Современные проблемы молекулярной биологии

• Название: Современные проблемы молекулярной биологии
• Дата: 16.12.2020
• Размер: 321.48 Kb.
• Имя файла: 20130321-183559.rtf
• Тип: Лекция; #161105

Спецкурс “Современные проблемы молекулярной биологии”

Лекция 1

Молекулярная биология: предмет и задачи. Структура ДНК, РНК, их функции и свойства. Молекулярные механизмы репликации, рекомбинации и репарации ДНК.

План

1. Предмет, цель и задачи молекулярной биологии.

2. Основные этапы развития молекулярной биологии

3. Понятие о молекулярной медицине.

4. Химический состав, макромолекулярная организация, функции и свойства ДНК.

5. Химический состав, типы, структурная организация, функции и свойства РНК. Атипические, азотистые основания РНК.

1. Предмет, цель, задачи молекулярной биологии

Все живые организмы имеют молекулярную основу структуры и функций.

Тела живых организмов состоят примерно из 30 основных элементов.Главными составляющими — до 99% массы, - являются углерод, кислород, водород, азот, а также фосфор и сера.

Большое значение имеют также натрий, калий, железо, кальций, магний, хлор и йод. Атомы разнообразных элементов «комбинируются» в различных пропорциях и образуют огромное количество разнообразных молекул, которые в результате высочайшей упорядоченности формируют живые системы (клетки).

Молекулы, составляющие живой организм, разделяются на две группы: органические и неорганические

• Неорганические молекулы организмов представлены водой (70% от массы тела), а также различными солями в растворенном состоянии.

• Органическиемолекулысложны и обладают значительной молекулярной массой. Они содержат углерод как основой компонент, а также включают водород, кислород, азот, фосфор и серу. Органические полимеры, построенные из остатков аминокислот составляют молекулы белков. Полимеры, построенные из нуклеотидов играют центральную роль в аккумуляции и переносе энергии (АТФ, ГТФ и др.), однако их основное значение состоит в том, что они являются субъединицами информационных молекул РНК и ДНК.
• То есть, живой организм можно определить как высоко-организованную организацию молекул за счет постоянного использования энергии и материи окружающего пространства «под руководством» информационных программ нуклеиновых кислот, что обеспечивает длительное поддержание высокой упорядоченности молекул и процессов, а значит, длитель-ное поддержание тела живым.

Предмет и задачи молекулярной биологии

Молекулярная биология –это наука о механизмах хранения, воспроизведения, передачи и реализации генетической информации, о межмолекулярных взаимодействиях, которые лежат в основе биологических процессов, о структуре и функциях нерегулярных биополимеров - нуклеиновых кислот и белков.
.

Предметом молекулярной биологии являются все молекулы живых систем.

Задачи молекулярной биологии:

• Изучение молекулярных структур живых систем

• Изучение взаимоотношений между молекулярными структурами живых организмов

• Изучение соотношений между генами и функциями, которые они выполняют

• Применение полученных знаний для молекулярных биотехнологий

• Конечная цель предмета:

Уметь объяснять закономерности проявлений жизнедеятельности человеческого организма на молекулярно-генетическом уровне структурной организации

2. Основные этапы развития молекулярной биологии

1. Первый романтический период 1935-1944гг.

Макс Дельбрюк и Сальвадор Лурия занимались изучением репродукции фагов и вирусов, представляющих собой комплексы нуклеиновых кислот с белками В 1940г. Джордж Бидл и Эдуард Татум сформулировали гипотезу - "Один ген - один фермент". Однако, что такое ген в физико-химическом плане тогда еще не знали.

• 2. Второй романтический период 1944-1953гг.

Была доказана генетическая роль ДНК. Была создана база для открытия структуры ДНК, модель двойной спирали который появилась в 1953 году, за нее ее создатели Джеймс Уотсон, Френсис Крик и Морис Уилкинс были удостоены Нобелевской премии.

• 3. Догматический (аксиоматический) период 1953-1962гг.

Сформулирована центральная догма молекулярной биологии: Перенос генетической информации идет в направлении ДНК → РНК → Белок В 1962 г. был расшифрован генетический код.

На Всемирном конгрессе биохимиков, проходившем в Москве в 1962 году (всего было 5000 участников), секция молекулярной биологии насчитывала 50 человек. Всего через четыре года, на следующем конгрессе, секции молекулярных биологов уже не было, они устроили свой конгресс, в котором принимали участие около 3000 ученых. Среди специалистов - молекулярных биологов началась узкая специализация.

