вирус 9,10. Титрование вирусов по инфекционной активности

• Название: Титрование вирусов по инфекционной активности
• Дата: 28.01.2021
• Размер: 305.69 Kb.
• Имя файла: вирус 9,10.docx
• Тип: Документы; #172052

Доротюк

Тема: Титрование вирусов по инфекционной активности

Количественную оценку содержания вируса в каком-либо материале проводят методом титрования. Это метод используют, например, перед постановкой реакции нейтрализации, когда надо рассчитать оптимальную дозу вируса для экспериментального заражения лабораторных систем; при производстве вакцин разных поколений (цельновирионных, компонентных и др.); при наработке вирусных антигенов для диагностических наборов; для гипериммунизации животных-доноров и получения от них специфической сыворотки и т.д.

Титр вирусаявляется показателем количества исследуемого вируса в единице объёма материала. Так как количество вируса в традиционных единицах объёма или массы выразить невозможно, то используют, так называемые, единицы активности или единицы действия вируса. Это инфекционная (репродуктивная) активность, которой обладают все вирусы без исключения, и гемагглютинирующая, которая свойственна только гемагглютинирующим вирусам. Исходя из этого, единицы, в которых выражают титр вируса, называются инфекционными или гемагглютинирующими. Размерность этих единиц зависит от соотношения зрелых вирионов и ДИ-частиц в материале, тест-объекта, взятого для титрования, эффекта инфекционного действия вируса и др.

Определение титра вируса по инфекционной активности.

Наиболее универсальным для титрования практически любого вида вируса принято считать метод определения титра в единицах 50%-ного инфекционного действия. В этом методе за единицу количества вируса принимается такая его доза, которая способна вызывать инфекционный эффект у пятидесяти процентов (т.е. у половины) зараженных тест-объектов (живые системы). Эта доза вируса обозначается как ЭД₅₀ – эффективная 50 %-ная доза.

Инфекционный титр вируса – это количество ЭД₅₀ в единице объёма материала (1,0 мл).

Выбор учёта инфекционной активности вирусов по 50 %-ному эффекту действия на живые системы, как видно из графика (рис.1), связан с тем, что кривая зависимости инфекционного эффекта от дозы вируса

Рис. 1 График зависимости инфекционного эффекта от дозы вируса

вблизи точки, соответствующей ЭД50 на значительном отрезке приближается к прямой. Это означает, что в пределах данного отрезка величина инфекционного эффекта пропорциональна логарифму дозы вируса (или его разведению), тогда как в области малых и больших доз вирусов эта зависимость нарушается.

В качестве тест-объектов обычно используют лабораторных животных, куриные эмбрионы и культуру клеток, у которых инфекционное действие вируса может проявляться летальностью, клиническими симптомами, патологоанатомическими изменениями и цитопатическим действием (эффектом) соответственно. Для титрования определённого вида вируса используют только чувствительный к нему вид тест-объект и учитывают характерные формы проявления инфекционного действия (эффект действия) вируса в нём. И в соответствии с этим выбирают обозначение ЭД₅₀ (табл.1).

Обозначения ЭД<sub>50

Таблица</sub> 1

Тест-объекты	Виды инфекционного действия вируса	Единицы количества вируса
		название единиц	обозначение ЭД501
Лабораторные животные	летальность	50%-ная летальная доза	ЛД50
	клинические симптомы (патологоанатомические изменения)	50%-ная летальная доза	ИД50
Куриные эмбрионы	летальность	50%-ная летальная доза	ЭЛД50
	патологоанатомические изменения	50%-ная летальная доза	ЭИД50
Культура клеток	цитопатическое действие (эффект)	50%-ная цитопатическая доза	ЦПД50 ЦПЭ50

