кинетика ферментативных реакций. Орлова Д. Реферат (кинетика ферментативных реакций). Танназы общая характеристика, продуценты и применение в промышленности
 Скачать 40.75 Kb.
|
|
МИНОБРНАУКИ РОССИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Тверской государственный технический университет» (ТвГТУ) Кафедра Биотехнологии, химии и стандартизации РЕФЕРАТ По дисциплине Кинетика ферментативного катализа На тему: «Танназы: общая характеристика, продуценты и применение в промышленности» Выполнила: студентка 3 курса Группы Б.БТ.ПБ. – 18.03 Орлова Д.А Приняла: доцент кафедры БХиС Ожимкова Е.В. Тверь 2021 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ Таннины присутствуют в различных растениях, которые используются в качестве пищевых продуктов и кормов . Таннины с одной стороны полезны для здоровья в связи с их химиопрофилактической активностью против канцерогенеза и мутагенеза, а с другой стороны – они могут быть вовлечены в формирование рака, гепатотоксическую или антипитательную активность . Таннины известны как антинутриенты, то есть они снижают эффективность преобразования организмом усвоенных питательных веществ в новые вещества. Свойства таннинов напрямую зависят от их молекулярной массы. Экспериментально доказано, что чем выше молекулярная масса молекул таннинов, тем сильнее антипитательные эффекты и ниже биологическая активность [1, 2]. Несмотря на то, что таннины оказывают токсическое воздействие на различные организмы, некоторые микроорганизмы устойчивы к действию таннинов и обладают способностью деградировать их в олигомерные таннины и другие полезные производные, такие как галловая кислота или пирогаллол. Галлотаннины деградируют некоторые бактерии, грибы и дрожжи, которые могут гидролизировать только остатки галлоил эфиров таннинов. Таннинацилгидролаза (КФ 3.1.1.20) широко известна как танназа, катализирует гидролиз галлоил эфирной связи таннинов. Танназа принадлежит к суперсемейству эстераз. С момента своего открытия танназа нашла широкое применение в пищевой, кормовой, фармацевтической и химической промышленности . Несмотря на значительный интерес и длинную историю изучения танназы, мало научных данных про ее молекулярное строение. Это один из важнейших факторов, который ограничивает широкомасштабное применение танназы. Насколько известно, только бактериальная танназа проанализирована на генетическом уровне. Кроме того, охарактеризована биохимия и структура танназы Lactobacillus plantarum. Lactobacillus plantarum наиболее часто встречается при ферментации растительных материалов с высоким содержанием таннинов [3, 5, 6, 8]. Растительная пища является главным источником таннинов – биологически активных фитонутриентов, которые проявляют проапоптотические и антиметастатические свойства . Несмотря на многообещающий химиопрофилактический потенциал таннинов, результаты исследований на людях по оценке связи между потреблением продуктов, богатых таннинами и риском развития колоректального рака, являются дискуссионными. Предполагается наличие взаимодействия между микробиотой и таннинами продуктов питания. Микрофлора желудочно-кишечного тракта человека имеет глубокое влияние на трансформацию пищи в метаболиты, которые могут повлиять на здоровье человека. Таким образом, высокоспецифическая активность бактерий, в частности таннин-метаболизирующая активность, может рассматриваться как один из критериев отбора пробиотических штаммов для дальнейшего их использования в фармацевтической и пищевой промышленности [10,9]. Общая характеристика таннинов Таннины (от франц. tanner – дубить кожу) – водорастворимые фенольные продукты, способные преципитировать белки из водных растворов. Таннины являются второй по распространѐнности в природе группой фенолов (после лигнинов) и считаются вторичными метаболитами растений. Таннины содержатся в коре, древесине, листьях и (или) плодах (иногда семенах, корнях, клубнях) многих растений и придают листьям и плодам терпкий вкус. Они обладают определенным спектром биологических свойств, обеспечивающих механизмы защиты растений от вредителей и болезней, вызванных бактериями и вирусами. Таннины подавляют рост ряда микроорганизмов и устойчивы к микробному действию [1]. Таннины представляют собой группу сложных веществ, построенных из олигомерных цепей, характеризующихся наличием полифенольных соединений. Они имеют молекулярную массу от 500 до 20000 кДа. Одной из определяющих свойств таннинов является способность образовывать прочные комплексы с белками и другими макромолекулами, такими как крахмал, целлюлоза и