• 4. Академический период с 1962г. по настоящее время

1970-1975 годы - Генно-инженерный период

Открыты ферменты обратная полимераза (ревертаза), рестриктазы, которые позволили ученым совершать тонкие манипуляции с нуклеиновыми кислотами.
Генная инженерия занимается методами конструирования молекул ДНК, и наукой в широком смысле не является.

Спецкурс “Современные проблемы молекулярной биологии”

Лекция 4

Молекулярные механизмы мутаций

В биологии мутации – это постоянные, необратимые изменения нуклеотидной последовательности генетического материала организма. Мутации могут быть вызваны копированием ошибок в генетическом материале на протяжении клеточного деления, влиянием ультрафиолетового или ионизирующего излучения, химических мутагенов или вирусов или могут происходить сознательно под клеточным контролем во время таких процессов как, например, гипермутация. Во время гипермутации на небольшом по протяденности участке (1500-2000 нуклеотидов) возникает много мутаций и клетка умирает в результате апоптоза.
В многоклеточных организмах мутации разделяются на генеративные, которые возникают в половых клетках и могут быть переданы потомкам, и соматические мутации, которые возникают в соматических клетках и у животных не передаются потомкам.
Новая мутация, возникшая в организме и не унаследованная от любого из родителей, называется де ново (de novo) мутация. Источник мутации не отвечает за ее последствия, хотя последствия мутации связаны с тем, какая клетка повреждена мутацией.

Мутация приводит к появлению новых признаков или новых вариантов признаков. Мутации иногда резко изменяют морфо-функциональные свойства организма. Мутации могут быть полезными, нейтральными или вредными.

Мутации — общебиологическое явление, характерное для всех видов живых организмов и человека.

Структурные перестройки хромосом половых клеток изменяют генетический баланс, а также генетические программыразвития и функционирования эмбриона. Изменяется характер взаимодействия генов и их экспрессия. Это отрицательно сказывается на структуре и функции клеток, органов и приводит к серьезными последствиями. Зачастую мутации оказываются несовместимыми с развитием нового организма или обуславливают появление патологий. Однако некоторые перестройки хромосом могут быть полезными для эволюции. Например, у человека 23 пары хромосом, а у современной человекообразной обезьяны 24 пары. Предполагается, что существенным этапом эволюции человека явилось, «слияние» 12-ой и 13-ой хромосомы обезьян и образование 2-ой хромосомы человека, которая почти полностью соответствует по генетическому составу своим предшественницам. В результате этого произошло изменение числа пар хромосом и комбинаций генов, что, вероятно, явилось одной из причин появления человека.

В соматических клетках живых организмов также могут возникать мутации разного рода — генные, хромосомные или геномные. Соматические мутации вызываются физическими, химическими или биологическими причинами. Они могут обусловить появление новых признаков клеток, тканей или органов. Такие изменения генотипа наследуются только «потомками» этих клеток в пределах одного организма. То есть соматические мутации также являются факторами, обуславливающими проявление изменчивости у индивидуумов. В ряде случаев это может иметь неблагоприятные последствия. Например, в результате изменения структуры ДНК внутренними или внешними воздействиями может появиться группа раковых клеток, обладающих дефектами регуляции клеточного размножения и способностью к неограниченному делению. Причинами злокачественного роста могут быть также нарушения митоза, гетероплоидии и хромосомные аберрации.

Генные мутации.

Генные мутации связаны с нарушениемструктуры одного гена. При этом изменения связаны обычно только с одним или несколькими атомами одного или нескольких нуклеотидов. Поэтому такие мутации называют еще точечными.В результате мутаций изменяется порядок считывания информации с генетического кода, что приводит к изменению аминокислотной последовательности синтезируемых белков или вообще к остановке процессов синтеза. Следствием является появление дефектных белков или отсутствие какого-либо фермента, что нарушает клеточный метаболизм, дифференцировку, развитие и является причиной возникновения новых признаков у потомства (в том числе потомственных наследственных болезней).

• Существуют два основных вида генных, или точечных, мутаций:

Смысловая замена, при которой отдельное основание замещается другим. Обычно это приводит к тому, что при синтезе полипептидной цепи образуется новая аминокислота.

• Несмысловая замена, при которой то же отдельное основание замещается другим. Есть вероятность, что новый триплет не кодирует аминокислоту. Он может служить сигналом окончания синтеза полипептидной цепи.

• Точечные мутации могут быть вредными, полезными или не оказывающими особого влияния, нейтральными.

• Вредные мутации – 90%

• Существует много примеров вредных мутаций, когда замена оснований в цепи ДНК приводит к серьезным последствиям. Например:

• серповидноклеточная анемия;

• кистозный фиброз;

• талассемия.

