Микоа. микроб.лекция- 8-20 -21уч.г. - копия. Тема. Особенности классификации и структуры вирусов. Физиология и методы культивирования вирусов. Открытие и изучение вирусов человечеством
 Скачать 69.68 Kb.
|
|
Тема. Особенности классификации и структуры вирусов. Физиология и методы культивирования вирусов. Открытие и изучение вирусов человечеством. История открытия вирусов может быть прослежена по мере того, как ученые всего мира описывали свои концепции и публиковали экспериментальные результаты. Вирусы в истории человечества первоначально рассматривались как «яды», которые мы сегодня знаем как вирусные заболевания которые свирепствуют и в нынешнее время. История открытия вирусов подтверждает, что буквально до конца 19 века еще не существовало стандартных методов обнаружения патогенных (болезнетворных) организмов, таких как бактерии и простейшие в предполагаемых “ядовитых материалах” .Только эксперименты на животных, проведенные французским микробиологом Луи Пастером (1822-1895) в конце XIX века, в которых не было достигнуто никакого участия «ядовитых» материалов даже после многих экспериментов, позволили предположить, что возбудитель болезни был способен размножаться в организме. Поэтому и пошли разговоры о воспроизводимом “вирусе “(по-латыни” яд “или ”слизь”) в живых организмах, а позднее и в клетках. Открытие вирусов. В Санкт-Петербурге в 1892 году российский микробиолог Дмитрий Ивановский продемонстрировал, что болезнь табачной мозаики вызывается агентом, размер которого значительно меньше размера бактерий: вирус табачной мозаики (бактериальные фильтры имеют размер примерно 0,2 мкм, однако большинство вирусов меньше 0,1 мкм).Вскоре после этого голландский микробиолог Мартинус Виллем Бейеринк (1851-1931) пришел к тому же выводу: он впервые разработал понятие самовоспроизводящегося “жидкого” агента. Открытие вируса животных ящура немецкими бактериологами Фридрихом Леффлером и Паулем Фрошем в 1898 году было первым доказательством существования животного патогенного биологического вируса. Однако ретроспективно можно задокументировать, что еще 3000 лет назад – без знания природы патогенов применялись методы, которые сегодня можно было бы назвать прививками против вирусных заболеваний. Строение и классификация вирусов .Вирусы относятся к царству Vira. Это мельчайшие микроорганизмы («фильтрующиеся агенты»),не имеющие клеточного строения, белоксинтезирующей системы, содержащие один тип нуклеиновой кислоты (только ДНК или РНК).Вирусы, являясь облигатными внутриклеточными паразитами, размножаются в цитоплазме или ядре клетки. Они являются автономными генетическими структурами и отличаются особым, разобщенным (дизъюнктивным),способом размножения (репродукции): в клетке отдельно синтезируются нуклеиновые кислоты вирусов и их белки, затем происходит их сборка в вирусные частицы. Сформированная вирусная частица называется вирионом. Морфологию и структуру вирусов изучают с помощью электронной микроскопии, так как их размеры малы и сравнимы с толщиной оболочки бактерий. Форма вирионов может быть различной : 1.палочковидной (вирус табачной мозаики), 2.пулевидной (вирус бешенства), 3.сферической (вирусы полиомиелита, ВИЧ), 4.нитевидной (филовирусы), 5.в виде сперматозоида (многие бактериофаги). Размеры вирусов определяют: 1. с помощью электронной микроскопии, 2. методом улырафильтрации через фильтры с известным диаметром пор, 3. методом ультрацентрифугирования. Наиболее мелкими вирусами являются парвовирусы (18 нм) и вирус полиомиелита (около 20 нм), наиболее крупным — вирус натуральной оспы (около 350 нм).Различают ДНК- и РНК-содержащие вирусы. Они обычно гаплоидны, то есть имеют один набор генов. Исключением являются ретро-вирусы, имеющие диплоидный геном. Геном вирусов содержит от шести до нескольких сотен генов и представлен различными видами нуклеиновых кислот:1.двунитевыми,2.однонитевыми,3.линейными,4.кольцевыми, 5.фрагментированными. Среди РНК-содержащих вирусов различают вирусы с положительным (плюс-нить РНК) геномом. Плюс-нить РНК этих вирусов выполняет наследственную (геномную) функцию и функцию информационной РНК (и-РНК).Имеются также РНК-содержащие вирусы с отрицательным(минус-нить РНК) геномом. Минус-нить РНК этих вирусов выполняет только наследственную функцию. Геном вирусов способен включаться в геном клетки в виде провируса, проявляя себя генетическим паразитом клетки. Нуклеиновые кислоты некоторых вирусов, например, вирусов герпеса, могут находиться в цитоплазме инфицированных клеток, напоминая плазмиды. Различают: 1. просто устроенные вирусы (например, вирусы полиомиелита, гепатита А) 2. сложно устроенные вирусы (например, вирусы кори, гриппа, герпеса, коронавирусы). У просто устроенных вирусов нуклеиновая кислота связана с белковой оболочкой, называемой капсидом(от лат. capsa—футляр). Капсид состоит из повторяющихся морфологических субъединиц— капсомеров. Нуклеиновая кислота и капсид взаимодействуют друг с другом и вместе называются нуклеокапсидом. У сложноустроенных вирусов капсид окружен липопротеиновой оболочкой— суперкапсидом, или пеплосом. Оболочка вируса является производной структурой от мембран вирус-инфицированной клетки. На оболочке вируса расположены гликопротеиновые «шипы», или «шипики» (пепломеры, или суперкапсидные белки). Под оболочкой некоторых вирусов находится М-белок. Таким образом, просто устроенные вирусы состоят из нуклеиновой кислоты и капсида. Сложно устроенные вирусы состоят из нуклеиновой кислоты, капсида и липопротеиновой оболочки. Вирионы имеют:1.спиральный,2.