Учебнометодическое пособие по самостоятельной внеаудиторной и аудиторной работе студентов лечебного и педиатрического факультетов. Киров 2009
 Скачать 1.87 Mb.
|
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «КИРОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ» ФЕДЕРАЛЬНГО АГЕНТСТВА ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ И СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ Кафедра гистологии, цитологии и эмбриологии. Гистологическая техника, цитология и общая эмбриология. Учебно-методическое пособие по самостоятельной внеаудиторной и аудиторной работе студентов лечебного и педиатрического факультетов. Киров 2009 2 УДК 611.018+576.3+611.013](075.8) ББК 28.706+28.705+28.03]я73 Г51 Печатается по решению редакционно-издательского совета Кировской государственной медицинской академии, протокол № 2 от 21 января 2009. Гистологическая техника, цитология и общая эмбриология: учебно-методическое пособие по самостоятельной внеаудиторной и аудиторной работе студентов лечебного и педиатрического факультетов / сост. Е.В. Коледаева В.Б. Зайцев, И.Н. Гамулинская., Е.А. Бессолицына. – Киров: Кировская ГМА, 2009. - 43 с: 38 ил. Учебно-методическое пособие предназначено для внеаудиторной и аудиторной самостоятельной работы по гистологической технике, цитологии и общей эмбриологии для студентов лечебного и педиатрического факультетов. Оно составлено в соответствии с программой гистологии, цитологии эмбриологии для высших медицинских учебных заведений Минздрава РФ от 2002 г. и включает для каждой темы теоретические вопросы и домашние задания, а также примеры решения ситуационных задач, контрольные вопросы, графические схемы и сравнительные таблицы для лучшего усвоения материала, кроме того самостоятельные контрольные работы. Пособие снабжено значительным иллюстративным материалом. Рецензент: Спицин А. П. – заведующий кафедрой патофизиологии Кировской государственной медицинской академии, доктор медицинских наук, профессор. © Е.В. Коледаева, В.Б. Зайцев, И.Н. Гамулинская, Е.А. Бессолицына. 2009 © ГОУ ВПО Кировская ГМА Росздрава 3 Содержание Предисловие ............................................................................................................... 4 Тема ............................................................................................................................. 5 ЭТАПЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА. ............. 5 МЕТОДЫ И ТЕХНИКА МИКРОСКОПИИ. .......................................................... 5 МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ВНЕАУДИТОРНОЙ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЕ СТУДЕНТОВ .............................................. 5 МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ АУДИТОРНОЙ РАБОТЕ СТУДЕНТОВ ............................................................ 7 Тема ........................................................................................................................... 18 КЛЕТКА И НЕКЛЕТОЧНЫЕ СТРУКТУРЫ ....................................................... 18 МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ВНЕАУДИТОРНОЙ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЕ СТУДЕНТОВ ............................................ 19 МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ АУДИТОРНОЙ РАБОТЕ СТУДЕНТОВ .......................................................... 21 Тема ........................................................................................................................... 26 ЯДРО КЛЕТКИ. ДЕЛЕНИЕ КЛЕТКИ. ................................................................. 26 МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ВНЕАУДИТОРНОЙ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЕ СТУДЕНТОВ ............................................ 26 МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ АУДИТОРНОЙ РАБОТЕ СТУДЕНТОВ .......................................................... 