Сложные белки. Биле Сложные белки. Классификация. Характеристика отдельных классов. Представители
 Скачать 1.95 Mb.
|
|
3.Современные методы ДНК-диагностики. ПЦР. Применение в медицине. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – высокоточный метод молекулярно-генетической диагностики, который позволяет выявить у человека различные инфекционные и наследственные заболевания, как в острой и хронической стадии, так и задолго до того, как заболевание может себя проявить. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в 1983 году разработал Кэри Мюллис (США), за что в 1993 году он удостоен Нобелевской премии в области химии. Преимущества ПЦР-диагностики в современной медицине: • Непосредственное выявление присутствия возбудителя (а именно, специфического участка ДНК или РНК возбудителя) в исследуемом образце. • Высокая специфичность позволяет определять уникальный участок ДНК или РНК, характерный для конкретного возбудителя, что исключает возможность ложных реакций. • Высокая чувствительность метода ПЦР позволяет обнаружить даже единичные клетки возбудителей (вирусов, бактерий). Чувствительность ПЦР-анализа составляет 10-1000 клеток в исследуемом образце (к примеру, чувствительность иммунологических и микроскопических тестов - всего 103-105 клеток). • Разработка универсальной методики ПЦР для обнаружения различных возбудителей. Объектом для исследования методом ПЦР служит генетический материал (ДНК, РНК) возбудителя. Методика позволяет выявлять несколько возбудителей из одной биологической пробы. • Достаточно быстрое получение результата анализа. Полное исследование проводится за 4-4,5 часа, реже – несколько дольше. • Возможность обнаружения патогенов до возникновения симптомов заболевания (доклиническая диагностика) и после прошедшей болезни (ретроспективная диагностика). Примером доклинической диагностики будет обследование в инкубационный период (с момента заражения до возникновения жалоб больного), а также латентная инфекция (когда симптомов нет совсем, а есть только лабораторные данные – ПЦР, к примеру). Одним из важных моментов ПЦР-диагностики является проведение ПЦР в архивном материале или биологических остатках, что важно для идентификации личности или отцовства. На чем основан метод ПЦР Основой полимеразно-цепной реакции является многократное удвоение (амплификация) определённого участка ДНК или РНК при помощи ферментов в лабораторных условиях. В результате образуется то количество ДНК или РНК, достаточное для визуального анализа. В ходе исследования копируется только тот участок, который подходит под заданные условия, и только в ситуации присутствия его в исследуемой пробе. Например, материал для исследования, в котором предполагается наличие фрагментов ДНК или РНК возбудителя (слюна, кровь, моча, выделения из половых органов), помещается в специальный реактор (амплификатор). Далее к нему добавляются специфические ферменты, которые связываются с ДНК или РНК патогена, и происходит синтез ее копии. Это копирование идет в несколько этапов по типу «цепной реакции», и в конечном итоге из одной копии генетического материала могут образоваться сотни и тысячи копий. Затем идет анализ и сравнение результата с имеющейся базой данных о строении различных возбудителей. Посредством ПЦР можно не только выявить тип возбудителя, но и выдать количественный результат анализа, то есть как много возбудителей в организме человека. Метод ПЦР в настоящее время расширяет круг возможностей проводимых исследований: введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК, и получил широкое распространение в медицине, к примеру, для установления отцовства, появление новых генов и прочее. Какие инфекции можно выявить с помощью ПЦР-диагностики 1) ВИЧ-инфекция (можно выявить вирус иммунодефицита человека ВИЧ-1) 2) Вирусные гепатиты А, В, С, G ( РНК-HAV, ДНК-HBV, РНК-HCV, РНК-HGV) 3) Инфекционный мононуклеоз (ДНК вируса Эпштейн-Барр -ВЭБ) 4) Цитомегаловирусная инфекция (ДНК-CMV) 5) Герпетическая инфекция (ДНК- вируса простого герпеса ВПГ 1 и 2 типа) 6) ИППП (инфекции, передающиеся половым путем) – уреаплазмоз, гарднереллез, хламидиоз, микоплазмоз, трихомониаз, 