минералы. Различают гидролизуемые и конденсированные (негидролизуемые) таннины. По современной классификации выделяют четыре класса таннинов: галлотаннины, эллаготаннины, конденсированные таннины и комплексные (гидролизуемые таннины) [1]. Галлотаннины являются простой группой таннинов, которые по химическому строению представляют эфиры галловой кислоты и глюкозы (реже других сахаров). Однако эта связь легко гидролизуется в кислой или щелочной среде, при повышении температуры и под действием фермента. Эллаготаннины – это сложные эфиры гексагидродифенильной кислоты (HHDP) с глюкозидами. В результате гидролиза эллаготаннинов HHDP-группа дегидратируется и образуется эллаговая кислота. Конденсированные таннины – это олигомерные и полимерные антоцианидины – производные флаван-3- олов (катехинов) и флаван-3,4-диолов (лейкоантоцианидин), которые могут состоять из более чем 50-ти флавоноидных мономеров [5]. Таннины обладают механизмами защиты от заболеваний, вызванных патогенными грибами, бактериями и вирусами. Горький вкус таннинов помогает защитить растения от насекомых и плотоядных животных. Из литературных данных известно, что повышенное количество таннинов в почве подавляет интенсивность роста растений, отрицательно влияет на урожайность. Также присутствие таннинов усложняет некоторые технологические процессы в пищевой промышленности и ингибирует ферментативные реакции в пивоварении. Повышенное содержание таннинов в кормах для животных снижает эффективность пищеварения и, как следствие, продуктивность сельскохозяйственных животных. Есть сообщения, что снижение содержания таннинов ведет к интенсификации ассимиляции азота у жвачных животных и, соответственно, росту производства молока. Установлено, что таннины, содержащиеся в продуктах питания, принимают участие в развитии некоторых видов рака. Лекарственные свойства растений часто обусловлены именно наличием полифенольных соединений. Поэтому с древних времен в медицине применяются растительные экстракты, богатые таннинами. Например, экстракт чая традиционно применяется в Китае и Японии как противовоспалительное, мочегонное, антисептическое, кровоостанавливающее средство, а также в лечении раковых образований . Таннины, как фенольные соединения, являются эффективными хелаторами для ионов металлов, поэтому они могут использоваться в лечении отравлений тяжелыми металлами. Появляются сообщения о потенциальном ингибирующем действии таннинов ВИ Ч-1. Как уже упоминалось выше, таннины известны как антинутриенты. Однако в то же время встречается много сообщений о позитивных эффектах таннинов на здоровье человека: противоопухолевые эффекты, способность понижать артериальное давление и модулировать различные виды иммунного ответа. Вероятно, данные эффекты связаны с антиоксидантными свойствами таннинов. Сообщалось, что эллаговая кислота является эффективным антиоксидантным таннином с противоопухолевыми свойствами. Проантоцианиды, имеющиеся в винограде и оливках, представляют еще один тип таннинов с чрезвычайно высокими антиоксидантными свойствами. Таким образом, таннины, присутствующие в пищевых продуктах растительного происхождения в различных концентрациях, оказывают видимое влияние на здоровье человека. Важно также отметить, что принимать высокие количества таннинов не следует, поскольку они могут включаться в процесс формирования злокачественных опухолей и препятствовать нормальному пищеварению. Однако, прием адекватных количеств таннинов правильного типа является полезным для здоровья человека вследствие их воздействия на метаболические ферменты, иммуномодуляцию и другие функции [1]. Продукты анаэробного разложения многих таннинов, образующихся в кишечном тракте, также могут образовывать соединения с полезными для здоровья человека эффектами. Такие продукты разложения представляют собой, например, производные пропионовой или фенилуксусной кислот [2]. Эти соединения оказывают противовоспалительное действие при всасывании в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ). Данные вещества, наряду с другими продуктами разложения таннинов, также обладают широким диапазоном противомикробного действия в ЖКТ, подавляя развитие патогенных микроорганизмов. Биодеградация таннинов Как было отмечено выше, таннины обладают токсичными и бактериостатическими свойствами и необратимо образуют соединения с белками, а наличие таннинов является одним из защитных механизмов растений от микроорганизмов. Но, несмотря на антимикробные свойства таннинов, много грибов, бактерий и дрожжей достаточно устойчивы к таннинам и способны расти и развиваться при их присутствии . Механизмы, благодаря которым микроорганизмы обладают устойчивостью, включают модификацию, деградацию, диссоциацию таннин-субстратных комплексов, инактивацию таннинов путем связывающей способности и т.