икосаэдрический (кубический) или сложный тип симметрии капсида (нуклеокапсида).Спиральный тип симметрии обусловлен винтообразной структурой нуклеокапсида (например, у вирусов гриппа, коронавирусов).Икосаэдрический тип симметрии обусловлен образованием изометрически полого тела из капсида, содержащего вирусную нуклеиновую кислоту (например, у вируса герпеса). Капсид и оболочка (суперкапсид) защищают вирионы от воздействия окружающей среды, обусловливают избирательное взаимодействие (адсорбцию) с определенными клетками, а также антигенные и иммуногенные свойства вирионов. Внутренние структуры вирусов называют сердцевиной. У аденовирусов сердцевина состоит из гистоноподобных белков, связанных с ДНК, у реовирусов — из белков внутреннего капсида. В вирусологии используют следующие таксономические категории: 1.семейство (название оканчивается на viridae), 2.подсемейство (название оканчивается на virinae), 3.род (название оканчивается на virus). Однако названия родов и особенно подсемейств даны не для всех вирусов. Вид вируса не получил биноминального названия, как у бактерий. В основу классификации вирусов положены следующие категории: 1. тип нуклеиновой кислоты (ДНК илиРНК), ее структура, количество нитей (одна или две), особенности воспроизводства вирусного генома , 2. размер и морфология вирионов, количество капсомеров и тип симметрии нуклеокапсида, наличие оболочки (суперкапсида). 3. чувствительность к эфиру и дезоксихолату, 4. место размножения в клетке, 5. антигенные свойства . Вирусы поражают позвоночных и беспозвоночных животных, а также бактерии и растения. Являясь основными возбудителями инфекционных заболеваний человека, они также участвуют в процессах канцерогенеза, могут передаваться различными путями, в том числе через плаценту (вирусы краснухи, цитомегалии ), поражая плод человека. Они могут приводить и к постинфекционным осложнениям — развитию миокардитов, панкреатитов, иммунодефицитов . Кроме обычных (канонических) вирусов известны инфекционные молекулы, которые не являются вирусами и называются прионами. Прионы—термин, предложенный С. Прузинером, представляет собой анаграмму английских слов «инфекционная белковая частица.» Клеточная форма нормального прионового протеина (РгРС) имеется в организме млекопитающих, в том числе человека, и выполняет ряд регуляторных функций. Его кодирует PrP-ген, расположенный в коротком плече 20-й хромосомы человека. При прионных болезнях в виде трансмиссивных губкообразных энцефалопатии (болезнь Крейтцфельда—Якоба, куру.) прионный протеин приобретает другую, инфекционную форму, обозначаемую как РгР& (Sc — от scrapie — скрепи, прионной инфекции овец и коз). Этот инфекционный прионовый протеин имеет вид фибрилл и отличается от нормального прионного протеина третичной или четвертичной структурой. Другими необычными агентами, близкими к вирусам, являются вироиды— небольшие молекулы кольцевой, суперспирализованной РНК, не содержащие Физиология вирусов. Вирусы— облигатные внутриклеточные паразиты, способные только к внутриклеточному размножению. В вирус- инфицированной клетке возможно пребывание вирусов в различных состояниях: *воспроизводство многочисленных новых вирионов; *пребывание нуклеиновой кислоты вируса в интегрированном состоянии с хромосомой клетки (в виде провируса); * существование в цитоплазме клетки в виде кольцевых нуклеиновых кислот, напоминающих плазмиды бактерий. Поэтому диапазон нарушений, вызываемых вирусом, весьма широк: от выраженной продуктивной инфекции, завершающейся гибелью клетки, до продолжительного взаимодействия вируса с клеткой в виде латентной инфекции или злокачественной трансформации клетки. Различают три типа взаимодействия вируса с клеткой: продуктивный, абортивный и интегративный. 1.Продуктивный тип — завершается образованием нового поколения вирионов и гибелью (лизисом) зараженных клеток (цитолитическая форма). Некоторые вирусы выходят из клеток, не разрушая их (нецитолитическая форма). 2.Абортивный тип — не завершается образованием новых вирионов, поскольку инфекционный процесс в клетке прерывается на одном из этапов. 3.Интегративный тип, или вирогения —характеризуется встраиванием (интеграцией) вирусной ДНК в виде провируса в хромосому клетки и их совместным сосуществованием (совместная репликация). Репродукция вирусов (продуктивный). Продуктивный тип взаимодействия вируса с клеткой, то есть репродукция вируса (лат. re — повторение, productio — производство), проходит в 6 стадий:1) адсорбция вирионов на клетке;2) проникновение вируса в клетку; 3) «раздевание» и высвобождение вирусного генома (депротеинизация вируса);4) синтез вирусных компонентов;5) формирование вирионов; 6) выход вирионов из клетки. У различных вирусов эти стадии отличаются. Адсорбция вирусов. Первая стадия репродукции вирусов — адсорбция, то есть прикрепление вириона к поверхности клетки. Она протекает в две фазы. Первая фаза — неспецифическая, обусловленная ионным притяжением между вирусом и клеткой, включая и другие механизмы. Вторая фаза адсорбции — высоко специфическая, обусловленная гомологией, комплементарностью рецепторов чувствительных клеток и «узнающих» их белковых лигандов вирусов. Белки на поверхности вирусов, узнающие специфические клеточные рецепторы и взаимодействующие с ними, называются прикрепительными белками (в основном это гликопротеины) в составе липопротеиновой оболочки. Специфические рецепторы клеток имеют различную природу, являясь белками, липидами, углеводными компонентами белков, липидов. Так, рецепторами для вируса гриппа является сиаловая кислота в составе гли-копротеинов и гликолипидов (ганглиозидов) клеток дыхательных путей. Вирусы бешенства адсорбируются на ацетилхолиновых рецепторах нервной ткани, а вирусы иммунодефицита человека — на СО4-рецепторах Т-хелперов, моноцитов и дендритных клеток. На одной клетке находится от десяти до ста тысяч специфических рецепторов, поэтому на ней могут адсорбироваться десятки и сотни вирионов. Наличие специфических рецепторов лежит в основе избирательности поражения вирусами определенных клеток, тканей и органов. Это так называемый тропизм(греч. tropos — поворот, направление). Например, вирусы, репродуцирующиеся преимущественно в клетках печени, называются гепатотропными, в нервных клетках — нейротропными, в иммунокомпетентных клетках — иммунотропными .