МИНИСТЕРСТВО НА-WPS Office. Технологическая схема получения антибиотика грамицидина отбор продуцентов и оптимизация питательной среды
 Скачать 270.12 Kb.
|
|
МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «МОСКОВСКИЙ ПОЛИТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» Кафедра «ХимБиоТех» КУРСОВАЯ РАБОТА Направление подготовки 19.03.01 «Биотехнология» Тема: «Технологическая схема получения антибиотика грамицидина : отбор продуцентов и оптимизация питательной среды» Выполнила: студент гр. 201-542 Сазонова С. П. «____» ____________ 2022 г. ____________ подпись Проверил : Руководитель образовательной программы, д.б.н., Громовых Т.И. «____» ____________ 2022 г. ____________ оценка Москва 2022 г. СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ Из истории ислледования грамицидина Актуальность работы Цель и задачи ГЛАВА 1. ОПИСАНИЕ ТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА Краткий обзор целевого продукта и продуцента Характеристика продуцента, его систематическое положение, морфология и физиология Описание технологии и системы производства, схема синтеза ГЛАВА 2. ОСНОВНЫЕ СТАДИИ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА Предферментационная стадия Стадия ферментации Постферментационная стадия Оптимизация среды ЗАКЛЮЧЕНИЕ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ВВЕДЕНИЕ Из истории ислледования грамицидина В 1942 г. из лондонской Nature Георгий Францевич Гаузе узнал о выдающихся работах Р. Дюбо по получению тиротрицина, буквально ворвался в кабинет Марии Георгиевны и предложил немедленно заняться аналогичным делом. Они сразу же приступили к поиску продуцентов антибиотиков. Рядом с институтом протекал ручеек. Бражникова шла вдоль него, собирая пробы почв на кончик скальпеля и высевая в чашки Петри. Гаузе и Бражникова снимали колонии и проверяли их на антагонизм микробов. Некоторые бактерии образовывали антибактериальное вещество, которое подавляло рост стафилококков. Вскоре из линии бацилл Bacillus brevis был выделен первый антибиотик, названный грамицидин С, где буква С значит «советский». Химическая структура грамицидина вскоре была определена Бражниковой в сотрудничестве со специалистом по биохимии белков и нуклеиновых кислот А.Н. Белозерским. В институте малярии в полузаводских условиях наладили производство препарата, начаты клинические испытания. Грамицидин С по своей структуре – короткий декапетид, состоящий из повторов по пять аминокислот, замкнутых в кольцо «голова-хвост». Грамицидин Дюбо имел линейную структуру из 17 аминокислот. Удивительно, но в обоих случаях два генетически разных варианта антибиотика включали D-аминокислоты. Грамицидин С оказался эффективным в лечении гнойных ран и полостных операций. В 1943–1944 гг. он начал применяться в военно-полевых условиях и спас тысячи раненых. Антибиотик до сих пор в ходу. В 1948 г. лаборатория Гаузе была расширена, а в 1953 г. преобразована в Институт по изысканию новых антибиотиков, ставший головным в стране. Открытие Рене Дюбо (1901–1982) первого антибиотика грамицидина из почвенной бактерии Bacillus brevis послужило не только толчком для изысканий Гаузе, но, по оценке историков, началом «новой эры в развитии медицины». Актуальность работы Изучение биосинтеза микробных продуктов является одной из важнейших проблем микробиологии. Особое внимание вызывают продуценты полипептидных антибиотиков. Пептидные антибиотики используются в качестве лекарственных средств, консервантов, гербицидов, биостимуляторов роста животных и растений, для решения некоторых задач биохимии, молекулярной биологии, биоэнергетики, генетики. В настоящее время известно более 200 пептидных антибиотиков, синтезируемых спорообразующими бактериями, из них около 30 антибиотиков образуют бактерии разных штаммов Bacillus brevis. Одним из самых известных полипептидных антибиотиков является грамицидин S. Мембранотропный антибиотик грамицидин S обладает сильным бактерицидным, фунгицидным, и противопротозойным действием. Водные растворы грамицидина применяют для промываний, орошения повязок, тампонов и т.