28 Тема. .......................................................................................................................... 33 ОБЩАЯ И СРАВНИТЕЛЬНАЯ ЭМБРИОЛОГИЯ. ............................................ 33 МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ВНЕАУДИТОРНОЙ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЕ СТУДЕНТОВ ............................................ 33 МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ АУДИТОРНОЙ РАБОТЕ СТУДЕНТОВ .......................................................... 36 4 Предисловие В свете современных тенденций развития высшей медицинской школы все больше времени отводится на самостоятельную работу студентов, однако, обилие научной и учебной литературы и большой объем изучаемого материала по дисциплине гистология, цитология и эмбриология затрудняет студентам систематизацию и усвоение материала по предмету. Целью данного пособия является организация самостоятельной подготовки студентов лечебного и педиатрического факультетов к практическим занятиям, по гистологической технике, цитологии и эмбриологии, которые можно проводить как аудиторно, так и внеаудиторно. Методические указания побуждают к самостоятельной творческой работе, способствуют развитию активной умственной деятельности. Ситуационные задачи стимулируют мотивационную основу деятельности студентов в освоении будущей профессиональной деятельности. Все задания выполняются студентами в рабочей тетради, которая ведется в течение всего года изучения дисциплины. Наличие в пособии большого количества рисунков гистологических препаратов и электроннограмм облегчает восприятие студентами 1 и 2 курсов сложной морфологической науки. Пособие содержит несколько вариантов самостоятельных контрольных работ по каждой теме, которые позволяют осуществлять постоянный контроль за внеаудиторной самостоятельной работой студентов. Студенты помните: для того, чтобы овладеть последующими разделами по частной гистологии, а также клиническим дисциплинам и стать высококвалифицированным врачом, Вам необходимо на данном этапе обучения приобрести знания и умения по основам гистологической техники, цитологии, общей эмбриологии и общей гистологии. Желаем вам удачи и упорства в освоении дисциплины гистология, цитология и общая эмбриология. 5 Тема ЭТАПЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА. МЕТОДЫ И ТЕХНИКА МИКРОСКОПИИ. Основными видами работы на лабораторных занятиях по гистологии являются самостоятельное микроскопирование и изучение гистологических препаратов. Анализируя структурные особенности гистологических объектов и характерные для них тинкториальные свойства, исследователь имеет возможность получить представление о функциональном состоянии изучаемых клеток, тканей и органов. Существенно дополняет эту информацию использование гистохимических методов и специальных микроскопических методов исследования. Успешное овладение микроскопической техникой и методами гистологического исследования создает условия для более глубокого изучения материала. Цели занятия Ознакомиться с содержанием основных этапов изготовления фиксированного и окрашенного гистологического препарата. Получить представление о тинкториальных свойствах структур в гистологическом препарате. Познакомиться с принципами работы и использования приборов специальной микроскопии в исследовательских целях. Закрепить навыки микроскопирования гистологического препарата. МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ВНЕАУДИТОРНОЙ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЕ СТУДЕНТОВ НЕОБХОДИМЫЙ ИСХОДНЫЙ УРОВЕНЬ ЗНАНИЙ Из курса физики 1. Основные оптические приборы, используемые для микроскопирования. 2. Ход лучей в световом и электронном микроскопах. 3. Разрешающая способность и увеличение микроскопа. По теме занятия 1. Методы исследования в гистологии. 2. Окраска срезов и тинкториальные свойства гистологических структур. ЛИТЕРАТУРА ДЛЯ САМОПОДГОТОВКИ 1. Быков В.Л. Цитология и общая гистология (функциональная морфология клеток и тканей человека). – СПб: СОТИС, 2004 или 2007 г. (с. 12 -30) 2. Гистология, цитология и эмбриология. под редакцией Афанасьева Ю.