Лекция 12. Клеточные эффекты ии. Радиационная задержка клеточного деления. Программируемая смерть клетки (апоптоз). Цитогенетические аномалии. Кривые дозаэффект
 Скачать 296.31 Kb.
|
|
1 Лекция 12. Клеточные эффекты ИИ. Радиационная задержка клеточного деления. Программируемая смерть клетки (апоптоз). Цитогенетические аномалии. Кривые «доза-эффект». Эффект «свидетеля». Секторальная гибель клеток. Генетическая нестабильность. Радиационные повреждения ДНК и задержка прохождения клеточного цикла. Снижение числа делящихся клеток после облучения было замечено уже вскоре после открытия рентгеновских лучей, что и послужило одним из оснований к их применению для подавления опухолевого роста. Задержка в наступлении очередного деления наблюдается почти у всех клеток облучаемой популяции, причем ее длительность зависит от дозы ионизирующего излучения. Существенная роль в этом процессе отводится системе обнаружения дефектов ДНК в сверочных точках цикла во время прохождения клеткой периодов G 1 и G 2 . Причины значительной задержки деления у клеток, неясны. Высказано лишь предположение, что она может быть связана с переходом клетки от репликации эухроматина к репликации гетерохроматина (эухроматин, составляющий около 90% ДНК клетки, транскрипционно активен и в интерфазе находится в деконденсированном состоянии; гетерохроматин транскрипционно неактивен и в интерфазном ядре находится в конденсированной форме, что различимо при световой микроскопии). Однако изучению дифференциальной чувстви- тельности эу— и гетерохроматина к облучению еще только начинают уделять внимание, и данное предположение лишь указывает на то, что этот вопрос поднимается ь литературе. Жизненный цикл клетки, период от одного деления до другого, подразделяется на четыре фазы: митоз (М), период синтеза ДНК (S-период), предсинтетический период ( G 1 от англ. gap — разрыв, под которым понимается перерыв между видимым в микроскоп митозом и определяемым с помощью авторадиографии периодом синтеза ДНК) и постсинтетический период ( G 2 ) между окончанием синтеза ДНК и вступлением клетки в митоз. Общая длительность цикла культивируемых in vitro опухолевых клеток человека, с которыми проводится основная масса радиобиологических экспериментов, составляет около 24 ч, при длительности периода G ] ≈ 10 ч, 8 ч, G 2 ≈ 5 ч и М — 1ч. Быстро делящиеся клетки, особенно стволовые, имеют укороченный период G 1 , в то время как дифференцированные клетки имеют столь длинный период, что его обозначают стадией покоя. «Покоящиеся» клетки — это резерв популяции, они переходят к синтезу ДНК и делению в случае гибели от различных причин части клеточного пула. Таков, например, механизм посттравматической регенерации тканей или возобновления роста опухоли после ее облучения. Продвижение клетки по циклу определяется активацией последовательно сменяющих друг друга циклинзависимых киназ — ферментов, фосфорилирующих аминокислотные Схема митотического цикла: М — митоз; G 1 — предсинтетический (по отношению к синтезу ДНК) период; S — ста- дия синтеза ДНК; G 2 — постсинтетический период; С 0 — период покоя Сверочная точка Сверочная точка 2 остатки в белках и тем самым меняющих их конформацию и энзиматическую активность. Каждая циклинзависимая киназа состоит из собственно каталитической единицы, обозначаемой как Cdk с определенным номером, и регуляторной субъединицы — одного из циклинов. В клеточном цикле имеется несколько так называемых сверочных точек, «чекпойнтов» (англ. check point — пост контроля на границе), при прохождении которых ферментативные системы проверяют ДНК на повреждения, и в случае их выявления активи- руют ингибиторы циклинзависимых киназ, что замедляет переход клеток из одной фазы в другую. Вероятно, замедление перехода дает больше возможности для репарации повреждений ДНК, возникающих в процессе нормальной жизнедеятельности клетки. При нанесении клетке значительного количества повреждений эта система также приводит к задержке прохождения цикла, но, по-видимому, не может обеспечить необходимый уровень восстановления. Блок в прохождении цикла нагляднее всего проявляется в виде задержки наступления первого постлучевого митоза. Механизм индукции и реализации программируемой смерти клетки (апоптоза). Еще одним следствием повреждения молекул ДНК является включение процесса программируемой клеточной смерти — апоптоза. Многие виды клеток после облучения погибают как по апоптотическому, так и по некротическому пути, но ряд клеток, прежде всего лимфоидного происхождения, погибает в основном путем апоптоза. Клетки лимфоидного происхождения значительно более