Фарма. Современные проблемы применения ЛС растительного происхождения. Современные проблемы применения лс растительного происхождения. Надо сделать
 Скачать 40.54 Kb.
|
|
Современные проблемы применения ЛС растительного происхождения. Надо сделать: Пройти лекцию до конца К настоящему времени Вы заработали баллов: 0 из 0 возможных. 1 Культура тканей. Еще в начале XX века ЛР составляли около 80% всех используемых лекарственных средств (ЛС). Позже, благодаря успехам химии, синтетические, гормональные препараты и антибиотики значительно потеснили фитопрепараты. Лекарственные растения (ЛР) содержат биологически активные вещества (БАВ), которые влияют на биологические процессы в организме человека и животных. Структура многих БАВ настолько сложна, что растения еще долго будут являться их единственным источником. Известно около 20000 веществ, которые получаются только из растений. В России препараты растительного происхождения составляют около 40% общего количества используемых в практической медицине лекарственных средств [11]. В странах Евросоюза этот показатель меньше: на растительные лекарства приходится до 10% общего объема рынка ЛС. Зато в Японии и странах Юго-Восточной Азии – до 40%. А в некоторых странах (Индия, Китай, Пакистан, Шри-Ланка, Мали, Танзания) фитопрепараты являются более распространенными, чем лекарства синтетического происхождения [10]. В решении задач расширения источников получения ЛРС, повышения стабильности и импортозамещения сырьевой базы перспективным направлением представляется метод биотехнологии, основанный на выращивании клеток и тканей ЛР на искусственных питательных средах. Биотехнологические способы получения массы клеток ЛР возникли на основе развития метода культуры тканей. Под «культурой тканей растений» принято понимать выращивание in vitro (в стерильных искусственных условиях) изолированных клеток, тканей, органов и их частей. Метод культуры тканей возник как экспериментальная биологическая модель, позволяющая изучать физиологические, биохимические и другие процессы на уровне автономных клеток, освобожденных от регулирующего влияния целого растительного организма. История развития Начинается в XX в. с опытов немецкого ученого Г. Габерландта (1902), впервые высказавшего идею о возможности выращивания клеток, изолированных из организма. Фундаментальные исследования Ф. Уайта (1931, США) и Р. Готре (1932, Франция) позволили определить условия для воспроизведения деления и роста клеток в культуре, и метод культуры тканей приобрел современные черты. В последующие годы были разработаны технические основы метода: отработана методика вычленения тканей и клеток из растений, получения каллусов, сохранения стерильности, усовершенствованы составы питательных сред. В результате этого стало возможным использовать метод культуры тканей для длительного выращивания недифференцированных растительных клеточных масс — каллусов, затем был разработан метод выращивания растительных клеток в суспензионной культуре и получения биомассы от единичных клеток, что позволило выделять однородный в генетическом и физиологическом отношении материал. Первыми ЛР, которые исследовали в культуре ткани, были барвинок розовый и белена черная, причем Й. Телле и Р. Готре (1947) опытами доказали способность культуры ткани белены к синтезу алкалоидов. Эти вещества накапливались в калуссной массе, получившейся в результате разрастания тканей растения, а также обнаруживались в среде культивирования. Таким образом, культивируемые растительные ткани могли использоваться для производства ЛС. Позже появились сообщения о культуре тканей других ЛР, синтезирующих уникальные продукты. В 50-х гг. XX в. стали выходить публикации о выращивании растительных тканей в виде суспензионной культуры в жидкой питательной среде, что свидетельствовало о постепенном переходе к получению больших количеств биомассы в специальной аппаратуре — хемостатах, ферментерах, турбидостатах. В это же время наметились области применения клеточных культур в фармацевтической промышленности. Первоначально метод культуры тканей разрабатывался как чисто теоретическое направление, а с середины 1960-хгг. он вошел в арсенал особой научно-производственной деятельности, известный под названием «биотехнология». Технологии, основанные на методе культуры тканей, помогают создавать новые формы и сорта сельскохозяйственных и ЛР и получать промышленным путем продукты растительного происхождения. В СССР системные исследования в этой области начались в 1957 г. в Институте физиологии растений АН СССР ученым Р. Г. Бутенко. В 1965 г. по инициативе профессора И. В. Грушвицкого при кафедре фармакогнозии Ленинградского химико-фармацевтического института была создана лаборатория по изучению