Проникновение вирусов в клетку. Вирусы проникают в клетку путем рецептор зависимого эндоцитоза (виропексиса), или слияния оболочки вируса с клеточной мембраной, или же в результате сочетания этих механизмов. 1. Рецептор зависимый эндоцитоз происходит в результате захватывания и поглощения вириона клеткой: клеточная мембрана с прикрепленным вирионом впячивается с образованием внутриклеточной вакуоли (эндосомы), содержащей вирус. За счет АТФ-зависимого «протонного» насоса содержимое эндосомы закисляется, что приводит к слиянию липопротеиновой оболочки сложно организованного вируса с мембраной эндосомы и выходу вирусного нуклеокапсида в цитозоль клетки. Эндосомы объединяются с лизосомами, которые разрушают оставшиеся вирусные компоненты. Процесс выхода безоболочечных (просто организованных) вирусов из эндосомы в цитозоль остается малоизученным. 2. Слияние оболочки вириона с клеточной мембраной характерно только для некоторых оболочечных вирусов (парамиксовирусов, ретровирусов, герпесвирусов), в составе которых имеются белки слияния. Происходит точечное взаимодействие вирусного белка слияния с липидами клеточной мембраны, в результате чего вирусная липопротеиновая оболочка интегрирует с клеточной мембраной, а внутренний компонент вируса попадает в цитозоль. А) «Раздевание» (депротеинизация) вирусов. В результате высвобождается его внутренний компонент, способный вызывать инфекционный процесс. Первые этапы «раздевания» вируса начинаются в процессе его проникновения в клетку путем слияния вирусных и клеточных мембран или же при выходе вируса из эндосомы в цитозоль. Последующие этапы «раздевания» вируса тесно взаимосвязаны с их внутриклеточным транспортом к местам депротеинизации. Для разных вирусов существуют свои специализированные участки «раздевания» в клетке: для пикорнавирусов— в цитоплазме с участием лизосом, аппарата Гольджи; для герпесвирусов — околоядерное пространство или поры ядерной мембраны; для аденовирусов — сначала структуры цитоплазмы, а затем ядро клетки. Конечными продуктами «раздевания» могут быть нуклеиновая кислота, нуклеопротеин (нуклеокапсид) или сердцевина вириона. Так, конечным продуктом раздевания пикарновирусов является нуклеиновая кислота, ковалентно связанная с одним из внутренних белков. А у многих оболочечных РНК-содержащих вирусов конечными продуктами «раздевания» могут быть нуклеокапсиды или сердцевины, которые не только не препятствуют экспрессии вирусного генома, а, более того, защищают его от клеточных протеаз и регулируют последующие биосинтетические процессы. В) Синтез вирусных компонентов. Синтез белков и нуклеиновых кислот вируса, который разобщен во времени и пространстве. Синтез осуществляется в разных частях клетки, поэтому такой способ размножения вирусов называется дизъюнктивным (от лат. disjunctus — разобщенный). С)Синтез вирусных белков. В зараженной клетке вирусный геном кодирует синтез двух групп белков: 1. неструктурных белков, обслуживающих внутриклеточную репродукцию вируса на разных его этапах; 2. структурных белков, которые входят в состав вириона (геномные, связанные с геномом вируса, капсидные и суперкапсидные белки). К неструктурным белкам относятся: 1) ферменты синтеза РНК или ДНК (РНК- или ДНК-полимеразы), обеспечивающие транскрипцию и репликацию вирусного генома; 2) белки-регуляторы; 3) предшественники вирусных белков, отличающиеся своей нестабильностью в результате быстрого нарезания на структурные белки; 4) ферменты, модифицирующие вирусные белки, например, протеиназы и протеинкиназы. Синтез белков в клетке осуществляется в соответствии с хорошо известными процессами транскрипции(от лат. transcriptio — переписывание) путем «переписывания» генетической информации с нуклеиновой кислоты в нуклеотидную последовательность информационной РНК (и-РНК) и трансляции (от лат. translatio — передача) — считывания и-РНК на рибосомах с образованием белков. Передача наследственной информации в отношении синтеза и-РНК у разных групп вирусов неодинакова. I. ДНК-содержашие вирусы реализуют генетическую информацию так же, как и клеточный геном, по схеме :геномная ДНК вируса -» транскрипция и-РНК -» трансляция белка вируса. Причем ДНК-содержашие вирусы используют для этого процесса клеточную полимеразу (вирусы, геномы которых транскрибируются в ядре клетки — аденовирусы, паповавирусы, герпесвирусы) или собственную РНК-полимеразу (вирусы, геномы которых транскрибируются в цитоплазме, например поксвирусы). II. Плюс-нитевые РНК-содержашие вирусы(например, пикорнавирусы, флавивирусы, тогавирусы) имеют геном, выполняющий функцию и-РНК; он распознается и транслируется рибосомами. Синтез белков у этих вирусов осуществляется без акта транскрипции по схеме: геномная РНК вируса-> трансляция белка вируса. III. Геном минус-однонитевых РНК-содержаших вирусов (ортомиксовирусов, парамиксовирусов, рабдовирусов) и двунитевых (реовирусов) служит матрицей, с которой транскрибируется и-РНК, при участии РНК-полимеразы, связанной с нуклеиновой кислотой вируса. Синтез белка у них происходит по схеме: геномная РНК вируса-» транскрипция и-РНК- трансляция белка вируса. IV.