитология и эмбриология. Атлас [Электронный ресурс]: учебное пособие / Быков В.Л., Юшканцев С.И. – М.: ГЭОТАР – Медиа, 2013, 2015 – http://www.studmedlib.ru Дополнительная литература (Д.Л.) 1. Руководство по гистологии. В 2-х томах./ ред. Р.К.Данилов.-2-е изд., испр. и доп. – Санкт-Петербург: Спец-Лит, 2011.- 511 с. 2. Атлас по гистологии, эмбриологии, цитологии. Кузнецов С.Л., Мушкабаров Н.Н., Горячкина В.Л.- Москва: МИА, 2010. - 376 с. 3. Гистология, эмбриология, цитология: учебник с приложением на компакт-диске / ред.Э.Г.Улумбеков, ред.Ю.А.Челышев. – 3-е изд., испр. и доп. – М.: ГЭОТАР – Медиа, 2016 - http://www.studmedlib.ru 4. Гистологическая техника: учебное пособие / В.В.Семченко[и др.]. – Омск: Омская областная типография, 2006. – 290 с. |