Другие виды генных мутаций

Хромосомные мутации. Такие мутации связаны с изменением структуры и размеров хромосом. Их также называют хромосомными перестройками или хромосомными абберациями. Нарушение структуры хромосом является следствием нарушения процессов кроссинговера, мейоза или митоза, а также действием других факторов, приводящих к образованию фрагментов хромосом. Такие фрагменты могут в дальнейшем даже воссоединится, но без восстановления нормальной структуры. Хромосомные перестройки приводят к изменению морфологии хромосом, что заметно даже в световой микроскоп.

Хромосомные аберрации можно классифицировать, используя различные подходы. В зависимости от того, в какой момент клеточного цикла — до или после репликации хромосом возникли перестройки — выделяют аберрации хромосомного и хроматидного типов. Аберрации хромосомного типа возникают на предсинтетической стадии — G1 фазе, когда хромосома представлена однонитевой структурой. Аберрации хроматидного типа возникают после репликации хромосом в фазах S и G2 и затрагивают структуру одной из хроматид. В результате хромосома на стадии метафазы содержит одну измененную и одну нормальную хроматиды. Если же перестройка произошла после репликации и затронула обе хроматиды, появляется изохроматидная аберрация. Морфологически она неотличима от аберраций хромосомного типа, хотя по происхождению относятся к хроматидному типу. Среди аберраций хромосомного и хроматидного типов выделяют простые и обменные аберрации. В их основе лежат нарушения одной или нескольких хромосом. Простые аберрации — фрагменты (делеции) — возникают в результате простого разрыва хромосомы. В каждом случае при этом образуется 2 типа фрагментов — центрические и ацентрические. Различают терминальные (концевые) и интерстициальные (средних участков хромосом) делеции или фрагменты. Обменные аберрации очень разнообразны. В их основе лежит обмен участками хромосом (или хроматид) между разными хромосомами (межхромосомный обмен) или внутри одной хромосомы (внутрихромосомный обмен) при перераспределении генетического материала. Обменные перестройки бывают двух типов: симметричные и асимметричные. Асимметричные обмены приводят к образованию полицентрических хромосом и ацентрических фрагментов. При симметричных же обменах происходит соединение ацентрических фрагментов с центрическими, в результате чего хромосомы, вовлеченные в обменную аберрацию,остаются моноцентрическими. Внутрихромосомные обмены могут происходить как внутри одного (внутриплечевой обмен), так и между обоими плечами хромосомы (межплечевой обмен). Кроме того, обмены могут быть простыми и сложными, когда в процесс вовлечены несколько хромосом. В результате могут образоваться необычные и достаточно сложные конфигурации хромосом. Любой обмен (симметричный и асимметричный, межхромосомный и внутрихромосомный) может быть полным (реципрокным) или неполным (нереципрокным). При полном обмене происходит соединение всех поврежденных участков, а при неполном обмене часть из них может остаться с открытым поврежденным участком.

Некоторые хромосомные аберрации получили название стабильных, поскольку они способны передаваться из одного клеточного поколения в другое.

Это связано с тем, что при перераспределении генетического материала произошло полное соединение центрических и ацентрических фрагментов. Лишенная центромер или, напротив, включающая в себя две или более центромеры, часть хромосомных аберраций может теряться в процессе клеточного деления. Такие структурные аберрации именуются нестабильными. Важное значение имеет идентификация хромосомных аберраций по принадлежности к хромосомному или хроматидному типу, при изучении индуцированного мутагенеза, т.к. мутагенные факторы различной природы (химической, физической, биологической) могут вызывать разные типы нарушений. В связи с этим более подробно рассмотрим основные типы хромосомных аберраций.

Аберрации хромосомного типа

При цитогенетическом анализе можно различить, в зависимости от применяемых методов исследования, несколько типов аберраций этой группы:

1) Парные (терминальные или интерстициальные) фрагменты, которые образуются в результате одного или двух разрывов хромосомы в фазе Gt. Величина их различна — от очень длинных, захватывающих почти все хромосомное плечо, до точечных. Парные фрагменты без труда регистрируются при анализе метафаз. Эти аберрации относятся к нестабильным. Как правило, они не проходят через митоз, т.к., лишенные центромер, не могут правильно ориентироваться относи­тельно веретена деления 2) Кольцевые хромосомы (центрические кольца) — внутрихромосомные обмены, при которых интерстициальный фрагмент хромосомы замкнут в кольцо. Для образования центрического кольца необходимы два разрыва по обеим сторонам центромеры, в результате чего свободные концы центричес­кого фрагмента соединяются между собой. О полноте обмена можно судить по числу парных фрагментов, сопровождающих кольцевую хромосому. Один фрагмент характерен для полного обмена, т.к. концевые фрагменты соединяются между собой. Достаточно редко кольцевая хромосома сопровождется двумя парными фрагментами (неполный обмен)