п. при лечении гнойных ран, пролежней, язв, остеомиелита, ранений суставов, эмпием, осложненных аппендицитов, флегмон, карбункулов, фурункулов и т.п., для промываний и полосканий при воспалительных заболеваниях уха, горла. Для лечения ран, ожогов и т.п. может применяться грамицидиновая паста (см.). В связи с наличием у грамицидина выраженного сперматоцидного действия, пасту применяют также в качестве контрацептивного средства. При пиодермии и других гнойных заболеваниях кожи пользуются спиртовыми растворами грамицидина. Таблетки желтого цвета, сладкие на вкус, содержат по 1,5 мг (1500 ЕД) грамицидина С. Предназначены для местного (защечного) применения (медленно рассасываются в полости рта) при острых фарингитах, афтозных поражениях слизистой оболочки рта и стоматитах, гингивитах, ангинах. Цель и задачи Цель : освоение стадий биотехнологических процессов, построение обобщенный схемы синтеза и оптимизация питательной среды для синтеза антибиотика грамицидина. Задачи : Составить обобщённую схему микробиологического синтеза Обосновать получение полезного продукта Составить описание технологической схемы Построить блок-схему получения продукта ГЛАВА 1. ОПИСАНИЕ ТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА Краткий обзор целевого продукта и продуцента В рамках данной работы был рассмотрен грамицидин С (советсткий препарат). Грамицидин (gramicidin, gramicidinum, Грамицидин C) -антибиотик тиротрициновой группы, вторичный метаболит, представляет собой циклический полипептид из десяти аминокислот, стехиометрическая минимальная единица которого включает по одному остатку L-орнитина, L-пролина, L-валина, L-лейцина и D-фенилаланина, обладает одним свободным основанием, амино-группой и не имеет свободных карбоксильных групп, а также имеет один остаток хлорида. Свойства и состав вещества остаются постоянными при перекристаллизации; небольшие катионные циклические пептиды и действуют как сильнодействующие антибиотики против грамотрицательных и грамположительных бактерий, нарушая целостность бактериальных мембран. С водой антибиотик образует опалесцирующие растворы, сильно пенящиеся при взбалтывании.  Рисунок 1 — Структура грамицидина С  Рисунок 2 — структурная формула грамицидина С Продуцируется споровой палочкой Brevibacillus brevis var. G.-B., которая представляет собой грамположительную , аэробную , подвижную,спорообразующую палочковидную бактерию, обычно встречающуюся в почве, является каталазо - положительной, амилазо - отрицательной, казеин-отрицательной, желатиназо-положительной и индол - отрицательной; большинство штаммов используют цитраты . Некоторые штаммы способны аэробно окислять монооксид углерода . Оптимальный рост происходит при температуре от 35°C до 55°C.  Рисунок 3 — Бактерии Brevibacillus brevis Характеристика продуцента, его систематическое положение, морфология и физиология Brevibacillus brevis - грамположительная, аэробная, подвижная,спорообразующая палочковидная бактерия, по типу питания является хемоорганогетеротрофом. Некоторые штаммы способны аэробно окислять монооксид углерода . Оптимальный рост происходит при температуре от 35°C до 55°C. Царство: Bacteria Тип: Bacillota Класс: Bacilli Порядок: Bacillales Семейство: Paenibacillaceae Род: Brevibacillus Вид: B. brevis Описание технологии и системы производства, схема синтеза Рассмотрим, каким образом в природе несимметричный макромолекулярный белковый комплекс участвует в синтезе этого циклического полипептида. Механизм синтеза, присущий лишь простым организмам, подобным бактериям, расшифрован биохимиком Липманом. Липман обнаружил, что добавление АТР к сырому гомогенату клеток и экстрактам из В. brevis приводит к синтезу грамицидина S. Подобная активность, обнаруженная во фракциях бесклеточного супернатанта, оказалась устойчивой к известным ингибиторам белкового синтеза, а также к обработке рибонуклеазой, что исключало участие в этом процессе молекулы PHK . В этом биохимическом превращении ATP играл роль конденсирующего агента. В синтезе грамицидинa S участвуют два фермента : легкий ( М = 100 000 ) и тяжелый ( М = 280 000 ) . Синтез начинается на легком ферменте, который