ЛР в культуре invitro. Основными объектами изучения как возможных продуцентов препаратов для лечения сердечно-сосудистых заболеваний явились культуры тканей тропических видов раувольфии и растения сем. Аралиевые, известные своими тонизирующими и адаптогенными свойствами. Позже подобные лаборатории были организованы в ВИЛАРе (Москва), Томском медицинском институте, Харьковском химико-фармацевтическом институте и ряде других учреждений. До 1970-х гг. спектр соединений, которые образовывались культурами тканей в количествах, характерных для целого растения, был ограничен. Это никотин, в больших количествах (0,7 %) синтезируемый клетками табака, диосгенин в культуре диоскореи (1,6%), виснагин, содержание которого в каллусе амми зубной было в 20 раз больше, чем в растении. Экспериментальные данные, накопившиеся к данному периоду, указывали, что биосинтез многих соединений в недифференцированных тканях сильно репрессирован, а появление вторичных продуктов во многих случаях было связано с регенерацией корней, побегов и других морфологических структур, т. е. с процессом дифференцировки тканей. С начала 1970-х гг. список фармакологически ценных вторичных продуктов биосинтеза, обнаруженных в культурах тканей, значительно расширился. Способность некоторых культур к образованию соединений, не обнаруженных в исходных растениях, позволила рассматривать их как продуценты принципиально иных, нетрадиционных БАВ (убихинон-10 в культуре ткани табака, антраценгликозиды в культурах ткани следующих видов: хинное дерево и наперстянка, алкалоиды перакин, вомиленин и другие в культуре ткани раувольфии змеиной). Эти факты указывают на возможность направленного синтеза природных соединений в культуре ткани путем введения в состав питательной среды простых, доступных соединений для их биотрансформации ферментной системой культур тканей в ценные БАВ. В настоящее время подготовлена к промышленному использованию технология биотрансформациикарденолидадигитоксина в дорогостоящий дефицитный дигоксин. В 1980-х гг. на базе метода культуры ткани возникли новые направления биотехнологии, важнейшим из которых была клеточная инженерия. Изучалось поведение отдельных изолированных клеток в культуре, воздействие на клетки мутагенных факторов и условий внешней среды для получения новых форм растений, получение гибридных растений с помощью протопластов (частей клеток, лишенных оболочки). Способность клеток в культуре тканей при изменении условий культивирования давать начало целому растению привела к созданию промышленных клеточных технологий микроклонального размножения растений, позволяющих в короткие сроки (2—3 мес., а не несколько лет, затрачиваемых при использовании обычных методов) размножать ценные генотипы. В 1983 г. японская фирма MitsuiPetrochemicalIndustries опубликовала технологию получения шиконина с помощью культуры клеток воробейника краснокорневого (Lithospermum erythrorhizonSieb. etZucc.), что явилось началом эры биотехнологии, когда биотехнологическое использование культур клеток и тканей в качестве сырья в промышленных масштабах стало реальностью. Красные нафтохиноновые пигменты (производные шиконина) известны как антибактериальные и противоопухолевые вещества, также используются при лечении рожистых воспалений, микробной экземы, трофических язв и ран. В России широкое производство продуктов культуры ткани растений началось с выпуска экстракта культивируемой биомассы женьшеня. Экстракт биомассы женьшеня, или препарат Биоженьшень, стали использовать в качестве БАД к кремам, лосьонам, а в пищевой промышленности — для приготовления тонизирующих напитков. Фармакологический комитет при МЗ РФ разрешил применение настойки из биоженьшеня в качестве аналога по действию корня женьшеня. В г. Харькове (Украина) из биомассы культуры ткани раувольфии змеиной (RauwolfiaserpentinaBenth.) было налажено производство ценного антиаритмического ЛС Аймалин. Преимущества данного метода: • свести к минимуму влияние географических, климатических, сезонных и прочих условий; • добиться стандартности накапливаемых БАВ; • регулировать процесс биосинтеза БАВ с использованием разных технологических режимов; • выращивать культуры на малых площадях и использовать базу и технологии для синтеза практически всех классов БАВ в дальнейшем; • научиться получать БАВ, свойственныеинтактному растению (никотин, кодеин, хинин, диосгенин), и синтезировать новые БАВ; • изучить возможность использования культуры растительных клеток для биотрансформации БАВ в конечные ЛС; • получить возможность промышленного производства биомассы экзотических растений, малодоступных для нашей страны, например таких, как раувольфия, диоскорея, унгения и др.; Промышленный способ выращивания изолированных