Ретровирусы (вирусы иммунодефицита человека, онкогенные ретровирусы) имеют уникальный путь передачи генетической информации. Геном ретровирусов состоит из двух идентичных молекул РНК, то есть является диплоидным. В составе ретровирусов то есть особый вирусоспецифический фермент — обратная транскриптаза, или ревертаза, с помощью которой осуществляется процесс обратной транскрипции, то есть на матрице геномной РНК синтезируется комплементарная однонитевая ДНК (к-ДНК). Комплементарная нить ДНК копируется с образованием двунитевой комплементарной ДНК, которая интегрирует в клеточный геном и в его составе транскрибируется в и-РНК с помощью клеточной ДНК-зависимой РНК-полимеразы. Синтез белков для этих вирусов осуществляется по схеме: геномная РНК вируса-> комплементарная ДНК-» транскрипция -РНК-»трансляция белка вируса. Репликация вирусных геномов, то есть синтез вирусных нуклеиновых кислот, приводит к накоплению в клетке копий исходных вирусных геномов, которые используются при сборке вирионов. Способ репликации генома зависит от типа нуклеиновой кислоты вируса, наличия вирусоспецифических или клеточных полимераз, а также от способности вирусов индуцировать образование полимераз в клетке. Механизм репликации отличается у вирусов, имеющих:1) двунитевую ДНК;2) однонитевую ДНК;3) плюс-однонитевую РНК;4) минус-одноните-вую РНК;5) двунитевую РНК;6) идентичные плюс-нитевые РНК (ретровирусы). 1.Двунитевые РНК-вирусы. Репликация двунитевых вирусных ДНК происходит обычным полуконсервативным механизмом: после рас- плетения нитей ДНК к ним комплементарно достраиваются новые нити. Каждая вновь синтезированная молекула ДНК состоит из одной родительской и одной вновь синтезированной нити. К этим вирусам относится большая группа вирусов, которые содержат двунитевую ДНК в линейной (например, герпесвирусы, аденовирусы и поксвирусы) или в кольцевой форме, как папилломавирусы. У всех вирусов, кроме поксвирусов, транскрипция вирусного генома происходит в ядре.Уникальный механизм репликации характерен для гепаднавирусов (вируса гепатита В). Геном гепаднавирусов представлен двунитевой кольцевой ДНК, одна нить которой короче (неполная плюс-нить) другой нити. Первоначально достраивается . Затем полная двунитевая ДНК с помощью клеточной ДНК-зависимой РНК-полимеразы транскрибируется с образованием небольших молекул и-РНК и полной однонитевой плюс-РНК. Последняя называется прегеномной РНК; она является матрицей для репликации генома вируса. Синтезированные и-РНК участвуют в процессе трансляции белков, в том числе вирусной РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы). С помощью этого фермента мигрирующая в цитоплазму прегеномная РНК обратно транскрибируется в минус-нить ДНК, которая, в свою очередь, служит матрицей для синтеза плюс-нити ДНК. Этот процесс заканчивается образованием двунитевой ДНК, содержащей неполную плюс-нить ДНК. 2.Однонитевые ДНК-вирусы. Единствеными представителями однонитевых ДНК-вирусов являются парвовирусы. Парвовирусы используют клеточные ДНК-полимеразы для создания двунитевого вирусного генома, так называемой репликативной формы последнего. При этом на исходной вирусной ДНК (плюс-нить) комплементарно синтезируется минус-нить ДНК, служащая матрицей для синтеза плюс-нити ДНК нового вириона. Параллельно синтезируется и-РНК, происходит трансляция вирусных пептидов. 3.Плюс-однонитевые РНК-вирусы. Эти вирусы включают большую группу вирусов — пикорнавирусы, флавивирусы, тогавирусы, у которых геномная плюс-нить РНК выполняет функцию и-РНК. Например, РНК полиовирусов после проникновения в клетку связывается с рибосомами, работая как и-РНК, и на ее основе синтезируется большой полипептид, который расщепляется на фрагменты: РНК-зависимую РНК-полимеразу, вирусные протеазы и капсидные белки. Полимераза на основе геномной плюс-нити РНК синтезирует минус-нить РНК; формируется временно двойная РНК, названная промежуточным репликативным звеном. Это промежуточное репликативное звено состоит из полной плюс-нити РНК и многочисленных частично завершенных минус-нитей. Когда образованы все минус-нити, они используются как шаблоны для синтеза новых плюс-нитей РНК. Этот механизм используется как для размножения геномной РНК вируса, так и для синтеза большого количества вирусных белков. 4.Минус-однонитевые РНК-вирусы. Минус -однонитевые РНК-вирусы (рабдовирусы, парамиксовирусы, ортомиксовирусы) имеют в своем составе РНК-зависимую РНК-полимеразу. Проникшая в клетку геномная минус- нить РНК трансформируется вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразой в неполные и полные плюс-нити РНК. Неполные копии выполняют роль иРНК для синтеза вирусных белков. Полные копии являются матрицей (промежуточная стадия) для синтеза минус-нитей геномной РНК потомства 5.Двунитевые РНК-вирусы. Механизм репликации этих вирусов (реовирусов и ротавирусов) сходен с репликацией минус-однонитевых РНК-вирусов. Отличие состоит в том, что образовавшиеся в процессе транскрипции плюс-нити функционируют не только как и-РНК, но и участвуют в репликации: они являются матрицами для синтеза минус-нитей РНК. Последние в комплексе с плюс-нитями РНК образуют геномные двунитевые РНК вирионов. Репликация вирусных нуклеиновых кислот этих вирусов происходит в цитоплазме клеток. 