действует также как «рацемаза» , превращая L - фенилаланин в D - энантиомер. Нуклеофильная тиольная группа легкого фермента атакует активированный фенилаланин аминокислота реагируют с образованием (катализ основанием) высокоэнергетический (ATP и образуя ангидрида), тиоэфир. На следующей стадии пролин, присоединённый к тяжёлому ферменту тиоэфирной связью, атакует лёгкий фермент, перенося таким образом дипептид на тяжёлый фермент. На этом функции лёгкого фермента заканчиваются. Аналогичным образом на тяжелои ферменте аминогруппа валина , присоединенного тиоэфирной связью , атакует дипептид и образует трипептид . В следующем этале участвует "рука" тяжелого фермента . Эта "рука" подхватывает , или , иначе , атакует , тиольную группу трипептида . Затем орнитин атакует образующееся соединение так , что получается тетрапегтид ; "рука" связывает тетрапептид , и он атакуется лейцином с образованием пентапептида . "Рука" вновь удерживает пентапептид , но теперь пентапептид взаимодействует с комплементарным пентапептидом , присоединенным к другой "руке", с образовазием циклического декапептида.  Рисунок 4 — Схема синтеза грамицидина С Биотехнологический процесс производства антибиотика грамицидина С с использованием микроорганизмов требует подбора специального состава питательных сред, которые формируются индивидуально для каждого штамма. ГЛАВА 2. ОСНОВНЫЕ СТАДИИ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА 2.1. Предферментационная стадия Способ включает периодическое культивирование продуцента грамицидина С Bacillus brevis на сбалансированной по составу среде и дополнительную подпитку концентратом питательного раствора в процессе выращивания, ввод которого производят при значениях аминного (восстановленного) азота в культуральной жидкости (КЖ) ниже 1,4 г/л до достижения значения не более 1,75 г/л при кислородном лимитировании в условиях обеспечения развивающихся культур кислородом за счет плавного повышения интенсивности перемешивания по показателям скорости массопередачи кислорода с 0,25·10‐3 до 1·10‐3 моль O2/л·мин и скорости перемешивания с 200 до 500 об/мин при поддержании парциального содержания растворенного кислорода в культуре, близкого к нулю (0-10%), поддержания значения рН на уровне 6,5-6,8 и при остановке процесса выращивания через 2-6 ч после начала стационарной фазы, о чем свидетельствует изменение концентрации биомассы (прирост или убыль) по оптической плотности на величину не более чем на 1 г/л. Выращивание Bacillus brevis в ферментере емкостью 10 л. Характеристика посевного материала: - объем 0,5 л, - типичная морфология, - биомасса 2,5-3,5 г/л, - рН 6,4-6,7. Ниже приведена таблица, отражающая компонентый состав среды с граммовкой вещетв на 1 л среды. Таблица 1 — Состав питательной среды
Рабочий объем ферментера 6 л. Использовали концентрированный питательной раствор, в состав которого входили глицерин, пищевая 40%-ная молочная кислота, хлористый и двузамещенный фосфорнокислый аммоний и сернокислый магний при соотношении концентраций глицерина, молочной кислоты, азота, фосфора и магния 1:0,009:0,038:0,008:0,008. Для поддержания рН на уровне 6,6-6,7 использовали 15% раствор едкого натрия. В случае необходимости и для предотвращения активного пенообразования добавляли пеногаситель лапрол, который не является компонентом питательной среды, до 1 мл/л культуральной жидкости. Среду, концентрат и раствор щелочи стерилизовали при температуре 120°С в течение 30 мин. Подачу концентрата осуществляли при снижении концентрации аминного азота ниже 1,4 г/л. Объем вводимого концентрата определяли, принимая во внимание, что подача 10 мл концентрата на 6 л вызывает повышение аминного азота в КЖ на 4,37·10‐2 г/л. В процессе роста скорость перемешивания плавно увеличивали с 202об/мин до 472 об/мин, поддерживая рO2 на уровне 0-10%. 