7) Туберкулез (микобактерия туберкулеза) 8) Онкогенные вирусы – папилломавирусная инфекция (вирус папилломы человека (в том числе его онкогенные виды 16, 18, 31, 33, 45, 51, 52, 56, 58, и 59) 9) Боррелиоз, клещевой энцефалит 10) Листериоз 11) Кандидоз (грибы рода Candida) 12) Хеликобактерная инфекция (Helicobacter pylori) и другие Учитывая спектр возбудителей, ПЦР-диагностика активно используется в гинекологической, урологической практике, практике инфекциониста, в пульмонологии, фтизиатрии, гастроэнтерологии, гематологии, онкологии и других. Материал для исследования и правила его забора Материалом для ПЦР-исследования, в котором можно выявить чужеродную ДНК бактерии или ДНК или РНК вируса могут служить различные биологические среды и жидкости человека: слизи, моче, крови, мокроте, соскобе эпителиальных клеток, тканях плаценты, крови, соке простаты, околоплодные воды, плевральная жидкость. При обследовании на инфекции, передающиеся половым путем (ИППП), у мужчин и женщин забираются выделения из половых органов, мазок или соскоб из шейки матки, мазок или соскоб из уретры (мочеиспускательного канала), моча. При обследовании на инфекции (герпетические инфекции, ЦМВИ, мононуклеоз, токсоплазмоз, гепатиты В, С, ВИЧ-инфекция) на ПЦР забирают кровь. Для диагностики инфекционного мононуклеоза, ЦМВИ, герпетической инфекции забирается мазок из зева, для обследования на ЦМВИ – моча. Нередко для обследования на поражение нервной системы при ряде исследований забирается спинномозговая жидкость. В пульмонологии материалом служит мокрота, плевральная жидкость. При обследовании на внутриутробные инфекции – околоплодные воды, ткани плаценты. Подготовка к сдаче материала и проведению ПЦР-диагностики Практически все пациенты, которым проводится ПЦР-диагностика, вправе рассчитывать на достоверный, точный и быстрый результат, зависящий в большой степени от возможности лаборатории, профессионализма врача-лаборанта. Вместе с тем, многие не задумываются, что эта самая достоверность во многом зависит и от нас самих, а именно от рекомендаций лечащего доктора, образа жизни и правильности забора материала. При заборе материала требуются условия, исключающие контаминацию (загрязнение) материала и, соответственно, ставящие под сомнение объективность анализа. Правильная подготовка к сдаче материала не представляет особых сложностей. Существуют следующие рекомендации врачей для пациентов: 1) не жить половой жизнью за сутки до сдачи материала; 2) кровь для исследования сдается утром натощак (не есть, не пить); 3) при сдаче мочи собирается первая утренняя порция в чистый стерильный контейнер. Сроки готовности ПЦР-анализа Окончательный результат готов через 1,5-2х суток после сдачи материала. В некоторых случаях результат готов в первый же день. Расшифровка результатов ПЦР Отрицательный результат ПЦР указывает на то, что в исследуемом материале на момент его сдачи не обнаружено никаких следов инфекционных агентов. Большинство случаев показывает отсутствие инфекции, которую пытались найти в исследуемой пробе. Положительный результат ПЦР указывает на выявление следов инфекции в исследуемой биологической пробе. С большой точностью положительный результат указывает на наличие инфекции в данный момент времени. Существуют ситуации, когда ПЦР оказывается положительной, а об активной инфекции говорить нельзя – это так называемое «здоровое носительство» без клинических симптомов болезни, которое не требует лечения, но требует динамического наблюдения у врача. Наблюдается чаще при ряде вирусных инфекций (ВПЧ, ЦМВИ, ВЭБ-инфекция, герпетическая инфекция и другие) в таких материалах как слюна, соскоб цервикального канала, уретры, то есть из местного очага. Однако нельзя забывать, что передача инфекции от носителей здоровым людям возможна, как и возможен переход в хроническую форму болезни с активацией процесса. Если же ПЦР положительна в крови, то это уже не носительство и требует специфического лечения. Количественный результат ПЦР оценивается только врачом индивидуально для той или иной инфекции отдельно и не имеет общих градаций. На основании количественного результата ПЦР врач может установить степень активности инфекции и выставить стадию болезни, что безусловно отразится на курсе и дозах назначенных лекарственных средств. Один из последних волнующих вопросов: насколько точна ПЦР-диагностика? Для ПЦР анализа существует 3 определения: 1. Точность (с высокой долей вероятности возможно выявление или отсутствие инфекции). 