радиочувствительны, чем клетки любого другого происхождения. Их более ранняя гибель и высокая радиочувствительность объясняются запуском механизма программируемой смерти при таком уровне поражения ДНК, который сам по себе приводит клетку к гибели с гораздо меньшей вероятностью. Апоптотическая смерть клетки в принципе является нормальным для организма процессом, участвующим в онтогенезе, дифференцировке, реакции на генотоксические внешние воздействия. Апоптотическая смерть — один из наиболее важных способов сохранения организмом своего гомеостаза, роль которого особенно велика в противодействии злокачественному перерождению. Именно путем апоптоза происходит удаление трансформированных клеток. В клетке существует механизм выявления нарушений в структуре ДНК, сопряженный с выдачей сигнала на систему ее разрушения. Так работает опухолевый супрессор, белок р53, продукт гена р53, который воспринимает информацию о повреждении молекулы ДНК и затем активирует каскад ферментативных реакций внутриклеточной трансдукции сигналов апоптоза, запускающих ферменты, разрушающие определенные (но не все) клеточные структуры. Нарушение работы гена р53 приводит к повышению вероятности малигнизации клетки. На молекулярном уровне выделяют три стадии апоптоза — стадию выявления нарушений в структуре клеточных компонентов и индукции сигнала к апоптотической смерти, стадию «принятия решения» и стадию «исполнения приговора». Сигналом к индук- ции апоптоза служит либо повреждение ДНК (обнаруживаемое с участием белка р53), либо повреждение митохондриальных мембран, ведущее к выходу из митохондрий в цитоплазму цитохрома С. Выход цитохрома С обнаруживается белком Apaf-1. Сигнал к апоптозу могут давать также внеклеточные домены трансмембранных белков суперсемейства TNF — подобных рецепторов (TNF — от англ. tumor necrosis factors — факторы некроза опухолей). На второй стадии процесса действует несколько про- и анти-апоптотических модуляторов, и сигнал к апоптозу может быть заблокирован. Если трансдукция сигнала не прервана, то инициируется третья, завершающая стадия апоптотической гибели клетки — активируются эффекторные («киллерные», «казнящие») каспазы. Каспазы — это цистеиновые протеиназы, расщепляющие белки по остаткам аспарагиновой кислоты. Клеточная мембрана в процессе развития апоптоза образует быстро возникающие и исчезающие выпячивания, так называемые блебы (от англ. bleb — волдырь). Затем клетка 3 округляется, а через некоторое время распадается на «апоптозные тела», которые содержат хроматин, митохондрии и лизосомы и окружены остатками клеточной мембраны. Однако мембрана в апоптотических телах как бы вывернута наизнанку — на ее внешней поверхности находятся молекулы фосфатидилсерина, которые в живой клетке всегда находятся на внутренней поверхности. Фосфатидилсерин на внешней стороне мембраны служит специфическим маркером клетки, погибающей по апоптотическому пути, и участвует в адгезии апоптозных тел на поверхности макрофагов, эпителиальных, а в злокачественных новообразованиях — окружающих клеток, которые затем их фагоцитируют и переваривают. При апоптотическом распаде клетки отсутствует излияние цитозоля в окружающую среду. Таким образом, во внешнюю среду не выходят лизосомальные ферменты, благодаря чему гибнущие по этому пути клетки не вызывают в ткани воспалительной реакции. Считается, что утеря клеткой апоптотического потенциала является одной из предпосылок злокачественного перерождения. Наиболее часто этому способствует выключение гена р53. Предполагается, что гибель по апоптотическому пути может происходить при повреждениях ДНК, не являющихся препятствием к жизнедеятельности клетки. Основанием к такому выводу служит судьба лимфоидных клеток, погибающих по апоптотическому пути при более низких дозах, чем клетки, в основном погибающие по некротическому пути. При апоптозе ДНК распадается на строго определенные фрагменты, при некрозе — на участки различной длины. При некрозе ядерная и клеточная мембраны разрушаются на самых ранних этапах гибели, при апоптозе даже апоптозные тела окружены мембранами. Хромосомные аберрации и микроядра Хромосомные аберрации (перестройки) являются классическим проявлением лучевого поражения клеток. Их появление было обнаружено уже на заре радиобиологических исследований, и их количество соответствует дозе облучения, что используется при биологической дозиметрии. Появление аберраций отражает образование разрывов молекулы ДНК и дефекты ее репарации. Разрывы приводят к фрагментации хромосомы. Под фрагментом понимают ту часть хромосомы, которая не связана с центромерой. Центромера — это структура, расположенная в середине хромосомы, за которую она притягивается к полюсу деления, иными словами, — к месту, где будет формироваться ядро будущей дочерней клетки. Фрагмент хромосомы, не связанный с центромерой, не притягивается к полюсу деления и распределяется между дочерними клетками случайным образом. Фрагменты хорошо видны во время метафазы и особенно анафазы, когда все хромосомы притянуты нитями веретена к полюсам деления, а фрагменты остаются посередине клетки. После завершения деления клетки, т. е. в интерфазе, фрагменты проявляются как микроядра — участки конденсированной ДНК, в то время как почти вся остальная ДНК переходит в деконденсированное состояние. Неверное воссоединение разрывов, когда при репарации происходит соединение участков ДНК из разных мест одной и той же хромосомы или разных хромосом, во время митоза проявляется в виде хромосомных перестроек. Аберрации изучают в клетках, находящихся в метафазе или анафазе, когда все интактные хромосомы расходятся по полюсам клетки, а в центре остаются фрагменты и связанные между собой хромосомы («мосты»), которые должны были бы разойтись по дочерним клеткам. Метафазный анализ хромосом проводят только in vitro, а анафазный можно проводить и in vivo. Для получения статистически значимых результатов при изучении зависимости числа хромосомных перестроек от дозы излучения методом метафазного анализа требуется проанализировать хотя бы несколько десятков так называемых метафазных пластинок. Классическим объектом изучения являются лимфоциты, которые запускаются в деление с помощью фитогемагглютинина, вводимого в питательную среду. Так как лимфоциты растут 4 во взвеси, клетки в состоянии митоза нельзя получить стрясыванием с подложки, как это описывалось в предыдущем разделе. Митотические клетки накапливают введением в среду колхицина или других агентов, не дающих клетке закончить деление, но не препятствующих конденсации хроматина в хромосомы и вступлению клетки в митоз. Однако в метафазной пластинке, в которой тесно собраны все хромосомы, невозможно исследовать их структуру. Для рассредоточения хромосом клетки помещают в гипотонический раствор, где объем клетки значительно увеличивается, так что хромосомы расходятся друг от друга. Путем «раскапывания» клеточной суспензии на влажное стекло хромосомы каждой клетки равномерно распределяются на большей площади, что облегчает их детальное изучение. Возникающие в клетке аберрации подразделяют на хромосомные и хроматидные. Хромосомные аберрации возникают в случае, когда клетка подверглась облучению до начала удвоения определенного участка своего генома. При неверном воссоединении оторванных друг от друга фрагментов ДНК такое нарушение воспроизводится во время репликации (удвоении). Итогом является образование дицентриков — хромосом, имеющих две центромеры, что может сопровождаться появлением ацентрических фрагментов, хорошо видных при сравнении метафазных пластинок облученных и необлученных лимфоцитов. Хроматидные аберрации возникают в клетке, облученной уже после завершения репликации всей ДНК или того ее участка, разрыв которого и приведет к формированию аберрации. Разрыв одной из хроматид проявится в виде ее укорочения и образования ацентрического фрагмента, который будет виден при мета- или анафазном анализе. Аберрации, сопровождающиеся образованием ацентрических фрагментов и дицентриков, получили название нестабильных, так как приводят к гибели самой облученной клетки или ее ближайших потомков из-за невозможности равномерного распределения генетического материала между дочерними клетками. Перестройки, сопровождающиеся только перемещением участков пораженных хромосом, когда весь генетический материал остается связанным с центромерой и может распределяться между дочерними клетками, относят к стабильным перестройкам, так как они могут передаваться в ряду клеточных поколений, сохраняясь в организме в течение многих лет. Примером являются транслокации, когда участок генома перемещается в новое для него место, но продолжает функционировать. Их изучение стало возможным благодаря разработке методов дифференцированной окраски отдельных участков хромосом. Такие методы позволяют обнаруживать, например, симметричные обмены и инверсии в клетках лиц, подвергшихся облучению более 50 лет тому назад в результате атомных взрывов и радиационных аварий В настоящее время одним из наиболее совершенных методов анализа хромосомных перестроек является использование флюоресцентной метки, присоединенной к фрагментам ДНК, комплементарным для ДНК определенных участков генома. Для него обычно