культур дает возможность за короткий срок (часто 1-2 месяца) получать значительный объем ценного лекарственного сырья. Можно привести пример такого известного растения, как женьшень (Panax). Из его корня выделяют панаксозиды. Запасы дикорастущего женьшеня малы, для него характерны очень медленные рост и развитие. Годовой прирост корня дикорастущего растения составляет в среднем 1 г. В условиях выращивания женьшеня на плантациях сбор рекомендуется производить только на шестом году его произрастания (к этому времени накапливается достаточно БАВ), при этом «корень жизни» сильно истощает почву, и повторно его можно высаживать не ранее чем через 10 лет. А в культуре клеток растительной ткани панаксозиды можно извлекать в достаточном количестве уже на 15-25-й день роста. По токсичности препараты, получаемые из каллусного сырья, менее опасны. Наиболее употребляемые лекарственные вещества, получаемые из растений
Промышленный способ выращивания изолированных культур дает возможность за короткий срок (часто 1-2 месяца) получать значительный объем ценного лекарственного сырья. Можно привести пример такого известного растения, как женьшень (Panax). Из его корня выделяют панаксозиды. Запасы дикорастущего женьшеня малы, для него характерны очень медленные рост и развитие. Годовой прирост корня дикорастущего растения составляет в среднем 1 г. В условиях выращивания женьшеня на плантациях сбор рекомендуется производить только на шестом году его произрастания (к этому времени накапливается достаточно БАВ), при этом «корень жизни» сильно истощает почву, и повторно его можно высаживать не ранее чем через 10 лет. А в культуре клеток растительной ткани панаксозиды можно извлекать в достаточном количестве уже на 15-25-й день роста. По токсичности препараты, получаемые из каллусного сырья, менее опасны. Условия культивирования Для начала нужен эксплант – группа клеток, отделенная от материнского организма (целого растения). Это могут быть клетки корня, листа, пыльцы и др. Для обеспечения максимальной генетической стабильности клонируемого материала в качестве исходного экспланта часто используют молодые слабодифференцированные ткани (кончики молодых стеблей и корней, пазушные почки, зародыши, части молодых проростков). Когда собирают растительное сырье с целью получения определенной группы БАВ, то используют не всё растение, а ту его часть, в которой содержание этих веществ максимальное (кора дуба, цветки василька, листья алоэ, корни одуванчика). Логично было бы предположить, что клетки именно этого органа целесообразно использовать в качестве экспланта – но не всегда. Бывает, высокая концентрация вещества отражает его накопление в ткани путем направленного транспорта, а синтезируется оно в другом месте. Вырезанные маленькие кусочки растительной ткани (2-4 мм). Их тщательно моют, стерилизуют, тщательно промывают дистиллированной водой и помещают на синтетическую питательную среду. Сосуды закрывают ватно-марлевыми тампонами и переносят в темное помещение, где строго поддерживают определенный режим. Для большинства культур нужна температура +24-26 °C, влажность 65-70%. Все манипуляции с растительным материала проводятся в ламинарном шкафу, который обеспечивает подачу стерильного воздуха в операционную зону. Через 2-3 недели образуется первичный каллус. Среды Зачем добавлять источники углерода, если растения способны к фотосинтезу? Дело в том, что в культуре клеток даже зеленеющие ткани не аутотрофны, т.е. не способны к синтезу органических веществ из неорганических. Все компоненты питательной среды надо подбирать очень внимательно – ведь концентрации различных компонентов среды могут влиять на выход продукта. Не менее важно и правильно подобрать все компоненты питательной среды, а также их правильное соотношение – ведь концентрации различных компонентов среды могут влиять на выход продукта. Например,в культуре клеток катарантуса розового (Catharanthus roseus) увеличение выхода алкалоидов, проявляющих противоопухолевое действие, было связано с увеличением в среде концентрации сахарозы [26, 27]. Наиболее популярна среда, разработанная в 1962 г. Т. Мурасиге и Ф. Скугом. На данной среде можно инициировать и поддерживать рост большого числа культур растительных тканей. Основу питательных сред составляют минеральные соли — макроэлементы (азот в нитратной и аммонийной форме, соли К, Mg, фосфаты и др.) и микроэлементы (С, Со, Мо, В, I и др.), дополняемые углеводами, витаминами, стимуляторами роста. Из-за нехватки питательных веществ клетки начнут стареть и отмирать. Чтобы этого избежать, надо проводить пассирование, т.