И., Юриной Н.А. – М: «Медицина», 2002 г. (с. 9 - 21) 3. Гистология, эмбриология и цитология. под редакцией Улумбекова Э.Г., Челышева Ю.А. 3- е издание переработанное и дополненное. – М: ГЭОТАГ – Медицина, 2007 г. (с. 92 - 101) 4. Кузнецов С.Л., Мушкамбаров Н.Н. Гистология, цитология и эмбриология: Учебник для медицинских вузов. – М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2007 г (с. 19 - 30). ЗАДАНИЯ 1. Запишите в тетрадь требования, предъявляемые к гистологическому препарату (см. теор. блок) 6 2. Отметьте в таблице названия основных этапов изготовления гистологического препарата и укажите кратко сущность каждого из них. Этапы изготовления гистологического препарата Сущность этапа 3. Заполните таблицу, перечислив основные группы красителей, укажите названия структур, воспринимающих краситель, и примеры красителей. Группы красителей Название окрашиваемых структур Пример красителя 4. Заполните таблицу, отметив основные виды микроскопии, их разновидности, кратко сформулируйте цели использования каждой разновидности. Виды микроскопии Разновидности Цели использования C ИТУАЦИОННЫЕ ЗАДАЧИ 1. На занятии студент рассматривает микропрепарат под микроскопом с увеличением объектива в 40 раз и окуляра в 15 раз. Во сколько раз видимое изображение структур больше истинного. 2. При проведении хирургической операции возникла необходимость в гистологическом анализе оперируемого органа. Какие методы гистологического исследования следует при этом использовать? 3. На лабораторном занятии по гистологии студент изучил микропрепарат при малом увеличении микроскопа, а затем хотел рассмотреть интересующую его структуру при большом увеличении, но, несмотря на попытки сфокусировать изображение, четкости он не добился, а стекло препарата разбилось. Какие ошибки были допущены при изучении микропрепарата? 4. При изучении микропрепарата в световом микроскопе интересуемая структура находится у края поля зрения, справа. В какую сторону следует переместить микропрепарат на предметном столике микроскопа, чтобы она оказалась в центре поля зрения? КОНТРОЛЬНЫЕ ВОРОСЫ 1. Что такое разрешающая способность микроскопа и от чего она зависит. 2. Чему равна разрешающая способность светового и электронного микроскопов. 3. Назовите основные этапы изготовления гистологических препаратов. 4. В чем сущность фиксации, и какие требования предъявляют к фиксаторам. 5. Для чего необходимо уплотнение ткани при изготовлении гистологического препарата, и какие используют уплотняющие среды. 6. Какими преимуществами обладает заливка материала в парафин. 7 7. Как называются приборы для получения срезов, и какие основные части в них выделяют. 8. Назовите оптимальную толщину срезов при использовании заливки в парафин и целлоидин. 9. Какова цель окрашивания гистологических препаратов. 10. Какие группы красителей используют в гистологической практике. Назовите примеры. 11. Какие структуры при окрашивании называются «оксифильными» и «базофильными». От чего зависит тинкториальные свойства структур. 12. Что является целью последнего этапа изготовления гистологического препарата. 13. Назовите фиксаторы, используемые в электронной микроскопии, которые стабилизируют белки и фосфолипиды. 14. Какие среды применяют для уплотнения в электронной микроскопии. Чему равна оптимальная толщина срезов, используемая для электронной микроскопии. 15. Как называется окрашивание в электронной микроскопии, и какие соединения используются для этих целей. МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ АУДИТОРНОЙ РАБОТЕ СТУДЕНТОВ Изучить теоретический блок . ОСНОВЫ ГИСТОЛОГИЧЕСКОЙ ТЕХНИКИ Требования, предъявляемые к гистологическому препарату: 1. Структура препарата должна соответствовать прижизненному строению органа и ткани. 2. Препарат должен быть тонким и прозрачным. 3. Препарат должен быть окрашенным. 