Методика титрования вируса по инфекционной активности

Пример титрования вируса по 50 % - ной инфекционной активности

Разведения вируса	1:10 (10-1)	1:102 (10-2)	1:103 (10-3)	1:104 (10-4)	1:105 (10-5)	1:106 (10-6)
Этапы титрования вируса
1 Готовят последовательные 10-кратные разведения вируса ньюкаслской болезни (ВБН)
2 Каждым разведением ВБН заражают по 4 куриных эмбриона в объёме 0,2 мл на эмбрион. За заражен-ными объектами наблюдают
3 Учёт результатов заражения проводят по летальности «+» – есть летальность «–» – нет летальности	Результат 1
	+ + + +	+ + + +	– + + +	– – + +	– – – +	– – – –
	Результат 2
	+ + + +	+ + + +	– + + +	– + + +	– – – +	– – – –

Тема: Титрование вирусов по гемагглютинирующей активности в количественной реакции гемагглютинации

Некоторые вирусы обладают способностью агглютинировать эритроциты определённых видов животных. Титр таких вирусов определяют в количественной реакции гемагглютинации (РГА) и выражают в гемагглютинирующих единицах (ГАЕ).

За 1 ГАЕ принимают такую дозу вируса, которая способна агглютинировать около 50 % эритроцитов (реакция на два креста), взятых в равных с вирусом объёмах.

Методика титрования гемагглютинирующих.

Рассмотрим на примере титрования вирусаньюкаслской болезнив количественной РГА. Реакцию ставят микрометодом в 96-луночных планшетах (таблица 10).

1 Готовят ряд последовательных двукратных разведений вируссодержащего материала в равных объёмах (по 50,0мкл).

2 Ко всем разведениям вируса добавляют 1,0 %-ную суспензию эритроцитов петуха в таком же объёме.

3 Одновременно ставят контроль эритроцитов на спонтанную агглютинацию. Для этого в одну из лунок вносят в равных объёмах (по 50,0мкл) физиологический раствор и 1,0 %-ную суспензию эритроцитов петуха.

4 Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 15-20 мин.

5 Процент агглютинации эритроцитов оценивают по шкале (таблица 11).

6 Определяют титр вируса в ГАЕ.

Протокол титрования вируса болезни Ньюкасла

по гемагглютинирующей активности

№№ лунок планшета	1	2	3	4	5	6		7
Разведение ВБН	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64		К эр.*
Физиологический раствор, мкл)	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0		50,0
ВБН, мкл	50,0	Последовательный перенос по 50,0 **
1,0% суспензия эритроцитов петуха (мкл)	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0		50,0
Контакт 25-30 минут при комнатной температуре
Учёт реакции	+++	+++	+++	++	++	–		–

Для определения титра вируса необходимо: наиболее универсальным для титрования практически любого вида вируса принято считать метод определения титра в единицах 50%-ного инфекционного действия. В этом методе за единицу количества вируса принимается такая его доза, которая способна вызывать инфекционный эффект у пятидесяти процентов (т.е. у половины) зараженных тест-объектов (живые системы). Эта доза вируса обозначается как ЭД50 – эффективная 50 %-ная доза. ________________________________________________________________ Исходя из этого, за титр вируса принимают

Титр вируса в РГА равен: Некоторые вирусы обладают способностью агглютинировать эритроциты определённых видов животных. Титр таких вирусов определяют в количественной реакции гемагглютинации (РГА) и выражают в гемагглютинирующих единицах (ГАЕ). За 1 ГАЕ принимают такую дозу вируса, которая способна агглютинировать около 50 % эритроцитов (реакция на два креста), взятых в равных с вирусом объёмах.

1^ Примечание:1 ЛД₅₀ – это доза вируса, вызывающая летальность 50 % зараженных лабораторных животных; 1 ИД₅₀ – это доза вируса, вызывающая клинические симптомы или патологоанатомические изменения у 50 % зараженных лабораторных животных; 1 ЛД₅₀ – это доза вируса, вызывающая летальность 50 % куриных эмбрионов; 1 ЛД₅₀ – это доза вируса, вызывающая патологоанатомические изменения у 50% зараженных куриных эмбрионов; 1 ЦПД₅₀ - это доза вируса, вызывающая цитопатическое действие (эффект) у 50% зараженных клеточных культур