6. Ретровирусы (плюс-нитевые диплоидные РНК-содержащие вирусы). Обратная транс-криптаза ретровирусов синтезирует (на матрице РНК-вируса) минус-нить ДНК, с которой копируется плюс-нить ДНК с образованием двойной нити ДНК, замкнутой в кольцо. Далее двойная нить ДНК интегрирует с хромосомой клетки, образуя провирус. Многочисленные вирионные РНК образуются в результате транскрипции одной из нитей интегрированной ДНК при участии клеточной ДНК-зависимой РНК-полимеразы. Формирование вирусов .Вирионы формируются путем самосборки: составные части вириона транспортируются в места сборки вируса — участки ядра или цитоплазмы клетки. Соединение компонентов вириона обусловлено наличием гидрофобных, ионных, водородных связей и стерического соответствия. Существуют следующие общие принципы сборки вирусов: 1.Формирование вирусов— многоступенчатый процесс с образованием промежуточных форм, отличающихся от зрелых вирионов по составу полипептидов. 2.Сборка просто устроенных вирусов заключается во взаимодействии вирусных нуклеиновых кислот с капсидными белками и в образовании нуклеокапсидов. 3.У сложноустроенных вирусов сначала формируются нуклеокапсиды, которые взаимодействуют с модифицированными мембранами клеток (будущей липопротеиновой оболочкой вируса). 4.Причем сборка вирусов, реплицирующихся в ядре клетки, происходит с участием мембраны ядра, а сборка вирусов, репликация которых идет в цитоплазме, осуществляется с участием мембран эндоплазматической сети или плазматической мембраны, куда встраиваются гликопротеины и другие белки оболочки вируса. 5.У ряда сложноустроенных вирусов минус-нитевых РНК-вирусов (ортомиксовирусов, парамиксовирусов) в сборку вовлекается так называемый матриксный белок (М-белок), который расположен под модифицированной клеточной мембраной. Обладая гидрофобными свойствами, он выполняет роль посредника между нуклеокапсидом и вирусной липопротеиновой оболочкой. 6.Сложноустроенные вирусы в процессе формирования включают в свой состав некоторые компоненты клетки хозяина, например липиды и углеводы. Выход вирусов из клетки. Полный цикл репродукции вирусов завершается через 5—6 ч (вирус гриппа ) или через несколько суток (гепатовирусы, вирус кори ). Процесс репродукции вирусов заканчивается выходом их из клетки, который происходит взрывным путем или почкованием, экзоцитозом. Взрывной путь: из погибающей клетки одновременно выходит большое количество вирионов. По взрывному пути выходят из клетки просто устроенные вирусы, не имеющие липопротеиновой оболочки. Почкование, экзоцшпт присущи вирусам, имеющим липопротеиновую оболочку, которая является производной от клеточных мембран. Сначала образовавшийся нуклеокапсид или сердцевина вириона транспортируется к клеточным мембранам, в которые уже встроены вирусоспецифические белки. Затем в области контакта нуклеокапсида или сердцевины вириона с клеточной мембраной начинается выпячивание этих участков. Сформировавшаяся почка отделяется от клетки в виде сложно устроенного вируса. При этом клетка способна длительно сохранять жизнеспособность и продуцировать вирусное потомство. Почкование вирусов, формирующихся в цитоплазме, может происходить либо через плазматическую мембрану (например, парамиксовирусы, тогавирусы), либо через мембраны эндоплазматической сети с последующим их выходом на поверхность клетки (например, буньявирусы).Вирусы, формирующиеся в ядре клетки (например, герпесвирусы), почкуются в перинуклеарное пространство через модифицированную ядерную мембрану, приобретая таким образом липопротеиновую оболочку. Затем они транспортируются в составе цитоплазматических везикул на поверхность клетки. Абортивный тип взаимодействия вирусов с клеткой. Этот тип взаимодействия не завершается образованием вирусного потомства и может возникать при следующих обстоятельствах: 1)заражение чувствительных клеток дефектными вирусами или дефектными вирионами; 2)заражение стандартным вирусом генетически резистентных к нему клеток; 3)заражение стандартным вирусом чувствительных клеток в непермиссивных (неразрешающих) условиях. Различают дефектные вирусы и дефектные вирионы. 1.Дефектные вирусы существуют как самостоятельные виды, которые репродуцируются лишь при наличии вируса-помощника (например, вирус гепатита D репродуцируется только в присутствии вируса гепатита В). 2.Дефектные вирионы обычно лишены части генетического материала и могут накапливаться в популяции многих вирусов при множественном заражении клеток. Абортивный тип взаимодействия чаще наблюдается при заражении нечувствительных клеток стандартным вирусом. Механизм генетически обусловленной резистентности клеток к вирусам широко варьирует. Он может быть связан: с отсутствием на плазматической мембране специфических рецепторов для вирусов; с неспособностью данного вида клеток инициировать трансляцию вирусной и-РНК; с отсутствием специфических протеаз или нуклеаз, необходимых для синтеза вирусных макромолекул. Абортивный тип взаимодействия может также возникать при изменении условий, в которых происходит репродукция вирусов: повышение температуры организма, изменение рН в очаге воспаления, введение в организм противовирусных препаратов. При устранении неразрешающих условий абортивный тип переходит в продуктивный тип взаимодействия вирусов с клеткой. Интегративный тип взаимодействия вирусов с клеткой (вирогения) Это взаимное сосуществование вируса и клетки в результате интеграции (встраивания) нуклеиновой кислоты вируса в хромосому клетки хозяина. При этом интегрированный геном вируса реплицируется и функционирует как составная часть генома клетки. Интегративный тип взаимодействия характерен: 1.