4. Препарат должен длительно храниться (это достигается заключением в бальзам). Основные этапы приготовления гистологического препарата для светооптического исследования: I. Взятие материала Требования, предъявляемые к взятию материала: 1. Материал должен быть свежим. 2. Иссечение кусочков производим скальпелем или бритвой. 3. Нельзя промывать водой или протирать тряпкой. 4. Брать материал следует с минимальной затратой времени. 5. Объем кусочка должен быть не более 0,5-1 см 3 6. Взятие материала должно производиться сообразно строению органа. 7. Если мы имеем дело с опухолевым участком, то материал должен браться на границе больного и здорового участков. II . Фиксация – метод обработки живого объекта фиксирующими веществами с целью сохранения прижизненной структуры органа или ткани. Механизм фиксации основан на коагуляции белков. Виды фиксаторов: А) Физические: 1.холод (замораживание) 2.лиофильная сушка (сушка на морозе) Б) Химические: 1. Простые – состоят из одного ингредиента: - 10% формалин 8 - 96% спирт, ацетон - 2% осмиевая кислота (для электронной микроскопии) - трихлоруксусная кислота 5-10% раствор - пикриновая кислота (2% раствор) - 5% уксусная кислота - соли тяжелых металлов: ртути (сулема), платины, урана и др. - сульфосалициловая кислота 2. Сложные: - смесь Буэна (пикриновая кислота, формалин, уксусная кислота) - смесь Карнуа (спирт, формалин, уксусная кислота) - смесь Ценкера (бихромат калия, сернистый натрий, сулема, уксусная кислота) Правила фиксации: 1. Объем фиксатора в 20-40 раз должен превышать объем фиксируемого объекта. 2. Время фиксации определяется объемом кусочка и выбором фиксатора. 3. Выбор фиксатора зависит от целей и задач исследователя. III. Промывка в воде – для водорастворимых фиксаторов и в спирте – для спирторастворимых фиксаторов. Цель: освобождение от фиксатора. IV. Обезвоживание и уплотнение - проводят по батарее спиртов возрастающей концентрации (крепости). Основное правило: правило постепенного воздействия применяемых веществ на исследуемые ткани. Если применяли водорастворимый фиксатор, тогда батарея спиртов следующая: 30 0 →40 0 →50 0 →60 0 →70 0 →80 0 →90 0 →96 0 I →96 0 II →100 0 абсолютный спирт Если применяли спирторастворимый фиксатор, батарея спиртов начинается с 70 0 спирта: 70 0 →80 0 →90 0 →96 0 I →96 0 II →100 0 абсолютный спирт V . Заливка – пропитывание веществами представляющими собой плотные среды. Заливку производят в парафин и в целлоидин. А) Парафиновая заливка Парафин не растворяется в спирте, зато растворяется в органических растворителях (бензол, ксилол, толуол, хлороформ). Прежде чем материал залить в парафин, его нужно провести через ряд промежуточных сред: спирт + ксилол → ксилол I → ксилол II → ксилол + парафин (t = 37 0 ) → парафин I (t = 56 0 ) → парафин II(t = 56 0 ) → заливочный парафин (содержит 5% воска) Положительные стороны парафиновой заливки: 1) Можно делать тонкие срезы ≈ 5 мкм 2) Относительная быстрота проводки: время нахождения в различных средах зависит от структуры органа и размера кусочка и подбирается опытным путем. Отрицательные стороны парафиновой заливки: 1) Воздействие на объект высоких температур, что часто приводит к высушиванию и деформации материала. 2) Возможность заливать только мелкие объекты Б) Целлоидиновая заливка Целлоидин – это нитроклетчатка, для этой цели используют рентгеновские пленки, которые растворяются в смеси спирт + эфир. Получается жидкий целлоидин. Проводку осуществляют в последовательности: Спирт + эфир → 2% целлоидин → 4% целлоидин → 6% целлоидин → 8-10% целлоидин. Далее помещают заливаемый объект в чашку Петри с 10% целлоидином и приоткрывают крышку, чтобы среда получилась эластичной. Затем вырезают объект вместе со средой и приклеивают с помощью густого целлоидина к деревянному блоку. Такой гистологический блок хранят в банке с 70-градусным спиртом, чтобы предотвратить от высыхания. Парафиновые блоки можно хранить при комнатной температуре. Положительные стороны парафиновой заливки: 9 1) можно заливать более крупные объекты Отрицательные стороны парафиновой заливки: 1) невозможность получить тонкие срезы, толщина срезов =20 мкм