е. через 4-6 недель пересеивать клетки на свежую питательную среду. При регулярномпассировании способность к делению может поддерживаться в течение десятков лет. Необходимость пассирования для культур клеток показали американец Ф. Уайт и француз Р. Готре в 30-х гг ХХ в. Уайт занимался выращиванием изолированных корней томатов и показал, что корневая меристема может расти неограниченно долго во времени, если ее периодически пересаживать на свежую питательную среду. Культура некоторых его клонов поддерживалась около 30 лет. Каллусообразоваие Каллус (от лат. callus – толстая кожа, мозоль) – ткань, возникающая путем неорганизованной пролиферации (размножения клеток делением) дедифференцированных (потерявших специализацию) клеток органов растений. В природе каллусная ткань образуется при травмах растений. Она защищает место поранения, может накапливать питательные вещества для регенерации. Функционирует непродолжительное время. Также каллус может образовываться in vitro («в пробирке»). При этом сначала каллусная ткань представляет собой нечто аморфное белого или желтоватого цвета. При правильном подборе компонентов питательной среды можно добиться регенерации целого растения из каллуса. Формирование каллуса длится обычно 1—2 мес. Образовавшийся каллус в асептических условиях разделяют и переносят на свежую питательную среду. Пересаженные ткани растут в контролируемых условиях при температуре 24—28 °С. Периодичность субкультивирования тканей зависит от скорости роста биомассы. Каллусная клетка развивается аналогично другим клеткам, проходя соответственно такие циклы, как деление, растяжение, дифференцировка, старение и отмирание. Кривая роста каллусной ткани имеет S-образный характер и включает пять фаз разной длительности у разных растений:  • латентная (лаг-фаза — клетки адаптируются и готовятся к делению); •линейная (рост каллусной ткани идет с постоянной скоростью); • экспоненциальная (время максимальной митотической активности — рост клетки ускорен, масса каллуса увеличивается); • стационарная (интенсивность деления резко снижается); • отмирания. Стабильность синтеза вторичных метаболитов как целевого продукта зависит главным образом от стадии культивирования и дифференциации клеток. Однако на вопрос, как связан синтез вторичных метаболитов с ростовыми процессами, ответа пока нет. У большого числа культур вторичные метаболиты синтезируются и накапливаются в значительных количествах либо во время экспоненциальной фазы, когда ростовые процессы особенно активны, либо в период стационарной фазы роста культуры клеток, когда прирост клеточной массы прекращается. Тем не менее есть культуры (например, барвинок розовый — Catharanthusroseus (L.) G. Donf.), у которых синтез вторичных метаболитов происходит в течение всего периода роста. Синтез вторичных соединений может коррелировать с процессом дифференциации в культуре клеток. Например, в суспензионной культуре мака снотворного (Papaversomniferum L.) синтез алкалоидов начинается после того, как в ней дифференцируется большое количество специализированных клеток млечников, предназначенных для депонирования метаболитов. Синтез вторичных метаболитов в культивируемых клетках связан в основном с пластидами и эндоплазматическимретикулумом. В клетках, не способных к транспорту метаболитов, продукты вторичного синтеза, как правило, накапливаются в вакуолях и свободном пространстве. Отметим, что клетки каллусной культуры обычно не транспортируют синтезируемые метаболиты в питательную среду или другие клетки, хотя некоторые культуры являются исключением, в частности культура клеток мака, которые депонируют алкалоиды в млечники. Интересно, что каллус состоит из дедифференцированных клеток. Клетки разных тканей и органов различаются по строению и выполняемым функциям. А недифференцированные клетки незрелые, не имеют определенной «профессии» в организме и способны многократно делиться. Клетки каллуса дедифференцированы, т.е. «потеряли профессию». Подобрав необходимое соотношение регуляторов роста (фитогормонов) можно добиться дифференцировки каллусных клеток. Какие клетки нам надо получить в культуре, чтобы они синтезировали нужные нам вещества? Оказывается, для разных растений по-своему – например, в суспензионной культуре мака снотворного (Papaver somniferum) синтез алкалоидов начинается только после того, как в ней дифференцируется достаточно большое количество специализированных клеток млечников, предназначенных для депонирования метаболитов. Дифференцированные корневые каллусы красавки обыкновенной (Atropa belladonna) синтезируют тропановые алкалоиды, недифференцированные – нет. Культуры клеток табака (Nicotiana) и моркови (Daucus) синтезируют большое количество никотина и антоциана при слабой дифференцировке клеток. А выход алкалоидов раувольфии (Rauwolfia) вообще наблюдается при использовании недифференцированных