для умеренных ДНК-содержащих бактериофагов, 2.онкогенных вирусов 3.и некоторых инфекционных вирусов как ДНК-содержащих (например, вируса гепатита В), так и РНК-содержащих (например, вируса иммунодефицита человека). 4.Для интеграции с геномом клетки необходимо наличие кольцевой формы двунитевой ДНК-вируса. Геном ДНК-содержащих вирусов в кольцевой форме прикрепляется к клеточной ДНК в месте гомологии нуклеотидных последовательностей и встраивается в определенный участок хромосомы при участии ряда ферментов (рестриктаз, эндонуклеаз, лигаз). 5.У РНК-содержащих вирусов процесс интеграции более сложный. Он начинается с механизма обратной транскрипции, который заключается в синтезе комплементарной нити ДНК на матрице вирусной РНК с помощью вирусоспецифического фермента обратной транскриптазы (ревертазы). После образования двунитевой ДНК и замыкания ее в кольцо происходит интеграция ДНК-транскрипта в хромосому клетки. Встроенная в хромосому клетки ДНК вируса называется провирусом, или провирусной ДНК. Провирус реплицируется в составе хромосомы и переходит в геном дочерних клеток, то есть состояние вирогении наследуется. Однако под влиянием некоторых физических или химических факторов провирус может исключаться из хромосомы клетки и переходить в автономное состояние с развитием продуктивного типа взаимодействия с клеткой. Дополнительная генетическая информация провируса при вирогении сообщает клетке новые свойства, что может быть причиной онкогенной трансформации клеток и развития опухолей, а также развития аутоиммунных и хронических заболеваний. Сохранение вирусной информации в виде провируса в составе клеточного генома и передача ее потомству лежит в основе персистенции (лат. persistence — упорство, постоянство) вирусов в организме и развития латентных (скрытых) вирусных инфекций. Культивирование вирусов. Культивирование вирусов человека и животных проводят с целью лабораторной диагностики вирусных инфекций, для изучения патогенеза и иммунитета при вирусных инфекциях, а также для получения диагностических и вакцинных препаратов. Вирусы культивируют на трех биологических моделях: 1.в организме лабораторных животных, 2.в развивающихся эмбрионах птиц (чаще на куриных эмбрионах) 3.в культурах клеток (тканей). Выращенные вирусы определяют с помощью методов: 1.индикации 2.идентификации. Индикациявирусов, то есть обнаружение факта их репродукции, основана на выявлении различных биологических свойств вирусов и особенностей их взаимодействия с чувствительными клетками. Идентификация(определение вида, типа) вирусов осуществляется, в основном, с помощью иммунологических реакций, основанных на взаимодействии антигенов вирусов и соответствующих им антител . 1. Лабораторных животных (взрослых или новорожденных белых мышей, хомяков, кроликов, обезьян ) заражают исследуемым вируссодержащим материалом различными способами (подкожно, внутримышечно, интраназально, интрацеребрально) в зависимости от тропизма вирусов. Использование животных для культивирования вирусов в диагностических целях весьма ограничено из-за видовой невосприимчивости животных ко многим вирусам человека, контаминации животных посторонними микробами, а также по экономическим и этическим соображениям. О репродукции вирусов в организме животных судят по развитию у них видимых клинических проявлений заболевания, патоморфологическим изменениям органов и тканей, а также на основании реакции гемаг-глютинации (РГА)с суспензией из органов, содержащих вирусы. РГА основана на способности многих вирусов вызывать склеивание (агглютинацию) эритроцитов человека, птиц и млекопитающих в результате взаимодействия вирусных белков (гемагглютининов) с рецепторами эритроцитов. 2.Куриные эмбрионы (5-12-дневные) заражают путем введения исследуемого материала в различные полости и ткани зародыша. Таким образом можно культивировать вирусы гриппа, герпеса, натуральной оспы. Достоинствами модели являются: a)возможность накопления вирусов в больших количествах; b)отсутствие скрытых вирусных инфекций; c)доступность для любой лаборатории. О репродукции вирусов в куриных эмбрионах свидетельствуют: 1.специфические поражения оболочек и тела эмбриона (оспины, кровоизлияния); 2.гибель эмбриона; 3.положительная РГА с вируссодержащей жидкостью, полученной из полостей зараженного зародыша. Методику культивирования вирусов в развивающихся эмбрионах птиц используют при промышленном выращивании вирусов. Однако многие вирусы не размножаются в эмбрионах птиц; почти неограниченные возможности для культивирования вирусов появились после открытия метода культур клеток. 3. Культуру клеток (тканей) наиболее часто применяют для культивирования вирусов. Метод культур клеток разработан в 50-х годах XX века Дж. Эндерсом и соавторы, получившими за это открытие Нобелевскую премию. Клетки, полученные из различных органов и тканей человека, животных, птиц и других биологических объектов, размножают вне организма на искусственных питательных средах в специальной лабораторной посуде. Большое распространение получили культуры клеток из эмбриональных и опухолевых (злокачественно перерожденных) тканей, обладающих, по сравнению с нормальными клетками взрослого организма, более активной способностью к росту и размножению. При выращивании культур клеток необходимо выполнение ряда условий:1) соблюдение правил асептики; 2) использование лабораторной посуды из нейтрального стекла (пробирки, флаконы, матрасы) или