VI . Резка Резку осуществляют на приборе под названием микротом. Основной элемент микротома – стальной нож. Микротом может находиться внутри прибора, который поддерживает постоянную t ≈ - 18-20 0 . Он носит название криостат. Этот прибор широко используется для экспресс– диагностики во время хирургических операций, для научных исследований, для гистохимических методов исследования, так как этапы фиксации и уплотнения осуществляются одновременно благодаря замораживанию при низких температурах и существенно экономят время исследования. После резки парафиновый срез помещают в каплю воды на предметное стекло и слегка подогревают на термостолике, чтобы срез расправился. Далее оставляют стекло до полного высыхания воды. VII . Депарафинизация. Прежде чем окрашивать гистологический срез, необходимо освободиться от парафина и наводнить препарат, так как обычные гистологические красители водные. Препарат на предметном стекле погружают в следующие растворы: ксилол I → ксилол II → 96 0 I → 96 0 II → 70 0 → Н 2 О VIII. Окрашивание Препарат окрашивают сначала ядерным красителем, затем цитоплазматическим. Виды красителей: А) ядерные (основные) гематоксилин (окрашивает ядро в синий цвет) железный гематоксилин азур II (в фиолетовый цвет) кармин (в красный цвет) сафранин (в красный цвет) метиловый синий (в синий цвет) толуидиновый синий (в синий цвет) тиониновый синий (в синий цвет) Б) цитоплазматические (кислые) эозин – окрашивает цитоплазму в розовый цвет эритрозин оранжевый «G» кислый фуксин – в красный пикриновая кислота – в желтый конго красный- в красный В) специальные судан III – окраска липидов и жиров в оранжевый цвет осмиевая кислота – окраска липидов и жиров в черный цвет орсеин – окраска эластических волокон в коричневый цвет азотнокислое серебро – импрегнация нервных элементов в темно-коричневый цвет Структуры клетки, окрашиваемые кислыми красителями называются оксифильными (ацидофильными) – окрашивание в розовый цвет. Структуры клетки, окрашиваемые основными красителями называются базофильными – окрашивание в синий цвет. Структуры клетки, окрашиваемые как основными, так и кислыми красителями одновременно называются нейтрофильными – окрашивание в фиолетовый цвет. IX. Просветление осуществляют в следующих растворах: Н 2 О → 70 0 → 96 0 I → 96 0 II → ксилолI → ксилол I X. Заключение в бальзам. 10 Используют канадский бальзам, так как его коэффициент преломления равен коэффициенту преломления стекла. После нанесения бальзама срез покрывают покровным стеклом. После высушивания гистологический препарат готов для проведения гистологического анализа. Микроскоп Рисунок 1. Приготовление гистологических препаратов для световой микроскопии. ТЕХНИКА РАБОТЫ С МИКРОСКОПОМ Основным прибором, который используют студенты на занятиях, является световой микроскоп. Он позволяет получить увеличенное и обратное изображение объекта. I . Устройство микроскопа. В микроскопе различают оптическую, осветительную и механическую части. Оптическая часть. Эта часть включает в себя объективы, устанавливаемые в гнезда револьверного устройства тубуса; окуляр, расположенный в тубусе. Объектив — сложная система линз. Чаще используют объективы Х8, Х20. Х40, Х90. По особенностям использования и конструкции объективы подразделяют на сухие (Х8, Х20, Х40) и иммерсионные (Х90). Окуляр увеличивает изображение, данное объективом. Чаще всего применяют окуляры Х5, X 7, Х10, Х15. Основной технической характеристикой объектива является разрешающая способность, т. е. наименьшее расстояние, на котором две близлежащие точки объекта воспринимаются 11 раздельно. В световом микроскопе это расстояние определяется в основном длиной световой волны и соответствует ее второй части. Осветительная часть включает в себя зеркало (с одной стороны вогнутое, которое используют при расходящемся источнике света (лампочка накаливания), с другой — плоское); конденсора, с помощью которого пучок света фокусируется на препарате; ирисо- вую диафрагму, вмонтированную в конденсор для изменения степени освещенности препарата. С помощью зеркала пучок света посылается в конденсор и через него на препарат (при изучении препарата в проходящем свете). Механическая часть. К ним относят штатив, колонку с микро- и макровинтами, тубус. Увеличение, получаемое в микроскопе, определяют произведением увеличения объектива на увеличение окуляра. Наиболее распространенные в нашей стране микроскопы типа "МБИ" и "Биолам" дают увеличение до 2000 раз. II. Техника микрокопирования. 