2. Специфичность (точность выявления конкретной инфекции). 3. Чувствительность (даже при низком содержании генетического материала возбудителей в исследуемом образце инфекция будет обнаружена). Полимеразно-цепная реакция практически не выдает ложноположительных результатов (то есть не бывает положительных проб там, где инфекция отсутствует). Ложноотрицательные результаты наблюдаются редко (чаще это связано с отсутствием активной инфекции у человека в данный момент). Например, латентная инфекция, хроническая инфекция вне активности. Билет 2 1. Структурная организация нуклеиновых кислот… Первичная структура – определенная последовательность нуклео-тидов в цепи. Образована фосфодиэфирными связями. Начало цепи – 5'-конец (на его конце фосфатный остаток), конец, завершение цепи, обозначается как 3'(ОН)-конец. Как правило, в образовании самой цепи азотистые основания не участвуют, но водородные связи между комплементарными азотистыми основаниями играют важную роль в формировании вторичной структуры НК: · между аденином и урацилом в РНК или аденином и тимином в ДНК образуются 2 водородные связи, · между гуанином и цитозином – 3. Для НК характерна линейная, а не разветвленная структура. Кроме первичной и вторичной структуры для большинства НК характерна третичная структура – например, ДНК, тРНК и рРНК. РНК (рибонуклеиновые кислоты). РНК содержится в цитоплазме (90%) и ядре. По структуре и функции РНК делятся на 4 вида: 1) тРНК (транспортные), 2) рРНК (рибосомные), 3) мРНК (матричные), 4) яРНК (ядерные). Матричные РНК. На их долю приходится не более 5% всей РНК клетки. Синтезируется в ядре. Этот процесс называется транскрипцией. Представляет собой копию гена одной из цепей ДНК. Во время биосинтеза белка (этот процесс называется трансляцией) проникает в цитоплазму и связывается с рибосомой, где и происходит биосинтез белка. В мРНК содержится информация о первичной структуре белка (последовательности аминокислот в цепочке), т.е. последовательность нуклеотидов в мРНК полностью соответствует последовательности аминокислотных остатков в белке. 3 нуклеотида, кодирующие 1 аминокислоту, называются кодоном. Свойства генетического кода. Совокупность кодонов составляет генетический код. Всего в коде 64 кодона, 61 – смысловые (им соответствует определенная амино-кислота), 3 – нонсенс-кодоны. Им не соответствует какая-либо аминокислота. Эти кодоны называются терминирующими, так как подают сигнал о завершении синтеза белка. 6 свойств генетического кода: 1) триплетность(каждая аминокислота в белке кодируется последовательностью из 3 нуклеотидов), 2) универсальность(един для всех типов клеток – бактериаль-ных, животных и растительных), 3) однозначность(1 кодону соответствует только 1 аминокис-лота), 4) вырожденность(1 аминокислота может кодироваться несколькими кодонами; только 2 аминокислоты – метионин и триптофан имеют по 1 кодону, остальные – по 2 и более), 5) непрерывность(генетическая информация считывается по 3 кодона в направлении 5'®3' без перерывов), 6) колинеарность(соответствие последовательности нуклео-тидов в мРНК последовательности аминокислотных остатков в белке). Транспортные РНК. Составляют 12-15% от всей РНК в клетке. Количество нуклеотидов в цепи – 75-90. Акцепторный участок – место прикрепления аминокислоты, имеет у всех тРНК одну последовательность ЦЦА Функции петель: антикодоновая петля – распознает кодон мРНК, D-петля – для взаимодействия с ферментом во время биосинтеза белка, TY-петля – для временного прикрепления к рибосоме во время биосинтеза белка, дополнительная петля – для уравновешивания вторичной структуры тРНК. Биологическая роль тРНК: · транспортная (доставляет аминокислоту к месту синтеза белка, к рибосоме), · адапторная (распознает кодон мРНК), переводит шифр