2.2. Стадия ферментации Выращивание продуцента в 10-литровом ферментере производили в течение 42 часов в условиях ограничения роста по кислороду. В процессе роста скорость перемешивания плавно увеличивали с 202 до 472 об/мин под контролем растворенного кислорода, удерживая рО2 на уровне 1,5-10%. Скорость массопередачи возрастала с 0,25·10‐3 моль O2/л·мин до 0,87·10‐3 моль O2/л·мин. В процессе роста, начиная с 7-го часа, в культуру вводили концентрат среды. Скорость подачи соответствовала потребностям культуры, о чем свидетельствуют низкие значения рO2 0-10% и концентрация аминного азота в культуре не выше 1,4 г/л. Это говорит о том, что удалось избежать ингибирования роста высокими концентрациями и ограничения роста недостатком питания. Концентрацию водородных ионов в КЖ поддерживали введением 15%-ного раствора едкого натрия. По значениям концентрации биомассы, которую определили по оптической плотности, культура вышла в стационарную фазу роста на 39-й час роста. Выращивание было остановлено через 3 часа после прекращения роста. В результате была получена культура, содержавшая 29 г/л биомассы и 5,366 г/л грамицидина С с содержанием примесей 11,6% от содержания грамицидина С. Характеристика ферментации: Периодическая Аэробная Хемотрофная Асептическая Монокультуральная Жидкофазная 2.3. Постферментационная стадия Для выделения и очистки грамицидина С культуральнуио жидкость подкисляют соляной кислотой до pH 4,5 , добавляют поваренную соль и выдерживают при 60°С в теченио 30 мин . Биомaccy отделяют нa сeпapaтope и высушивают , размалывают и трижды экстрагируют этиловым спиртом. Экстракт подкисляют соляной кислотой до рН 3,5 , добавлянт 10-15 % активированного угля , перемешивают 1 час и отделяют уголь . Очищенный экстракт упаривают два раза , предварительно нейтрализуя мелом , добавляют поваренную соль до начала выпадения грамицидина , выдерживают 1 час и разбавляют равным количеством воды. Выпавшие кристаллы грамицидина перекристаллизовывают из спирта . Выход 90 % от содержания грамицидина в культуральной жидкости .  2.4. Оптимизация среды Фактор Х1 – концентрация глицерина. Центр плана – 25 г/л. Шаг варьирования – 5 г/л Фактор Х2 – концентрация хлорида аммония. Центр плана – 4,0 г/л. Шаг варьирования – 0,6 г/л Таблица 2 — оптимизация среды для Brevibacillus brevis
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Мембранотропный антибиотик грамицидин S обладает сильным бактерицидным, фунгицидным, и противопротозойным действием и находит широкое применение в медицине. В данной работе была рассмотрена технологическая схема получения грамицидина S путём культивирования бактерии Brevibacillus brevis жидкофазным методом, проведена оптимизация источника углерода и источника азота, составлена блок-схема производства антибиотика и рассмотрена морфология продуцента грамицидина S. При правильной организации производства с привлечением профессиональных кадров в сфере биотехнологии можно создать безопасное и эффективное получение антибиотика грамицидина S, что позволит сделать этот многофункциональный препарат более доступным, и избавит от необходимости использования зарубежных аналогов. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ Галл Я.М. Георгий Францевич Гаузе (1910–1986). // СПб.: Нестор-История, 2012 - 234 с. Поконова Ю.В. Новый справочник химика и технолога. Сырье и продукты промышленности органических и неорганических веществ. Часть 2 . / Поконова Ю.В., Стархова В.И. // АНО НПО «Мир и Семья», 2002 - 145 с. Юдина, Т. П. Физиолого-биохимические особенности продуцентов грамицидина S Bacillus brevis subsp. G.-B. и их вариантов, 2002 - 173 с. URL : https://www.dissercat.com/content/fiziologo-biokhimicheskie-osobennosti-produtsentov-gramitsidina-s-bacillus-brevis-subsp-g-b- Патент РФ №2008146193/10, 24.11.2008 Дербышев В. В., Клыков С. П., Кураков В. В. . Способ глубинного культивирования Bacillus brevis для получения грамицидина С Патент РФ № 842463/31-16, 1966.10.11 B. H. Шaпошников , И. Л. Работнова , A. Б. Силаев , M. Б. Kуплетская , Т. П. Удалова , M. С. Филиппова , Т. M. Гуськова , M. B. Kорноуxова , P. H. Зеленева и H. Я . Парамонов. Способ получения кристаллического грамицидина C Дюга Г. Биоорганическая xимия . Xимические подxоды к меxанизму действия ферментов / Дюга Г., Пенни K. // Пер . с англ . - M .: Mиp , 1983 - 512 с. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||