используют английское название — FISH (от fluorescence in situ hybridization). Кривые «выживаемости». Кривые выживаемости обычно строят в системе полулогарифмических координат, откладывая по линейной оси абсцисс дозу излучения, а по логарифмической оси ординат — фракцию или процент выживших клеток. При использовании редкоионизирующих излучений выживаемость клеток сначала снижается медленно, но с нарастанием дозы скорость снижения увеличивается, после чего остается постоянной. Пологий участок кривой доза—эффект носит название плеча, более крутой — линейного участка. Формальное объяснение такой зависимости — необходимость выделения в мишени для ее поражения нескольких порций энергии, так как при действии излучений с небольшой ЛПЭ выделения одной порции энергии недостаточно для поражения. С началом облучения в каждой мишени как бы накапливается число таких порций энергии, а 5 с момента, когда в мишенях для поражения будет не хватать всего одной порции, за- висимость доза—эффект станет прямолинейной. Кривые выживаемости в области малых доз облучения. В последнее десятилетие большое внимание исследователей привлечено к изучению формы кривой доза—эффект в области малых (до 0,8 Гр) доз излучения. Этот диапазон наиболее интересен с позиций радиационной безопасности, так как при профессиональном контакте с излучениями, а также при радиационных авариях наибольшее число лиц подвергается воздействию именно в этих дозах. Высокая радиочувствительность при низких дозах связывается с «молчанием» системы репарации, для включения которой требуется переход некоего порогового уровня повреждения ДНК. Включение системы репарации сразу же снижает повреждение клеток — этим объясняется существование плато у кривой доза—эффект у части клеточных линий и даже повышение выживаемости у остальных линий, демонстрирующих эффект гиперчувствительности при низких дозах. Ход кривой выживаемости при больших дозах определяет соотношение нанесенных и отрепарированных повреждений ДНК. «Коммунальный» эффект. Коммунальный эффект, также называемый «эффектом свидетеля» (по англ. bystander effect), заключается в поражении клеток, находящихся вне зоны воздействия радиации, но контактирующих тем или иным способом с облучаемыми клетками. При этом имеется в виду как непосредственный контакт облученных и необлученных клеток, так и их нахождение в одном и том же культуральном сосуде, а в ряде случаев — и контакт необлученных клеток со средой, в которой другие клетки подвергались облучению. Феноменология «опосредованного» действия излучений изучается в опытах двух видов: исторически первыми были эксперименты по цитотоксическому действию биологических жидкостей, в которых происходило облучение клеток, на интактные объекты. В последние годы наибольший интерес вызывают технически сложные эксперименты по локальному облучению отдельных клеток в культуре или даже отдельно цитоплазмы и ядра отдельных клеток с регистрацией различных форм цитотоксического эффекта у окружающих интактных клеток. Таким образом, коммунальный эффект наблюдается как in vitro, так и in vivo. В работах И. Эмерита с соавторами 1985—1995 гг. было показано, что эти кластогенные факторы имеют небольшой молекулярный вес — от 1000 до 10 000 дальтон и что в их возникновении играет роль оксидативный стресс и перекисное окисление липидов. На участие высокоактивных производных кислорода указывает снижение эффекта при введении в среду антиоксидантов и диметилсульфоксида, перехватчика радикалов. В работах 2000—2003 гг. С. Мотерсилл, С.Б. Сеймур и их сотрудники продемонстрировали, что при облучении культуры клеток или эксплантата ткани в широком диапазоне доз — от 1 сГр до 5 Гр, в культуральную среду выделяются термолабильные, но устойчивые к замораживанию факторы (скорее всего, белковой природы), которые вызывают гибель интактных клеток, длительное снижение их клоногенного потенциала, а на молекулярном уровне — быстрое изменение проницаемости клеточной мембраны для кальция с последующим изменением проницаемости мито-хондриальных мембран и образованием высокореактивных соединений кислорода. X. Насагава и Дж.Б. Литтл, в 1992 г. изучили индукцию сестринских обменов хроматид в клетках китайского хомячка линии СНО при низкоинтенсивном облучении α-частицами. Авторы обнаружили сестринские обмены у 30% клеток после облучения культуры в дозе 0,31 мГр, при которой α-частицы попадают не более чем в 1 % клеток. Изучение обнаруженного эффекта другими авторами показало, что сигнальные вещества формируются с участием оксидативного стресса, а для проявления эффекта важен межклеточный контакт. |