клеток. Все сложно, и это еще не все параметры, влияющие на биосинтез веществ клеточной культурой. Существует связь между скоростью роста культур и метаболизмом. Прямая связь – рост определяет степень агрегации клеток, оказывая косвенное влияние на синтез вторичных метаболитов. Достаточная степень агрегации может быть получена только в медленно растущих культурах. Существует и обратная связь – когда определяющим фактором является не агрегация, а кинетика скорости роста, когда первичные и вторичные пути метаболизма по-разному конкурируют за предшественник в быстро и медленно растущих клетках. Если условия среды благоприятны для быстрого роста, то в первую очередь синтезируются первичные метаболиты. Если быстрый рост блокирован, то начинается синтез вторичных метаболитов. Таким образом, низкая скорость роста клеток способствует высокому выходу метаболитов. Как вызвать морфогенез (образование органов)? Во-первых, для индукции морфогенеза in vitro необходимо вызвать неоднородность в клеточных популяциях. Важнейшим условием морфогенеза является адгезия клеток (соединение клеток между собой), в результате которой образуется ткань и орган. Поэтому важна гравитация, способствующая клеточной дифференциации, что было доказано с помощью экспериментов с каллусной тканью пшеницы и кукурузы в космических условиях М. Карабаевым (1994 г.). Какие именно органы будут образовываться из клеточной культуры? Это будет зависит от соотношения фитогормонов – ауксинов и цитокинов. Ауксины вызывают процессы дедифференцировки и последующей вторичной дифференцировки клеток и подготавливают их к делению, а цитокинины инициируют клеточное деление. При изменении соотношения между этими фитогормонами и при добавлении других фитогормонов могут быть вызваны разные типы морфогенеза. Можно внести в питательную среду предшественник нужного нам продукта. Например, в корневищах тропической лианы диоскореи (Dioscorea) содержится диосцин. Это стероидный сапонин, который при гидролизе расщепляется на диосгенин и сахара. Диосгенин используют для производства гормональных препаратов, таких как кортизон и прогестерон. Если вы внесете аминокислоту фенилаланинв среду для культивирования клеток, то добьетесь увеличения выхода диосгенина на 100%. Здорово, правда? Также накопление вторичных метаболитов зависит от света, температуры, рН, а при суспензионном культивировании от аэрации, перемешивания, скорости вращения сосудов, от газового состава и т.д. [25]. ИММОБИЛИЗАЦИЯ Повысить выход целевого продукта можно с помощью иммобилизации. Что это такое, догадаться несложно: если «мобильный» – это способный быстро перемещаться, то «иммобилизация» — это создание неподвижности. Иммобилизованные клетки образуют биомассу гораздо медленнее, чем растущие в жидких суспензионных культурах, но они способны к интенсивной выработке метаболитов. Одно из условий при иммобилизации клеток – выделение метаболита в питательную среду, из которой он должна быть легко извлечен (например, алкалоиды). ПРИМЕРЫА сейчас давайте подробно рассмотрим пару примеров применения клеточных культур растений для синтеза таких необходимых нам лекарств. И начнем с получения карденолидов, гликозиды которых используют в медицине для лечения болезней сердца. Это особенно актуально, т.к. по данным ВОЗ сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смерти во всем мире – ежегодно от них умирает больше людей, чем от какой-либо другой болезни. Наперстянка пурпурная (Digitalispurpurea) содержит сердечный гликозид дигитоксин, а из цветков наперстянки шерстистой (Digitalislanata) извлекают дигоксин. Дигитоксин и дигоксин – это фитостероиды, сходные по структуре и эффектам. Сходные, но не одинаковые. С химической точки зрения дигоксин отличается от дигитоксина лишь дополнительной гидроксильной группой на двенадцатом атоме углерода. Различия в структуре обусловливают отличия в фармокологическом действии и свойствах. Дигоксинвыводится из организма через почки, а дигитоксин — через печень, поэтому он может быть использован пациентами с неустойчивыми функциями почек. Тем не менее, в настоящее время дигитоксин редко применяется в западной медицинской практике. А вот дигоксин является эталонным медикаментом группы сердечных гликозидов. По сравнению с дигитоксином он обладает меньшей липофильностью (большей полярностью), а также быстро всасывается и сохраняет активность при энтеральном введении. В меньшей степени, чем дигитоксин связывается с белками плазмы крови и быстрее выводится из организма. Использование дигоксина предпочтительнее из-за его меньшей токсичности, по сравнению с таковой у дигитоксина. Дигоксин включен в список основных лекарственных средств Всемирной организации здравоохранения — перечень наиболее важных лекарственных средств, необходимых в базовой системе здравоохранения. Клеточную культуру можно использовать для биотрансформации. В клетках растений локализованы ферменты, способные менять функциональные группы добавленных из вне химических соединений. Недифференцированные культуры клеток наперстянки шерстистой сами не синтезируют сердечные гликозиды. Однако они могут осуществлять реакции биотрансформации субстратов, добавленных в питательную среду. Методы получения каллусной ткани. Культивирование тканей растений можно осуществлять на агаризованных питательных средах, имеющих плотную консистенцию, или в жидкой среде. 