нуклеотидной последовательности в мРНК в последователь-ность аминокислот в белке. Рибосомные РНК, рибосомы. На их долю приходится до 80% от всей РНК клетки. Образуют «скелет», или остов рибосом. Рибосомы – нуклеопротеиновые комплексы, состоящие из большого количества рРНК и белков. Это «фабрики» по биосинтезу белка в клетке. Состав, строение и биологическая роль ДНК. Состав ДНК – соблюдается строгое соотношение азотистых оснований в 2 цепях ДНК, которые определяются Правилами Чаргафа. Правила Чаргафа: Количество комплементарных азотистых оснований равно (А=Т, Г=Ц). Молярная доля пуринов равна молярной доле пиримидинов (А+Г=Т+Ц). 1) Первичной структурой белковой молекулы называется линейная полипептидная цепь из АМК, соединенных между собой пептидными связями, в генетически определенной строгой последовательности. При этом на одном конце имеется АМК со свободной аминогруппой (N-конец), а с другой- со свободной карбоксильной группой (С-конец). Пример с первич. структорой-инсулин. 2) Вторичная структура белка представляет собой способ укладки линейной полипептидной цепи в упорядоченную структуру, благодаря образованию водородных связей между пептидными группами одной цепи или смежными полипептидными цепями. По образующейся при этом конфигурации вторичная структура может быть спиральной(альфа-спираль) или слоисто-складчатой (бета-структура, кросс-бета-форма). Пример-коллаген, эластин, фиброин 3) Под третичной структурой белка понимают способ укладки полипептидной цепи в пространстве. По форме, которую имеют белки на данном уровне организации, они подразделяются на глобулярные(в форме овала или клубка) и фибриллярные(имеющие вытянутую форму веретена) В стабилизации третич структуры принимают участие связи между боковыми радикалами АМК. Эти связи подразделяются на сильные(ковалентные)-дисульфидные, псевдопептидные (между аминогруппами и карбоксильными группами диамино- и дикарбоновых кислот), слабые –полярные(водородные, возникающие между функциональными группами радикалов, электростатические), неполярные(ван-дер-ваальсовы).пример-гемоцианин 4) Четвертичная структура представляет собой организацию нескольких полипептидных цепей с третичной стурктурой в единую функциональную молекулу белка. Такой белок называется олигомером, а в его состав полипептидные цепи в третич.структуре –субъединицами(протомерами). При этом уровне организации белки сохраняют основную конфигурацию третич.структуры. Связи, стабилизирующие данный уровень организации белковой молекулы, возможны за счет полярных групп аминокислотных остатков, образуются многочисленные ионные, водородные, иногда и дисульфидные связи, которые прочно удерживают субъединицы в виде организованного комплекса. Пример-гемоглобин, миоглобин, иммуноглобулины. Структура белка определяет его функцию и физико-химические свойства:кислотно-основные, буферные, осмотические. Воздействие целого ряда факторов физической(температура, ультразвуковое и ионизирующее излучение, др) и химической природы(кислоты, щелочи, органические растворители, алкалоиды, тяжелые металлы) приводят к тому, что нарушаются высшие уровни организации белковой молекулы(четвертичная, третичная, вторичная), теряется ее нативная структура, функции, что называется денатурацией белка. Если происходит разрушение и первичной структуры белка, то в этом случае говорят о гидролизе белка, который может быть кислотным ,щелочным и ферментативным. Если денатурированный белок после удаления денатурирующих агентов восстанавливает свою исходную структуру и, соответсвенно, свою биологическую активность, то такой процес называется ренатурацией/ренативация. 2.