1. Поставить микроскоп в удобное для наблюдения положение у края стола. Тетрадь положить справа. 2. Установить микроскоп на малое увеличение (объектив 8 х , или 10 х ), доведя револьвер строго до защелки. Затем с помощью поворотов вогнутого зеркала получить равномерное освещение всего поля зрения микроскопа (предпочтительнее пользоваться искусственным освещением от матового светильника). 3. Положить препарат на предметный столик микроскопа так, чтобы объект находился над отверстием столика покровным стеклом вверх. 4. Движением кремальеры найти фокус малого увеличения и изучить препарат. При необходимости рассмотреть какую-либо структуру с большим увеличением следует поставить ее в центр поля зрения (передвигая препарат рукой). 5. Затем плавным движением перевести револьвер на большое увеличение, осторожно с помощью кремальеры установить фокус сильного увеличения (обычно нужно слегка приподнять тубус!) и только после этого микрометрическим винтом отфокусировать объект. Работая с большим увеличением, необходимо постоянно слегка вращать микровинт в обе стороны, т.к. структуры находятся на различном уровне препарата. Для получения более контрастно го изображения можно пользоваться конденсором. Кроме того, старайтесь научиться микроскопировать обоими глазами, т.к., закрывание одного глаза приводит к быстрому утомлению другого. 6. Изучив препарат, приступите к зарисовке. По окончании ее переведите микроскоп на малое увеличение и извлеките препарат. 7. Для изучения очень мелких гистологических структур используют иммерсионный объектив (X 90). При этом на покровное стекло препарата наносят каплю иммерсионного масла (кедровое масло), после чего осторожно опускают тубус до прикосновения фронтальной линзы объектива к маслу. Используя микровинт, достигают четкого изображения. После окончания pa масло удаляют с объектива и покровного стекла марлей. При работе с микроскопом нельзя: 1. Вращать микровинт на малом увеличении и за пределы упора ограничителя. 2. Располагать препарат покровным стеклом вниз. 3. Пользоваться загрязненными препаратами, окулярами и другими оптическими частями. 4. Переводить микроскоп на большое увеличение, не добившись резкого изображения на малом. 5. Вынимать препараты из под объектива большого увеличения. 6. Работать при слабом или неправильном освещении объекта. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ В ГИСТОЛОГИИ, ЦИТОЛОГИИ И ЭМБРИОЛОГИИ. 12 I. Цито- и гистохимические методы исследования Цито- и гистохимические методы позволяют выявлять химические соединения различных классов в структурах клеток и тканей, а также их локализацию. Специфичность химической реакции в ряде случаев может быть проверена с помощью дополнительного контроля (например, путем предварительного расщепления соответствующим ферментом). В основу цито- и гистохимических методов исследования положен ряд принципов. 1. Избирательное окрашивание, при котором определенные химические группировки внутриклеточного вещества вступают в реакцию с красителем. 2. Избирательное растворение красителя в определенном субстрате, характеризующем клеточную структуру. 3. Перевод некоторых неактивных химических соединений, неспособных взаимодействовать с красителем, в активное состояние. 