• 3) Инверсии — внутрихромосомные обмены, при которых может происходить переворот сегмента, содержащегоцентромеру, на 180°. Такая аберрация возникает в результате двух разрывов либо на разных расстояниях от центромеры, либо на одинаковых (перицентрические инверсии). В результатеинверсии сегмента хромосомы внутриодного плеча хромосомы образуетсяпарацентрическая инверсия. При цитогенетическом анализе перицентрическую инверсию достаточно легко обнаружить, если разрывы произошли на разных расстояниях от центромеры. Другие инверсии (в том числе парацентрические) с помощью стандартных цитогенетических методов не регистрируются

• Ацентрические кольца — внутрихромосомные обмены, представляющие собой замкнутые в кольцо спаренные участки хроматид, не содержащие центромер и сопровождаемые появлением делетированной.

• Дицентрические и полицентрические хромосомы — это асимметричные транслокации, возникающие при межхромосомном обмене. Такие хромосомные аберрации имеют две (дицентрики) или более (полицентрики) центромер. Наиболее часто встречаются дицентрики, образующиеся в результате одиночных разрывов в двух хромосомах и последующего объединения двух центромерных фрагментов. Дицентрик обычно сопровождается одним, реже — двумя, парнымм фрагментами, что свидетельствует о неполном обмене. Дицентрические хромосомы легко распознаются с помощью стандартных цитогенетических методов. Наряду с центрическими кольцами, этот тип хромосомных аберраций широко используется для количественного изучения мутаций в работах по индуцированному мутагенезу.

Симметричные транслокации — межхромосомные обмены, которые возникают без нарушения в распределении центромер (взаимный обмен ацентрическими участками между двумя хромосомами). Различают реципрокные, когда две хромосомы обмениваются участками и нереципрокные транслокации, когда участок одной хромосомы переносится на другую хромосому. Для осуществления нереципрокной транслокации необходимо наличие трех разрывов (двух — в одной хромосоме и одного — в другой) и последующие соединения разорванных концов. В особый тип выделяют так называемые Робертсоновские транслокации или слияния, которые приводят к изменению числа хромосом. Они образуются при слиянии двух акроцентрических хромосом в области центромеры, в результате чего образуется одна метацентрическая хромосома. Этот тип транслокаций получил свое название по имени исследовавшего механизм такого слияния У. Р. Робертсона. Стандартное цитогенетическое исследование позволяет увидеть только те из симметриччных транслокаций, которые образовались в результате обмена неравными по длине участками. При этом морфология хромосом изменяется: удлинение одной хромосомы происходит за счет укорочения другой.

Аберрации хроматидного типа

Как и аберрации хромосомного типа, различают простые (одиночные фрагменты или делеции) и обменные хроматидные аберрации.

Одиночные фрагменты или хроматидные делеции образуются при повреждении одной хроматиды. В зависимости от места разрыва они бывают различной длины.

Хроматидные обмены характеризуются многообразием форм, что определяется рядом хромосомных факторов: числом и величиной участков, вовлеченных в обмен хромосом и хроматид, гомологичностью хромосом, участвующих в обмене, симметричностью и полнотой обмена. Довольно часто межхромосомные обмены происходят между хроматидами двух хромосом. Их морфология очень разнообразна. Из-за характерной конфигурации такие обмены часто называют "квадрирадиалы". Как правило, большинство аберраций хроматидного типа достаточно легко идентифицировать с помощью стандартных цитогенетических методов. Взависимости от изменений генотипа половых клеток, а затем зиготы, мутации могут быть генными, хромосомными и геномными. Геномные мутации. Если в результате какого-либо события происходит; изменение числа хромосом в кариотипе, то говорят о геномных мутациях. К ним относятся полиплоидия и гетероплоидия. Полиплоидия — увеличение числа хромосом в 2, 3, 4 и т.д. раза в результате добавления полных хромосомных наборов из-за нарушений деления. Многие культурные растения полиплоидны. Полиплоидные формы известны и у некоторых примитивных животных. Например, у некоторых групп простейших, в частности инфузорий и радиолярий. Причинами полиплоидии являются следствия действия мутагенных факторов, в результате чего в клетках может наблюдаться эндомитоз — удвоение хромосом, но без последующих делений клетки.

Гетероплоидия.

Вследствие нарушений сложных молекулярных процессов мейоза число хромосом в гаметах может изменяться. Если такие гаметы участвуют в оплодотворении, то образуются аномальные зиготы. Если какая-либо из хромосом в кариотипе организма оказывается в тройном наборе, то это называется трисомией (2п+1). Трисомия известна у многих видов растений и животных, а также у человека.