д. [4]. Плесневые грибы, дрожжи и некоторые аэробные бактерии обычно лучше подходят для деградации таннинов, однако анаэробная деградация также имеет место быть, например, в желудочно-кишечном тракте. Каждая группа микроорганизмов обладает специфическими свойствами в процессе разложения таннинов. Так, дрожжи, проявляя активность по отношению к галлотаннинам, не способны разлагать высокомолекулярные дубильные соединения. Бактерии обладают способностью деградировать галлотаннины и эллаготаннины. Грибы же, в свою очередь, могут раскладывать все типы таннинов [7]. Как было отмечено, таннины играют значительную роль в природе и имеют мощный потенциал промышленного применения, однако метаболические пути и механизм их разложения изучены не полностью. Известно, что в метаболизме таннинов принимает участие ряд ферментов: таннинацилгидролаза или танназа (КФ 3.1.1.20), галлатдекарбоксилаза (КФ 4.1.1.59), пирогаллол-1,2-диоксигеназа (КФ 1.13.11.35), флороглюцинредуктаза (КФ1.3.1.57), дигидрофлороглюцинолгидролаза (КФ3.7.1) пирогаллолфлороглюцинолизомераза (КФ 5.4.99), фенолоксидаза и т.д. Основным ферментом, участвующим в процессах разложения дубильных веществ, в частности галлотаннинов, является танназа. В природе этот фермент может быть животного, растительного и микробного происхождения. Наибольшее значение имеет именно танназа микробного происхождения . Танназа гидролизирует таннины, уменьшая их концентрацию, и в результате образуются продукты, часть которых используются в качестве источника энергии. Установлено, что танназа действует на галлотаннины, эллаготаннины и комплексные таннины, разрывая только эфирные связи, при этом не нарушает С-С-связи, а потому не влияет на конденсированные таннины. Гипотезы о способности бактерий преобразовывать таннины включают: процессы модификации, деградации, инактивации таннинов, а также модификации мембран и поглощения ионов металлов . Танназа оказывает последовательное действие, в результате чего происходит деградация таннинов с последующим гидролизом сложных эфирных связей с высвобождением галловой кислоты. Далее галловая кислота декарбоксилируется через декарбоксилазы галловой кислоты в пирогаллол, который, в конечном счете, превращается в пировиноградную, цисаконитовую, 3-гидрокси-5-оксигексановую кислоты и, наконец, входит в цикл трикарбоновых кислот. Галловая кислота – один из основных продуктов разложения танниновой кислоты. Галловая кислота легко утилизируется путем окисления до простых алифатических кислот, входящих в цикл трикарбоновых кислот [10]. Танназа катализирует гидролиз эфирных связей в таннинах. Продуктами гидролиза является глюкоза и галловая кислота. Галловая кислота обнаружена в растениях, как в свободном виде, так и в форме эфиров. Галловая кислота и ее производные используется в промышленности как антиоксидант. Хотя галловая кислота широко распространена в природе, она легко окисляется при нейтральном и щелочном рН, образуя продукты, сложно доступные для использования микроорганизмами в качестве источников углеродного питания. Фактически, только для бактерий рода Pseudomonas была зарегистрирована способность использовать свободную галловую кислоту в качестве единственного источника углерода и энергии в аэробных условиях [3]. Также следует отметить, что среди микроорганизмов, которые используют галловую кислоту в качестве единственного источника углерода и энергии, есть такие, которые осуществляют неокислительное декарбоксилирование галловой кислоты, но не имеют механизмов для дальнейшего расщепления пирогаллола, образованного в результате этого пути. Так, различные штаммы видов Pantoea agglomerans, Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumonia, Streptococcus gallolyticus, Lactobacillus plantarum декарбоксилируют галловую кислоту в пирогаллол без дальнейшего метаболизма. Танназа была впервые обнаружена в ходе исследования образования галловой кислоты в водном растворе таннинов, где выращивались два вида грибов, идентифицированные позднее как Penicillium glaucum и Aspergillus niger. В течение следующих ста лет у многих нитчатых грибов, в основном таких видов как Aspergillus, Peniсillium, Fusarium и Trichoderma, была обнаружена способность к биосинтезу танназы. Бактерии и дрожжи также продуцируют этот фермент. В связи с этим в последнее десятилетие были проведены исследования процессов продуцирования, экстракции и очистки танназы. Эти исследования включают в себя поиски высокоактивных продуцентов, оптимизацию условий их культивирования, применение рекомбинантных микроорганизмов и разработки технологий для восстановления и очистки танназы [9]. Свойства танназы Строение и свойства танназы зависят от разных факторов: продуцента, условий культивирования и т.