1.В первом случае ткани образуют скопление недифференцированных клеток, называемых каллусом или биомассой, 2.во втором — клетки при размножении образуют суспензии. Из сравнения каллусных и суспензионных культур следует, что выход продуктов вторичного метаболизма выше в каллусных культурах, но при этом управление процессом культивирования легче осуществлять при работе с суспензионными культурами. Использование технологий получения каллусных культур из ЛРС дает такие преимущества, как надежность и стабильность биомассы и выхода продуктов вторичного метаболизма, а также возможность использования каллусной системы для иммобилизации с последующей биотрансформацией. Развитие суспензионного метода выращивания (в жидкой питательной среде) позволило превратить культуры тканей растений в удобную модель для исследований. Разрабатываются способы культивирования, сочетающие применение жидкой питательной среды и твердого субстрата, поддерживающего тканевую массу на поверхности, — так называемые иммобилизованные клеточные культуры. В качестве подложки могут использоваться гели из агарозы, альгината, нейлона, полиуретана, полиакриламида, шарики из стекла и др. Иммобилизованные каллусные клетки прекращают рост, но продолжают синтез метаболитов, выделяя их в среду. Основные преимущества иммобилизации — выделение клетками метаболитов в питательную среду, из которой их легко извлечь. Кроме того, иммобилизованные клеточные культуры растений часто используют для биотрансформации. Довольно часто синтез метаболитов в суспензионной культуре останавливается на промежуточных этапах, не давая необходимого конечного продукта. В этом случае для получения конечного продукта необходима биотрансформация этих метаболитов с помощью культур других растений (или даже клеток бактерий) в целях повышения биологической активности конкретной химической структуры. Так, растения наперстянки шерстистой (DigitalislanataEchrh.) в большом количестве синтезируют дигитоксин, а не дигоксин. Для соответствующей биотрансформации с успехом используют недифференцированную суспензионную культуру наперстянки, которая с помощью ферментов осуществляет необходимое превращение БАВ. Другой пример: клетки суспензионной культуры из корня женьшеня (Panaxginseng C. A. Mey.) способны биотрансформировать (гликозилировать) фенольные соединения — продукты жизнедеятельности клеток его каллусной культуры. Факторы, влияющие на продуктивность культур тканей. Стрессовые факторы. Количество образованных вторичных продуктов в культуре ткани может резко возрастать под влиянием некоторых стрессовых факторов (воздействие продуктов жизнедеятельности микроорганизмов, осмотического шока, токсических ионов тяжелых металлов и т. д.). Вторичные продукты растений часто являются фитоалексинами, и их синтез в растительной клетке происходит в ответ на действие продуктов жизнедеятельности микроорганизмов для защиты от фитопатогенов. При добавлении к культуре ткани элиситоров (компоненты стенок грибного мицелия или какие-либо другие продукты жизнедеятельности микроорганизмов) интенсивность синтеза клетками растений некоторых фармакологически ценных веществ возрастает. Поэтому Институт биотехнологии (г. Саскачеван, Канада) в целях уменьшения себестоимости конечного продукта предложил промышленный способ получения сангвинарина из клеточных культур мака путем элиситации алкалоида гомогенатом из мицелия гриба питиум (Pythiumaphanidermatum (Edson.)Fitzp.). Кроме элиситоров грибного и микробного происхождения биосинтез вторичных продуктов могут стимулировать химические вещества. Так, сульфат ванадия способствовал увеличению почти в 2 раза содержания индольных алкалоидов аймалицина и катарантина в культивируемых клетках барвинка розового (Vincarosea L.). В настоящее время не известен ни механизм воздействия VaSO4 на синтез вторичных продуктов, ни место его аккумуляции. Тем не менее обработка клеток ванадием способствовала сокращению периода роста, увеличению выхода индольных алкалоидов и, в отличие от грибных элиситоров, не требовала выращивания грибов и получения из них элиситора. В настоящее