Пример трисомии по 21-й хромосоме у человека — синдром Дауна (47, +21). Если в результате нарушения деления одна из хромосом теряется (2п-1), то это явление называется моносомией.

Процесс возникновения мутаций называется мутагенезом, а факторы, вызывающие мутации, — мутагенами.

Различают мутагенные факторы внешней среды (экзомутагены) и факторы внутренней среды (эндомутагены) — продукты метаболизма в организме. Экзомутагены можно подразделить на следующие:

1) физические (ионизирующие излучения, ультрафиолетовые лучи, температура и др.);

2) химические (формалин, горчичный газ, колхицин, многие смолы, соли тяжелых металлов, некоторые лекарственные вещества, токсины бактерий и паразитов и др.);

3) биологические (вирусы, плазмиды).

• Излучение с длиной волны меньше, чем у ультрафиолетового, называется ионизирующим излучением. Уровень его энергии настолько высок, что электроны под воздействием лучей сходят с орбит атомов и образуют положительно заряженные ионы. Ионы, а также содержащие их молекулы, химически более активны, чем нейтральные атомы. Этот тип радиации может воздействовать на ДНК и хромосомы, но мутации, вызываемые им, не наследуются, если только они не произошли в органах, производящих половые клетки.

Все организмы в той или иной степени подвергаются небольшому уровню ионизирующего облучения космическими лучами и радиоактивными элементами земной коры, которые встречаются в горных породах, выходящих на поверхность. Дополнительное облучение вызывается использованием радиоактивных изотопов в процессе деятельности человека, например вследствие использования рентгеновских лучей в медицине и выбросов радиоактивных отходов атомных реакторов. Химические вещества. Начиная с 1945 года список мутагенных химических веществ постоянно пополняется, причем многие из них обладают канцерогенными свойствами (вызывают рак). Часто мутагены использу­ют в сельском хозяйстве для улучшения роста сельскохозяйственных культур и повышения урожая. Один из самих важных – колхицин, который вызывает удвоение хромосом в клетках и приводит к увеличению роста растений.

Индуцированный мутагенез

Ныне стало очевидным, что бурное развитие науки и техники приводит к интенсивному накоплению в окружающей среде разнообразных мутагенов, способных наносить вред здоровью не только современного, но и будущих поколений людей. Воздействие на живой организм различных мутагенных факторов внешней среды, в первую очередь, химических и физических, приводит к накоплению патологических мутаций, которые нередко оказывают неблагоприятное влияние на жизнедеятельность как отдельных клеток, так и организма в целом. При этом мутации, возникающие в половых клетках, могут приводить к спонтанным абортам, врожденным порокам развития, мертворождениям, к увеличению частоты наследственных заболеваний.

Мутации, возникающие в соматических клетках, способны инициировать развитие злокачественных новообразований, сокращать продолжительность жизни, вызывать преждевременное старение, а также неблагоприятно воздействовать на целый ряд жизненно важных функций организма. В связи с этим проблемам, связанным с индуцированным мутагенезом, уделяют пристальное внимание.Основные закономерности индуцированного мутационного процесса у человека на генном, хромосомном и геномном уровнях изложены в многочисленных работах, выполненных как в нашей стране, так и за рубежом. Большая часть исследований проводится на соматических клетках, — наиболее доступным и удобным объекте исследования. При изучении индуцированного мутагенеза основное внимание уделяют следующим вопросам: спектру мутаций; количественной зависимости частоты мутаций от дозы мутагена и его качества; репарации повреждений ДНК; особенностям действия малых доз мутагена; влиянию антимутагенов; индивидуальной чувствительности организма.

Основная масса исследований по индуцированному мутагенезу посвящена радиационному и химическому мутагенезу.