д. Свойства танназы бактериального происхождения отличаются в зависимости от микроорганизмапродуцента. Молекулярная масса фермента варьирует в пределах 31-320 кДа. Танназа является кислым белком с оптимумом действия рН 4,5-7,0. Сообщается о ферментах, сохраняющих свою активность и при щелочных рН 8,0-8,9. Температурный оптимум для танназы варьирует в зависимости от продуцента, для бактериальной – находится в диапазоне 30-40°С. Установлено, что для каталитической активности танназы у более 28% известных бактерий-продуцентов необходимо присутствие ионов металлов, которые являются кофакторами, особенно Mg2+. В то же время ионы Fe2+, Fe3+, Cu2+ и Hg2+ выступают ингибиторами танназы . Поскольку танназа имеет прикладное значение, особенно в пищевой промышленности, важным вопросом является ее безопасность по отношению к организму человека, а также статус продуцентов танназы, как микроорганизмов группы GRAS (Generally Recognized as Safe), которые не синтезируют антибиотики [11]. На данный момент известно ограниченное количество сообщений относительно безопасности танназы, однако результаты последних исследований свидетельствуют о безопасности танназы, продуцируемой бактериями рода Lactobacillus. Известно, что каталитические функции ферментов связаны с их белковой структурой. На данный момент информация о структуре танназы ограничена. Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют, что фермент представляет собой небольшие пластинчатые кристаллы и состоит из двух и более субъединиц. Энзим грибного происхождения обычно состоит из четырех субъединиц, в то время как бактериальная танназа состоит из двух субъединиц. Установлена третичная структура танназы, продуцируемой бактериями рода Lactobacillus, а именно Lactobacillus plantarum. Энзим состоит из 18-ти α-спиралей и 13-ти βниток [6,8]. Сейчас уже охарактеризованы белковые последовательности танназы различных 45 родов (всего 77 бактерий), что позволило определить эволюционное родство продуцентов . Было установлено, что у 73 штаммов из 77 изученных белковые последовательности танназы принадлежали к суперсемейству α/β-гидролаз. Известно, что белковая молекула может иметь несколько доменов, но не все они принимают участие в каталитической активности. Каталитические домены отвечают за ферментативную активность белковой молекулы. Молекула танназы Lactobacillus plantarum содержит два домена, один из которых представлен α/βгидролазой и доменом-«крышкой». Установлено, что активный центр танназы расположен в α/β-гидролазной области и представлен тремя аминокислотными остатками Ser 163, Asp 419 и His 451, которые составляют «каталитическую триаду» [6]. Значение и применение танназы Танназа является адаптивным как внутриклеточным, так и внеклеточным индуцибельным ферментом среди ферментов природного происхождения и относится к классу эстераз [8]. Основными направлениями промышленного применения танназы является пищевая, фармацевтическая и химическая промышленность. Также танназа используется в производстве водорастворимых чайных напитков. Танназа значительно повышает антиоксидантные свойства зеленого и черного чаев. В некоторых публикациях также отмечается, что ферментированный зеленый чай имеет лучшие органолептические свойства и более устойчивый цвет [9]. Танназа широко применяется в производстве вина, фруктовых соков и пивоварении .Применение танназы в пищевой промышленности способствует устранению нежелательных свойств таннинов. Ферментативная обработка фруктовых соков используется для устранения горечи и уменьшения мутности. Танназа также используется как реактив в аналитической химии для определения структуры сложных эфиров галловой кислоты природного происхождения, выявления раковых клеток, а также в очистке сточных вод от дубильных веществ [4]. Важным направлением применения танназы является производство галловой кислоты. В свою очередь галловая кислота – основной продукт гидролиза таннинов, – используется в пищевой, косметической промышленности как мощный антиоксидант. Она также служит в качестве прекурсора в производстве противомалярийных препаратов и как светочувствительная смола в производстве