время найдены условия размножения более 500 экономически важных или исчезающих видов дикорастущих растений и тем самым сохранения природного биоразнообразия, представляющего собой одно из богатств государства и важнейшее условие нормального существования и жизнедеятельности человека. Многие из таких видов размножаются уже в производственных условиях. Технологии микроклонального размножения ЛР разработаны в отделе биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений АН России (Москва) для мандрагоры туркменской, аристолохии маньчжурской, женьшеня; в Химико-фармацевтической академии (Санкт-Петербург) — для ряда видов рау-вольфии; в ВИЛАРе — для стефании гладкой. Аналогичные работы проводятся в отделе биохимии и биотехнологии растений ЦБС НАН Беларуси. Таким образом, научной основой биотехнологического использования культур тканей растений в фармакогнозии является способность клеток invitro синтезировать самые разнообразные группы веществ: гликозиды, фенольные соединения, кардиостероиды, сапонины, лигнаны, флавоноиды, терпеноиды, алкалоиды и другие природные соединения. Все они — звенья сложных цепей метаболизма у растений, где выполняют определенные, часто весьма важные, функции. В заключение приведем в качестве примеров используемые в клинической практике ЛС, полученные на основе каллусных и суспензионных культур клеток ЛР: шиконин (для лечения кожных заболеваний), дигоксин (для лечения сердечно-сосудистых заболеваний), берберин (для лечения кишечных растройств — в качестве бактерицидного средства), диосгенин (как противозачаточное средство), панаксозиды (используются в качестве адаптогенов, укрепляющих иммуни ет). В последние годы число информационных сообщений, касающихся синтеза вторичных метаболитов в культурах тканей растений и имеющих значимость для фармацевтической промышленности, возросло. Ø настойка «Биоженьшень» содержит комплекс гинзенозидов (сапонинов женьшеня), выделяемый из культуры тканей Ø повышает устойчивость организма к экстремальным воздействиям: острой гипоксии, интенсивным физическим нагрузкам, гиподинамии, гипертермии, рентгеновскому облучению, действию бактериотоксинов (Слепян и др., 1989). Ø Биоженьшень проявляет противоопухолевую и антиканцерогенную активность (Беспалов и др., 1993б), в опытах на животных оказывает выраженное тормозящее действие на развитие опухолей молочной железы и нормализует уровень эстрадиола в крови (Беспалов и др., 1993а). Ø В сочетании с некоторыми полисахаридами препараты культивируемых клеток уменьшают повреждающее действие облучения и ускоряют выздоровление. Биоженьшень проявляет антимутагенные свойства (Салихова и др., 1994), что связывают с усилением процесса репарации ДНК. Культура клеток аконита При лечении аритмии сердца используют препарат Аллапинин, действующим началом которого является дитерпеновый алкалоидлаппаконитин, который получают из корневищ борца (аконита) белоустого (Aconitumleucostomum) [Машковский, 1993]. С целью увеличения сырьевой базы для производства Аллапипина проводятся исследования другого вида - борца северного (Aconitum septentrionale). Установлено, что содержание лаппаконитина в его подземной части колеблется от 0,47% до 2.31% в зависимости как от места обитания, так и от возраста растения; содержание же данного дитерпенового алкалоида в надземной части находится в пределах 0,01% - 0,1% [Федоров и др., 1996]. Успешное введении в культуру invitro этого лекарственного растения в 1988 году [Иванцов и др.]. ТИСС Таксол представляет собой алкалоид, выделенный из растений рода Taxus и обладающий значительной противоопухолевой активностью по отношению к различным линиям клеток злокачественных опухолей, в том числе линии меланомных клеток. Известно, что в основном таксол содержится в коре растения Taxus brevifolia (тисс коротколистный) в количестве 0,02% на грамм сухого веса. Из семян Тисса вида Taxus cuspidata (тиссостроконечный) получают каллусную ткань до образования соматических эмбриоидов, затем до получения эмбриогенного каллуса. Несмотря на то, что был успешно осуществлен общий синтез таксола, этот процесс, по-видимому, не может быть использован для крупномасштабного коммерческого получения данного вещества из-за своей высокой стоимости. Таким образом, таксол может быть получен только из редко встречающихся природных источников, например сырой древесины тиссового дерева. Поскольку содержание таксола в древесине тисса очень не велико, для получения 1 кг таксола необходимо срубить 2000-4000 деревьев, и производство таксола из природных источников в нужном объеме нанесет существенный урон лесным экосистемам. Соответственно, были предприняты попытки получения таксола и родственных ему соединений из клеток и тканевых культур растений