Мутации, индуцированные радиацией

Именно при исследовании радиационного мутагенеза была впервые показана возможность индуцировать мутации при действии факторов внешней среды. Основы радиационной генетики были заложены работами Г.А.Надсона и Г.Т.Филиппова в 1925г. в опытах на плесневых и дрожжевых грибах. Позже, в 1927г. Г.Д.Меллер, используя методы количественного учета мутаций у дрозофилы, обосновал факт мутагенного действия рентгеновских лучей. В 1928г. Л.Д.Стадлер в опытах на ячмене и кукурузе показал, что ионизирующие излучения разных видов способны вызывать мутации. В последующие два десятилетия происходило достаточно активное развитие классической радиационной генетики. Основные положения ее изложены в трудах Д.Ли, Д.Кэтчсайда, Н.В.Тимофеева-Ресовского, К.Г.Циммера, А.Холландера, А.С.Серебровского, Н.П.Дубинина, Ядерные взрывы, прогремев­шие в Хиросиме и Нагасаки, стимулировали бурное развитие работ по изучению влияния радиации на человека. Усилия ученых многих стран привели к разработке современных представлений о механизмах воздействия ионизирующих излучений. При этом основные закономерности воздействия ионизирующих излучении были вскрыты в исследованиях, проведенных на микроорганизмах, растениях и животных. Используя принципы экстраполяции, результаты, полученные на экспериментальных объектах, широко используют для оценки генетического риска облучения человека. Например, исследования, проведенные на мышах, в ходе которых изучали частоту индуцированных радиацией катаракт и скелетных аномалий, явились основой для расчета ожидаемой частоты индуцированных доминантных мутаций у человека. Все радиобиологические эффекты, вызываемые ионизирующими излучениями у различных видов живых существ, могут быть подразделены на стохастические и нестохастические. Стохастические эффекты характеризуются линейной беспороговой зависимостью вероятности их появления от дозы ионизирующего излучения. При этом от величины дозы зависит частота рассматриваемых событий, а не их тяжесть. К таким эффектам относятся генетические последствия облучения и радиационный канцерогенез. Нестохастические эффекты имеют пороговую (сигмоидную) зависимость от дозы, причем с дозой связана как вероятность эффекта, так и его тяжесть. Примерами нестохастических эффектов являются: лучевая болезнь, сокращение продолжительности жизни, смертность, индуцированные радиацией пороки развития, поражение иммунной системы. Следует заметить, что механизмы возникновения стохастических и нестохастических эффектов совершенно различны, поэтому при оценке рисков появления этих эффектов в результате облучения недопустимо их объединение. В этой книге мы будем рассматривать преимущественно стохастические эффекты радиации.

ЛЕКЦИЯ №5

ТЕМА: Методы исследования нуклеиновых кислот. Рекомбинантные ДНК

Курс «Современные проблемы молекулярной биологии»

ПЛАН

1. Прямые методы изучения нуклеиновых кислот

2. Непрямые методы изучения нуклеиновых кислот

3. Практическое применение рекомбинатных ДНК

Методы изучения нуклеиновых кислот:

1. Секвенирование ДНК - это узнавание последовательности оснований ДНК

2. Клонирование ДНК - размножение отдельных фрагментов ДНК

3. Обратная транскрипция - получение определенных фрагментов ДНК (зондов ДНК) на основе обратной транскрипции с мРНК

4. Метод гибридизации ДНК

5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

6. FISH - анализ

ДНК для тестирования может быть выделена из клеток разных жидкостей биологического происхождения или тканей.

Большинство тестов осуществляются с использованием ДНК клеток крови, но клетки, полученные из букального эпителия щеки с помощью зубной щетки, или клетки в волосяном фолликуле также могут быть источниками ДНК.

Прямое генное тестирование

доказывает присутствие или отсутствие определенной мутации гена через исследование последовательности нуклеотидов в гене.

Этот тест является очень точным и используется для диагностики и скрининга, в частности предродового, тестирования и скрининга носителей патологического гена, пресимптоматичного и предупредительного тестирование. Для некоторых сложных состояний, как, например, рака, тестирование может быть сделано, чтобы идентифицировать определенную семейную мутацию гена (поиск мутации) перед тем, как здоровым членам семьи может быть предложенно предупредительное тестирование.

Ограничения включают:

– Интерпретация результата теста, например, нахождение поврежденного гена, не всегда указывает на то, как именно человек уже является или будет поражен определенным болезненным состоянием.

– Тестирование может отнимать много времени и является дорогим для системы здравоохранения или для пациента.

Шаг 1: Рестрикция (разрезание) ДНК

Ученые использовали рестрикционное картирования в молекулярной биологии с 40х-50х лет прошлого века, чтобы проанализировать структуру и последовательность молекул ДНК. Эта мощная методика включает использование рестрикционного (ограничительного) разрезания. Рестрикционное разрезание - процесс разрезания молекул ДНК на меньшие фрагменты с помощью специальных ферментов рестрикционных эндонуклеаз (RE или РЭ), которые еще иногда называются рестрикционными ферментами.

РЭ находят определенные последовательности ДНК, где бы они ни располагались в геноме, обычно по 4-8 пар нуклеотидов длиной (например, GATATC), и разъединяют эти последовательности.

Как ДНК каждого человека имеет определенные небольшие отличия, так и сайты (места) рестрикции могут находиться в разных местах некодирующей ДНК людей. И ферменты вырежут ДНК разных размеров у разных пациентов.