4. Получение с помощью промежуточных реакций неокрашенного продукта с последующим переводом его в окрашенный. Так, специфичной для выявления ДНК является реакция Фельгена, которая основана на том, что альдегидные группы дезоксирибозы восстанавливают окраску основного фуксина, предварительно обесцвеченного сернистой кислотой (реактив Шиффа). В результате реакции хроматин окрашивается в пурпурно-красный цвет. Для одновременного выявления ДНК и РНК часто применяют метод Браше с использованием метилового зеленого и пиронина. При этом способе метиловый зеленый окрашивает ДНК хромосом в зеленый цвет, а пиронин окрашивает РНК ядрышек и цитоплазмы в красный цвет. Выявление гликогена, гликопротеинов, гликолипидов — соединений, содержащих сахара, основано на окислении гликолевых групп последних до альдегидов с последующим взаимодействием с реактивом Шиффа. Продукт реакции окрашивается в различные оттенки пурпурно-красного цвета. В случае выявления гликозаминогликанов (гиалуроновая кислота, хондроитинсульфат, кератансульфат, гепарансульфат, гепарин) используют способность их анионных групп связываться при низких значениях рН с основными красителями или давать метахроматическое окрашивание с тиазиновыми красителями — толуидиновым синим, азуром. Выявление липидов основывается на их способности окрашиваться растворенными в них красителями, например Суданом. Сочетание цито- и гистохимических методов исследования с методом электронной микроскопии послужило основой развития электронной гистохимии. II. Электронная микроскопия Многие структуры клетки находятся за пределами разрешающей способности светового микроскопа. Длина волны видимой части спектра лежит в пределах от 0,4 до 0,7 мкм, максимальное разрешение, полученное при этом с помощью светового микроскопа, может составлять 0,2 мкм. Открытие волновых свойств, присущих электронам, послужило основой для создания нового класса приборов — электронных микроскопов. Максимальное разрешение, которое может быть получено в них при специальных условиях, составляет 0,2 нм, а увеличение может достигать 100— 200 тыс. раз. Принципы работы электронного микроскопа Принципиальная схема построения изображения в световом и электронном микроскопах сходна. Однако существует ряд отличий: в электронных микроскопах источником электронов служит катод, входящий в состав электронной пушки, в качестве линз используются электромагнитные катушки. В связи с тем, что в воздухе электроны могут проникать на незначительные расстояния, а затем их скорость гаснет, в электронном микроскопе с помощью специальных насосов создается высокий вакуум (104 мм рт. ст.). В колонне микроскопа (тубусе), из которой откачан воздух, последовательно расположены катод (вольфрамовая нить), анод (металлическая пластинка с отверстием посередине), магнитные линзы, люминесцентный экран, фотопластинки ("магазин"). Ток, проходя через вольфрамовую нить катода, нагревает ее и вызывает эмиссию электронов. Поданное на катод высокое напряжение создает большую разность 13 потенциалов между катодом и анодом, что обеспечивает движение электронов к аноду и далее вниз по колонне микроскопа. Электронный пучок сначала фокусируется первой магнитной линзой — конденсорной. Большая часть электронов, проходя через объект, не отклоняется. Электроны, прошедшие через объект, фокусируются второй магнитной линзой — объективной, которая дает увеличенное изображение объекта. Это изображение снова увеличивается третьей магнитной линзой—проекционной. При этом электроны, которые проходят через объект, вызывают свечение экрана, покрытого люминофором, а отклонившиеся электроны не доходят до экрана и не вызывают свечения. Изображение, полученное на люминесцентном экране, можно сфотографировать, если поднять экран, под которым расположен фотомагазин с фотопластинками, чтобы пучок электронов попал на фотопластинку. II A. Подготовка материала для электронно-микроскопического исследования Подготовка к электронно-микроскопическому исследованию включает в себя те же этапы, что и при светооптической микроскопии, но с рядом особенностей. Взятие материала необходимо проводить как можно быстрее, небольшими объемами (не более 1 мм3). Фиксацию осуществляют, как правило, глутаральдегидом, хорошо стабилизирующим белки, с последующей дофиксацией в тетраоксиде осмия, который стабилизирует