специальных реакторов для получения биотехнологической продукции;3) использование сложных по составу питательных сред (среда 199, Игла), содержащих минеральные соли, аминокислоты, витамины, глюкозу, сыворотку крови животных или человека, буферные растворы для поддержания стабильного рН;4) добавление антибиотиков к питательной среде для подавления роста посторонних микробов:5) соблюдение оптимальной температуры (36— 38,5 °С) роста клеток. Мутации вирусов. Мутация, мутационная изменчивость – наследуемые изменения гена или генов, контролирующих определенные наследственные признаки. Рекомбинация – это обмен генетическим материалом между двумя близкими, но отличающимися по наследственным свойствам вирусам. Большие мутации вируса, принципиально видоизменяющие его антигены, называются «шифт» (shift (англ.) - смена). Считается, что такие мутации происходят в организме животных, когда в них одновременно проникают вирусы, поражающие человека и вирусы, поражающие животных. В результате такого смешивания вирусов порождается принципиально новый тип вируса, опасный как для человека, так и для животных).Антигенный шифт всегда приводит к пандемии, то есть глобальной и сильной эпидемии, поскольку все население планеты становится восприимчивым к новому варианту вируса. Малые, незначительные мутации называют «дрейфом». Они приводят к появлению вирусов, лишь немного отличающихся от изначального варианта. С точки зрения иммунитета новый вариант является почти полной копией материнского штамма, поэтому прошлогодние антитела могут быть отчасти эффективными против обновленных вирусов. Антигенные дрейфы приводят к обычным ежегодным эпидемиям гриппа .Подобного рода исследования природы антигенной изменчивости проводились с вирусами гриппа. Антигенную изменчивость этих вирусов принято делить на два типа: антигенный дрейф и антигенный шифт. Спонтанные мутации вирусов. Индуцированные мутации вирусов. Проявление мутаций вирусов в фенотипе. Нуклеиновые кислоты вирусов подвержены мутациям, то есть внезапным наследуемым изменениям. Сущность этих процессов заключается в нарушениях генетического кода в виде изменений нуклеотидных последовательностей, их выпадений (делеций), вставок либо перестановок нуклеотидов или пар в одно- и двухнитевых молекулах нуклеиновых кислот. Указанные нарушения могут ограничиваться отдельными нуклеотидами или же распространяться на более значительные участки. У вирусов выделяют спонтанные и индуцированные мутации. Их биологическое значение может быть связано с приобретением или потерей патогенных свойств, а также с приобретением свойств, лишающих их чувствительности к действию защитных механизмов организма-хозяина. Мутации, полностью нарушающие синтез или функцию жизненно важных белков, приводят к утрате способности к репродукции и иначе известны как летальные мутации. В их основе лежат изменения, приводящие к возникновению бессмысленных кодонов (с нарушением синтеза белковой цепочки) либо к появлению вставок или делеций (с глубокими нарушениями генетического кода). Мутации с потерей способности синтезировать определённый белок или с нарушением его функций, что в определённых условиях может привести к утрате способности к репродукции называют условно-летальными. Спонтанные мутации вирусов .Спонтанные мутации возникают под действием различных естественных мутагенов и встречаются с частотой l:10-8 вирусных частиц. Чаще их можно наблюдать у ретровирусов, что связано с более высокой частотой сбоев в обратной транскрипции. Индуцированные мутации вирусов Индуцированные мутации вызывают различные химические агенты и УФ-облучение (у ДНК содержащих вирусов). Принципиальной разницы в перестройке генома, вызванной спонтанны ми или индуцированными мутациями, нет. Принято считать, что применяемые мутагены лишь увеличивают частоту спонтанных мутаций. При классификации вирусных мутаций используют два разных подхода: их разделяют по характеру изменений генотипа или по изменениям фенотипа, наступающим в результате мутаций. Изучение изменений генотипа вирусов проводят редко, так как для этого необходимо детальное изучение их геномов. Чаще проводят изучен» фенотипических проявлений мутаций как более доступных для исследований. По фенотипическим проявлениям мутации вируса можно разделить на четыре группы. Мутации, не имеющие фенотического проявления, не изменяют свойств вирусов и их выявляют лишь при специальном анализе. Мутации, имеющие фенотипическое проявление (например, изменение размеров бляшек, образуемых вирусами в культуре клеток или термостабильность вирусов). Мутации, повышающие или снижающие патогенность, можно разделить на точковые (локализующиеся в индивидуальных генах).Генные (затрагивающие более обширные участки генома). Историческая справка. Методы активной иммунизации. В Древнем Китае, Индии и Египте часто случались разрушительные эпидемии оспы. Фараон Рамзес V – как показывает его посмертная маска – скорее всего, умер от заражения вирусом оспы. Как было замечено в то время, люди, пережившие болезнь, были избавлены от нее в дальнейших эпидемиях; следовательно, у них должна была быть выработана какая – то защита, вызванная первой болезнью – они были иммунны. Этот защитный статус также мог быть вызван искусственно. Когда высушенные струпья оспы передавались здоровым людям, они были, по крайней мере, частично защищены от оспы – мера, которую мы теперь называем вариоляцией (медицинский термин для оспы – “вариола”). Это так называемый метод активной иммунизации. Исторические описания показывают, что в то время оспа