Сегодня изолировано более 900 рестрикционных ферментов, некоторые – со специфическими последовательностями, а некоторые – нет, из больше чем 230 штаммов бактерий.

Есть три класса рестрикционных ферментов (тип І, II и III). Чаще всего используются ферменты II типа. Они определяют последовательности в 4, 5, 6 нуклеотидов длиной и имеют двойную симметрию. Распознаваемая ферментом ІІ-го типа последовательность во многих сайтах рестрикции является одинаковой на обеих цепях ДНК. Такие последовательности называются палиндромными. Некоторые ферменты разрезают обе цепи точно по оси симметрии, образовывая фрагменты ДНК, которые имеют тупые или ровные концы (например EcoRV); другие разъединяют каждую цепь в подобных местах на противоположных сторонах оси симметрии, создавая фрагменты ДНК, которые имеют выступающие одноцепочечные концы (они также называются «липкие» концы или выступы).

Рестрикционные ферменты и фрагменты, что ими продуцируются, стали мощным инструментом молекулярной генетики. Они используются

для картирования молекул ДНК

чтобы проанализировать полиморфизм популяции

чтобы перекомбинировать молекулы ДНК

чтобы создавать молекулярные пробы

чтобы создать мутантов (химерные организмы)

чтобы анализировать модификационный статус ДНК и в др. направлениях

Создание рекомбинантных ДНК

Полимеразная цепная реакция (ПЦР или PCR)

— экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций желаемых фрагментов ДНК в биологическом материале (пробе).

- Кроме простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет проводить введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК, клонирования генов, выделение новых генов, секвенирование, используется для создания генетически модифицированных организмов, диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), идентификации малых количеств ДНК, установления отцовства.

Шаг 2:ДНК-электрофорез с гелем

Гель-электрофорез – это техника, используемая для разделения нуклеиновых кислот и белков.

Отрезок ДНК размещается в слое ‘желе’ (гелеобразная матрица) и электрический ток применяется таким образом, что ‘желе’ становится поляризованным, приобретает «положительный» (+) и «отрицательный» (-) заряды - точно так же как позитивные и негативные полюса батареи.

Поскольку ДНК – химическая структура, что имеет негативный заряд, фрагменты ДНК двигаются в направлении к положительному полюсу геля или от вершины к низу.

Куски ДНК располагаются в геле в соответствии с размером: наибольшие фрагменты перемещаются медленнее всего и потому располагаются ближе всего к вершине геля. Гель сейчас содержит всю ДНК индивидуума, расположенную от вершины к низу геля. Фрикционная сила гелевих материалов работает как "Молекулярное сито", отделяет молекулы по размеру. При электрофорезе макромолекулы вынужденные двигаться через поры во время применения электрического потока. Уровень их миграции через электрическое поле зависит от силы поля, размера и формы молекул, относительной гидрофобности образцов, и от ионной силы и температуры буфера, в котором молекулы двигаются. После окрашивания, отделенные макромолекулы в каждой узкой дорожке могут быть видные как серии полос от одного конца геля к другому.

ДНК - электрофорез

Чтобы выбрать фрагменты ДНК, которые нужно проанализировать, части ДНК, расположенные в геле, покрываются специальными ДНК-«пробами». Пробы создаются в лабораторных условиях и имеют последовательность, комплементарную последовательности той ДНК, которую нужно выделить из геля.

Эти пробы присоединяются друг к другу по правилу комплиментарности.

FISH – анализ
(fluorescence in situ hibridization)

- основан на реакции гибридизации различных флуоресцентных меченых зондов ДНК, которые фиксируются с определенными локусами хромосом

2. Метод позволяет обнаружить геномные, хромосомные аберрации, генные мутации в клетках эмбриона

Создать используемые для исследования пробы тяжело. Это может быть дорого, а процесс, возможно, занимает некоторое время.

Недавно был разработанный более быстрый метод для диагностики генетических состояний, которые связаны из делециями или дупликациями определенных генов.

Исследования проводятся в форме микроматрицы.

Для микроматрицы применяются те же принципы, которые описаны выше, за исключением того, что ДНК исследуемого индивудуума, налагается на очень малую поверхность, где размещаются тысячи разных проб, которые являют собой тысячи областей ДНК или генов. Построенные микроматрицы могут быть специфическими для одной хромосомы или включают всю ДНК человеческой клетки (геном). Пример результата генетического тестирования ДНК, полученного в лаборатории, показан на рисунке

Здесь есть две копии каждого гена. В данном случае

• Индивидуум А имеет две поврежденных копии гена и, возможно, имеет определенное генетическое состояние

• Индивидуум В имеет одну поврежденную копию, а другая - работает. Потому это носитель поврежденного гена

• Индивидуум С имеет обе копии этого гена с нормальной функцией.