Функционирование рибосомы и последовательность процессов при синтезе полипептидной цепи… Адапторная функция тРнк Между аминокислотами и нуклеотидами невозможны специфические, комплементарные взаимодействия. Поэтому было сделано предположение о существовании молекул-адапторов, каждая из которых может взаимодействовать с определенным кодоном – с одной стороны и с определенной аминокислотой – с другой стороны. В 1957 году такие молекулы были обнаружены – ими оказались тРНК. Взаимодействие тРНК с аминокислотами с образованием аминоацил-тРНК (аа-тРНК) катализируется ферментами аминоацил-тРНК-синтетазами (АРСазами), причем для каждой аминокислоты существует, по крайней мере, один такой фермент. Источником энергии для этой реакции служит гидролиз АТФ: аминокислота + тРНК + АТФ ¾¾® аминоацил-тРНК + АМФ + ФФ Синтез белка происходит в рибосоме. В нем участвуют множество разных ферментов и белков. Весь процесс образования пептидной цепи можно разделить на три стадии: инициация, элонгация и терминация. Функционирование Рибосомы: Инициация. Синтез белка начинается с образования инициирующего комплекса, состоящего из большой и малой субчастиц рибосомы, мРНК и соответствующей аа-тРНК. Сначала мРНК соединяется с малой (40S) субчастицей рибосомы и инициирующей аа-тРНК, роль которой при синтезе любого белка выполняет Met-тРНК. Затем к этому комплексу присоединяется большая (60S) субчастица рибосом. Met-тРНК взаимодейсвует своим антикодоном с инициирующими кодонами AUG или GUG на мРНК, что является сигналом к началу синтеза белка. Кроме того Met-тРНК связывается с Р участком (пептидильным) на 60S-субчастице рибосом. Источником энергии для инициации синтеза белка служит реакция гидролиза ГТФ до ГДФ и Фн. На этом этапе необходимы еще несколько белков, называемых факторами инициации (IF1, IF2, IF3). После образования комплекса они вновь переходят в цитозоль. Элонгация – это последовательное включение аминокислотных остатков в состав растущей полипептидной цепи. Каждый акт элонгации состоит из трех этапов: 1) узнавание кодона, 2) образование пептидной связи и 3) транслокация. Узнавание кодона заключается в связывании антикодона очередной молекулы аа-тРНК со следующим (первым) кодоном мРНК, а также свободным участком А (аминоацильный участок) на 60S-субчастице рибосомы. Связывание аа-тРНК с рибосомой сопряжено с расходованием энергии – используется одна молекула ГТФ. В этой реакции участвует внерибосомальный белок -–фактор элонгации EF1. Когда оба участка (А и Р) заняты молекулами аа-тРНК происходит образование пептидной связи. Часть 60S-субчастицы представляет собой фермент пептидилтрансферазу, катализирующий образование пептидной связи. В результате этой реакции растущая полипептидная цепь оказывается присоединенной к тРНК участка А. Таким образом, получается дипептидил-тРНК, связанный с первым кодоном и с участком А рибосомы. Транслокация включает три акта, катализируемых еще одним фактором элонгации EF3 и энергетически сопряженных с гидролизом ГТФ. Сначала тРНК участка Р, не связанная с пептидом, покидает рибосому, затем молекула дипептидил-тРНК перемещается из участка А в участок Р и, наконец, рибосома перемещается вдоль мРНК на три нуклеотидных остатка в сторону 3’-конца. В результате этих трех актов освобождается участок А и экспонируется очередной кодон, что позволяет начаться следующему циклу элонгации. Терминация, т.е. окончание синтеза пептидной цепи происходит по достижении терминирующих кодонов (UАА, UGA или UAG). В этом процессе участвуют специальные белки, названные факторами терминации (RF1 и RF2), которые узнают терминирующие кодоны, когда свободен участок А. В результате происходит гидролиз связи между концевым пептидом и тРНК, а освобожденная полипептидная цепь диффундирует от рибосомы. Вслед за этим происходит диссоциация комплекса мРНК – рибосома. Далее рибосома диссоциирует на 40S- и 60S-субчастицы. Роль матричной РНК Роль мРНК в трансляции аналогична роли телеграфной ленты в этом примере: аатРНК присоединяются антикодонами к соответствующим кодонам мРНК, в резуль тате чего аминокислотные остатки оказываются расположенными в той последо вательности, в которой расположены кодоны в мРНК (см. рис. 4.15, в). Теперь остается лишь соединить аминокислотные остатки пептидной связью, чтобы по лучилась пептидная цепь (белок) с определенной первичной структурой. Таким образом, последовательность кодонов мРНК коллинеарна последовательности аминокислотных остатков в соответствующем белке. Эта схема отражает лишь принципиальный механизм перевода нуклеотидной последовательности (точнее, последовательности кодонов) в аминокислотную последовательность. |