использовалась в качестве биологического оружия. В XVIII веке в Англии и Германии было открыто, что преодоление молочницы дает защиту от настоящей оспы. Английский врач Эдвард Дженнер (1749-1823), должно быть, знал об этих наблюдениях в 1796 году, когда он передал свиноподобный и коровий материал в качестве своего рода вакцины сначала своему первенцу сыну, а затем молодому пастуху. Оба мальчика остались здоровыми после воздействия патогенного вируса оспы человека путем прививки оспенного гноя. На самом деле этот первый преднамеренный “вирусологический эксперимент ”вызвал защитный эффект. Знания об этой вакцинации очень быстро распространились из Англии на европейский континент и в США. Именно Эдварду Дженнеру принадлежит разработка первой в мире вакцины против натуральной оспы путем прививки неопасного для человека вируса коровьей оспы. Термин “вакцинация” происходит от латинского vacca, что означает “корова”. Прививки вскоре были предписаны законом, и это привело к постепенному сокращению вирусоносителей. В бывшем германском рейхе первый закон о вакцинации был принят в 1871 году. Однако прошло еще около 100 лет, прежде чем человек Али Маов Маалин был естественным образом заражен оспой (в Сомали) в последний раз (в 1977 году), после того как ВОЗ провела всемирную программу вакцинации. Сегодня болезнь считается искорененной. История открытия вакцины против бешенства. На аналогичной основе, то есть без точного знания природы возбудителя, Луи Пастер разработал вакцину против бешенства в Париже в 1885 году. Он передал болезнь внутримозговым путем кроликам в 1882 году видя возбудителя скорее в неизвестных и невидимых микробах. Как он продемонстрировал, патоген потерял свои болезнетворные свойства в результате непрерывной передачи инфекции этим животным. Таким образом, именно Луи Пастер создал основу для вакцинного вируса, который, в отличие от возбудителя дикого типа, характеризовался постоянным инкубационным периодом. Натертый и высушенный спинной мозг привитых кроликов больше не был инфекционным, но вызывал (первоначально у собак) защиту против бешенства. Впервые, в 1885 году, Пастер привил этот материал 9-летнему мальчику. Мальчик был укушен бешеной собакой 2 дня назад и в конце концов выжил благодаря защитному эффекту, вызванному вакциной. История технических достижений в области вирусологии. Из-за своих небольших размеров вирусы долгое время оставались для людей неизведанными. Разрешение светового микроскопа, который был построен немецким физиком-оптиком Эрнстом Аббе около 1900 года, было недостаточно высоким для визуализации этих патогенов. Это стало возможным только с помощью электронного микроскопа, который был разработан немцем Эрнстом Руской в 1940 году. С его помощью впервые была решена структура вируса табачной мозаики. Даже получение доказательств существования таких мельчайших агентов, которые не культивируются на искусственных средах, было невозможно до появления бактериоустойчивых ультрафильтров. Американский бактериолог Уолтер Рид описал вирус желтой лихорадки как первый патогенный вирус человека в 1900 году, а затем миксомы кролика и бешенства в 1903 году. Вирус птичьего лейкоза был открыт в 1908 году, Полиовирус в 1909 году, а вирус саркомы Руса в 1911 году, который назван в честь открывшего его ученого и представляет собой первый вирус, связанный с индукцией раковых заболеваний (в данном случае в соединительной ткани домашней птицы).Даже бактерии могут быть заражены ультрафильтруемыми и трансмиссивными агентами, как это было открыто французским микробиологом Феликсом д’Эрелем в 1916 и 1917 годах. Он особенно обратил внимание на поразительную способность этих агентов лизировать бактерии и поэтому назвал их бактериофагами – по греческому слову phagein, что означает “есть”. Изучение природы бактериофагов дало вирусологии важные открытия и импульсы как в методологическом, так и в концептуальном плане. Многие из стадий, характеризующих вирусную инфекцию, были впервые обнаружены в экспериментах с бактериальными вирусами: такие процессы включают прикрепление и проникновение, репродуктивно-циклическую зависимую регуляцию экспрессии генов, которая приводит к раннему и позднему синтезу белков, и лизогенез, который связан с существованием профагов. Итак, вирусы являются а)возбудителями инфекционных заболеваний человека (грипп, корь, ветряная оспа, свинка), животных (например собачья чума, птичья оспа), растений; б)вирусы являются участниками мутационного процесса; в) вирусы используются в генной инженерии в качестве в качестве вектора для переноса участка ДНК, что используется при создании вакцин нового поколения (например вакцина против брюшного тифа);г)вирусы бактерий (бактериофаги) применяются в диагностике и профилактике для лечения бактериальных инфекций. Контрольные вопросы: 1.Дайте общую характеристику вирусам как облигатным внутриклеточными организмам. 2.Какую форму может меть вирион? 3. На какие группы можно классифицировать вирусы? 4.Какие тип взаимодействия вирусов с клеткой ? 5.Какое воздействие может иметь дополнительная генетическая информация провируса при вирогении на клетку? 6.Для чего культивируют вирусы? 7.Какие биологические модели используют в культивировании вирусов? 8.Значение мутаций у вирусов? 9. Кому принадлежит разработка первой в мире вакцины? 10. Что такое тропизм? Самостоятельная работа 1.Составить схему “Классификация вирусов”. 2.Заполните таблицу “Передача наследственной информации в отношении синтеза и-РНК ” используя материалы лекции.
3.Составить глоссарий по тексту лекции. |