Тестирование ДНК может включать анализ гена непосредственно (прямое тестирование гена) или коротких сегментов ДНК, расположенных близко или в пределах гена (непряме исследование гена).

Саузерн-Блоттинг (Southern Blot Analysis)
метод идентификации специфических форм ДНК в клетках. Молекулы ДНК удаляются из клеток и с помощью рестриктирующих ферментов разделяются на небольшие фрагменты. Эти фрагменты отделяются друг от друга, и с помощью генного зонда производится поиск идентичных участков ДНК. Для сравнения: Нозерн-блоттинг, Вестерн -блоттинг.

Секвенирование ДНК и выявления генетических болезней

Как только создан образец, в котором все молекулы происходят от единственного участка ДНК, возможно осуществить секвенирование (установление последовательности) ДНК для определения неизвестной последовательности нуклеотидов фрагмента между двумя праймерами. Один из праймеров ПЦР обычно используется в качестве «затравка» для метода Сангера, самого распространенного сейчас метода секвенирования. Этот метод обычно используется для диагностики генетических заболеваний; доктор может подтвердить диагноз, наблюдая отличия в последовательности ДНК, которые, как известно, связаны с заболеванием.

Метод генетических отпечатков пальцев ( geneticfingerprinting)

метод, что используется в криминалистике для идентификации человека, при сравнении ее ДНК с ДНК в предоставленном образце. ПЦР обычно используется для амплификации набора определенных участков ДНК, о которых известно, что они изменяются в длине от человека к человеку. Комбинация длин всех этих участков, которые потом разделяются с помощью гелевого электрофореза, создает «генетический отпечаток пальцев». С применением ПЦР теоретически нужна лишь одна молекула ДНК для идентификации, хотя в некоторых случаях именно это увеличивает риск ошибок через возможное загрязнение и амплификацию в результате ДНК из внешних источников. Существует несколько методов генетических отпечатков пальцев, но все они обычно используют гелевый электрофорез, после чего образец окрашивается с помощью этидиум бромида либо других красителей, либо наблюдается с помощью гибридизации с пробами ДНК с помощью саузерн-блоттинга. На практике необходимый образец генетического материала собирается с места преступления: кровь, слюна, сперма, волосы и тому подобное. Этот образец сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Поскольку есть небольшая достоверность, что у двух человек отпечатки окажутся похожими, этот метод чаще используется для доказательства невинности подозреваемого. Хотя «генетические отпечатки пальцев» уникальны (за исключением случая однояйцевих близнецов), родственные связи все же можно установить, сделав несколько таких отпечатков. Тот же метод можно применять, слегка модифицировав его, для установления эволюционного родства среди организмов.

Непрямое генетическое тестирование

Это сравнение ДНК-маркеров членов семьи с состоянием маркеров у непораженных болезнью родственников.

Используется в ситуациях, где непосредственный локус гена не был точно установлен или в случаях, где мутация(и) в гене еще не были определена(ы);

Тест не является таким точным как прямое генное тестирование, но может использоваться в диагностике, включая предродовую и пресимптоматическую и предварительное тестирование.

Ограничения включают:

Не всегда можно найти маркеры ДНК, которые предоставляют возможность ученым установить разницу между ошибочной копией гена и рабочей копией гена.

Вестерн-Блоттинг (Western Blot Analysis)
метод выявления некоторых белков. После их отделения с помощью электрофореза, белки соединяются с меченными радиоактивным веществом антителами и идентифицируются при рентгенологическом исследовании.

Нозерн-Блоттинг (Northern Blot Analysis)

метод определения специфических участков информационной (матричной) РНК в клетках. Он основан на использовании генного зонда, предназначенного для обнаружения искомой РНК.

Практическое применение ДНК- технологий

1. Медицинское: болезнь часто включает изменения в экспрессии гена, потому методы ДНК

- помогают установить поврежденный ген.

- Делать диагностику болезни/инфекции: ПЦР и меченые пробы ДНК от болезнетворных организмов могут помочь идентифицировать типы микроба с помощью рестрикционного анализа длины фрагментов (Restriction Fragment Length Analysis (RFLP)), когда маркеры часто наследуются вместе с болезнью.

- Анализ фрагментов ДНК (ДНК-отпечатков пальцев) также используется для установления отцовства

- Генная терапия: идея заменять дефектные гены через микроинъекцию ДНК требует векторов, которые создаются с помощью методов ДНК.

2.Фармацевтические изделия: создание лекарств