полупроводников. Сообщается об антиапоптическом действии галловой кислоты, способности защищать клетки организма человека от окислительных повреждений и выраженном цитотоксическом действии по отношению к раковым клеткам. Также галловая кислота используется как субстрат в ферментативном и химическом синтезе пропилгаллата, применяется как антиоксидант жиров и масел и в производстве напитков. Конечный продукт метаболизма галловой кислоты – пирогаллол, также имеет большое промышленное значение, в частности, используется при окраске кожи и меха, проявлении фотоснимков, в производстве противоопухолевых лекарственных средств. Необходимо отметить, что практическое использование танназы все еще остается достаточно ограниченным в связи с недостаточно изученными ее свойствами, сложностью получения и очистки . В связи с практическим значением и потенциалом использования танназы в различных промышленных секторах производство данного фермента является коммерчески привлекательным и активно развивается в разных странах. Биотехнология позволяет получить танназу из микробных, растительных и животных источников. Для промышленного производства используются микроорганизмы, продуцирующие фермент более стабильный, чем растительный или животный. Бактерии продуценты танназы Продуценты танназы встречаются среди бактерий, дрожжеподобных и нитчатых грибов. Недостатки грибов, как продуцентов для промышленного производства танназы, заключаются в сравнительно медленном биосинтезе и генетической сложности, не позволяющей проводить генетические манипуляции. Впервые сообщение о способности некоторых штаммов бактерий использовать танниновую кислоту в качестве источника углеродного питания появилось в начале 1980-х годов. С тех пор было выделено более 60 штаммов бактерий – продуцентов танназы (таблица 1), однако лишь некоторые из них могут использоваться для коммерческого производства. Таблица 1 - Бактерии продуценты танназы.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Поскольку танназа имеет прикладное значение, особенно в фармацевтической, ветеринарной и пищевой промышленности, поэтому важным вопросом является ее безопасность по отношению к организму человека, а также статус продуцентов танназы, как микроорганизмов группы GRAS (Generally Recognized as Safe), которые не синтезируют антибиотики. На данный момент известно ограниченное количество сообщений относительно безопасности танназы, однако, результаты последних исследований свидетельствуют о безопасности танназы продуцируемой бактериями рода Lactobacillus. Таким образом, перспективным является исследование наличия танназной активности у хорошо изученных пробиотических штаммов, которые могут применяться для разработки пробиотиков в ветеринарной и фармацевтической промышленности, а также в пищевой промышленности - для приготовления продуктов функционального питания обогащенных пробиотическими микроорганизмами с танназной активностью, а значит как следствие с перспективными - антиоксидантными и противоопухолевыми свойствами [4]. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ Расщепление танина новым ферментом танназы, присутствующим в некоторых штаммах Lactobacillus plantarum / Хименес Н., Эстебан-Торрес М., Манченьо Дж. М. и др. – 2014. Т. 80, 2991-2997 с. Биотехнологические достижения и проблемы танназы / Чавес-Гонсалес М., Родригес-Дуран Л.В., Балагурусами Н. и др. - 2012. - Т. 5. - С. 445-459. Идентификация и клонирование гена, кодирующего танназу (танинацилгидролаза) из Lactobacillus plantarum / Ивамото К., Цурута Х., Нишитаини Ю., Осава Р - - 2008. - Т. 31, 269-277 c. Продукция и физико-химические свойства рекомбинантной танназы Lactobacillus plantarum / Куриэль Х.А., Родригес Х., Асеброн И. и др. - 2009. - Т. 57, - 6224-6230 c. Шарма, К.П. Очистка и характеристика гена танназы и танназы из Enterobacter sp./ К.П Шарма, Джон П.Дж. - 2011. - Т. 46, 240-244 c. Кристаллическая структура танназы Lactobacillus plantarum / Рен Б., Ву М., Ван К. и др. - 2013. - Т. 425, 2737-2751 c. Танины: современные знания об источниках пищи, потреблении, биодоступности и биологических эффектах / Серрано Дж., Пуппонен-Пимиа Р., Дауэр А. и др. - 2009. - Т. 53, 310-329 c. Host-gut microbiota metabolic interactions / Nicholson J.K., Holmes E., Kinross J., et al - . – Vol. 336. – 1262-1267 p . Агилар, С.Н., Обзор: источники, свойства, применения и потенциальные применения танин-ацилгидролазы / Гутьеррес-Санчес Г. - 2001. - Т. 7, 373-382 c. Ханбабаи, К. Классификация и определение / Ван Ри, Танинс Т. - 2001. - Т. 18,. 641-649 c. |