рода тисс. Например, в патенте США 5019504 описан способ получения таксола или таксол-подобных алкалоидов путем культивирования тканей коры, камбия, иголок и корней различных видов тисса в питательной среде для получения каллуса или суспензионных клеточных культур с последующим выделением таксола или таксол-подобных алкалоидов. Однако с помощью описанного метода можно получить только 1,0 - 3,0 мг таксола из 1 л культуральной среды, в которой выращивалась суспензия клеток. До настоящего времени вышеуказанный метод, подразумевающий использование различных тканей тиссового дерева, не применяется в коммерческих целях из-за низкой таксолообразующей способности соответствующих клеток и непригодности различных этапов способа для крупномасштабного получения вторичных метаболитов. Сейчас разработан способ получения таксола путем культивирования тканей различных видов тисса (Taxus) преимущественно женских гаметофитов, и выделения указанного алкалоида из каллуса или суспензионных клеточных культур, полученных на основе гаметофитов. Данный способ обеспечивает получение 0,05% таксола по сухому весу суспензионных клеточных культур. Описанные способы не позволяют получать достаточное количество таксола в промышленном масштабе и до сих пор их пытаются усовершенствовать с целью повышения выхода таксола. Разработан способ получения таксола в промышленном масштабе и в первую очередь неожиданно обнаружили, что зиготные эмбрионы содержат гораздо больше таксола в пересчете на сухой вес по сравнению с другими тканями, как это сообщалось раннее. Авторы изобретения провели дальнейшие исследования, направленные на разработку способа увеличения массы эмбрионов, поскольку их размеры сами по себе очень малы, чтобы эмбрионы можно было использовать для коммерческого получения таксола. В результате авторы неожиданно обнаружили, что масса эмбрионов увеличивается в несколько сотен тысяч раз по сравнению с первоначальной, при культивировании эмбрионов в питательной среде с целью индукции соматических эмбрионов или эмбриогенного каллуса. Среда для стимуляции выхода целевого продукта содержит в качестве стимулятора углеводную фракцию, полученную экстракцией грибов (экстракт грибов рода Pestalotiopsissp), растущих на различных видах Тисса, или экстракт женских гаметофитов различных видов Тисса или фенилаланин или гибберелин. Получение берберина Берберин – это алкалоид, входящий в состав многих растений, используемых в традиционной китайской медицине. Берберин употребляют из-за его противовоспалительного и антидиабетического воздействия. Более того, он может благотворно влиять на желудочно-кишечный тракт и понижать уровень холестерина в крови. Многие лабораторные исследования показали, что он обладает анти-пролиферативная активность в отношении широкого спектра раковых клеток в культуре. Барбарис, василисник малый, коптис японский Берберина получают в иммобилизованной клеточной культуре василистника малого (Thalictrum minus L.). Существование среди рода Thalictrum таких сверх продуктивных культур, как Thalictrum rugosum (синтезирует в 10 раз больше берберина, чем интактное растение), свидетельствует о перспективности биотехнологического подхода к растениям этого рода. Способ включает иммобилизацию суспензионной культуры на кубиках пенополиуретана с последующим отмыванием кубиков от свободно суспендированных клеток на безгормональной среде в течение суток. . Известен способ получения берберина в суспензионной культуре Thalictrum rugosum. [Choi Jeong-Woo ЮЯ Korean J.Chem.Eng. - 1992 - 9 N 3. c 128-134]. Недостатком способа является то, что берберин накапливается в биомассе, а не выделяется в среду, что делает невозможным многократное использование биомассы. Наиболее близким является способ получения берберина в клеточной культуре василистника малого, иммобилизованной на Ca-альгинатные шарики. [Kobayashi Y., Fucui H., Tabata M. Effect of oxigen supply on berberine production in cells of Thalictrum minus. // Plant cell repts 1989.vol. 8, N 4 - P 255-258]. БАРВИНОК Ø Стоимость субстанции винкристина на мировом рынке достигает 30 тыс. долларов за 1 кг ,винбластина — около 20 тыс. за кг. Ø противораковые алкалоиды. v В Германии разработали способ получения кислоты розмариновой из культуры клеток каллуса( противоопухолевая активность) v Из культуры клеток табака получен убихинон 10(препарат для лечения инсультов и купирования спаечных процессов). Ø Стевиозид - естественный подсластитель и заменитель сахара, успешно используется вместо искусственных подслащивающих веществ. Исходное растение - Steviarebaudiana (Стевиямедовая) Ø Арглабин – противоопухолевое соединение. Исходное растение – Artemisiaglabella (Полынь гладкая). Входит в состав одноименного препарата. |