фосфолипиды, на холоде в течение нескольких часов. После фиксации материал промывают буферным раствором, обезвоживают спиртами возрастающей концентрации. Уплотнение и заливку производят с помощью полимеризующейся смеси (эпоксидные смеси). Для этого образцы материала кладут в формы, заливают эпоксидной смолой и помещают в термостат, где происходит полимеризация смолы. Для приготовления срезов (толщиной 30—50 нм) используют ультратомы, в которых подача блока с объектом на неподвижный нож осуществляется с помощью теплового расширения несущего стержня. В качестве ножей применяют специально приготовленные сколы стекла или алмазов. Получаемые при этом последовательные серийные срезы сползают с ножа в виде лент на поверхность жидкости в прикрепленной к ножу ванночке, откуда их надо перенести на сеточки. Контрастирование (или окрашивание) срезов проводят с помощью солей тяжелых металлов (свинца, вольфрама, урана). Содержащиеся в этих соединениях элементы с высокой атомной массой осаждаются на фосфолипидах клеточных мембран и не пропускают электронный луч, вследствие чего эти участки клетки выглядят на экране более темными, контрастными по сравнению с другими участками, не содержащими фосфолипидов. Для ориентировки в изучаемом объекте используют метод изготовления полутонких срезов (1 —2 мкм) с последующим окрашиванием (метиленовым синим или толуидиновым синим). Окрашенный срез рассматривают с помощью микроскопа для определения области, которая должна быть изучена на ультрамикроскопическом уровне, и в дальнейшем с этого участка прицельно готовят ультратонкие срезы. Методика обработки материала для электронно-микроскопического исследования 1. Быстрое взятие материала. 2. Фиксация в 2—4 % забуференном растворе глутаральдегида в течение 1ч. 3. Промывка материала буферным раствором (рН 7,3—7,4) 3 раза по 30 мин. 4. Постфиксация в 1 % растворе тетраоксида осмия в течение 1—2 ч. 5. Промывка материала буферным раствором 3 раза по 30 мин. 6. Обезвоживание в спиртах восходящей концентрации (70 %, 90 %, 100 %) по 10 мин, в 100 % — 2 раза по 15 мин. 7. Пропитывание материала заливочной средой, состоящей из эпоксидных смол, до 24 ч. 8. Заливка материала эпоксидными смолами с добавлением катализатора и последующим помещением его в термостат (60 °С) для полимеризации до 24 ч. 9. Заточка и резка блока. 10. Окрашивание срезов: а) получение полутонких срезов и окрашивание их метиленовым синим; 14 б) получение ультратонких срезов с последующим окрашиванием их (контрастированием) раствором уранилацетата (1—2 ч), а затем раствором цитрата свинца (20—30 мин). Записать или зарисовать в альбом. 1. Требования, предъявляемые к гистологическому препарату 2. Основные этапы приготовления гистологических препаратов. 3. Методы окрашивания и основные типы красителей. 4. Требования при работе с микроскопом. 5. Методы исследования, применяемые в гистологии, цитологии, эмбриологии. Выполнение самостоятельных контрольных работ. 15 Самостоятельная контрольная работа № 1 1. На рисунке представлен оптический микроскоп. Цифрами отмечены детали. Подпишите их. 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) К оптической системе микроскопа относятся №_____________ 2. У микроскопа объектив имеет увеличение х40, окуляр – х15. Видимое изображение больше реального в: А) 500 раз; Б) 55 раз; В) 600 раз; Г) 1000 раз. 3. Данный рисунок получен с использованием: А) трансмиссионной микроскопии; Б) иммуногистохимии; В) сканирующей микроскопии; Г) оптической микроскопии. 4. Заполнить таблицу «Приготовление препаратов для оптической микроскопии». Этап Сущность этапов 1 2 3 4 5 5. Каким образом рассчитывают увеличение светового микроскопа? 6. Вам необходимо выяснить присутствуют ли в выданной вам ткани эластические волокна. Какой метод окраски и тип микроскопии вы выберете? 7. Заполнить таблицу «Типы красителя». Тип красителя Окрашиваемые структуры пример 1 2 3 4 5 8. Дайте определение метода фиксации. Напишите классификацию фиксатора. 16 Самостоятельная контрольная работа № 2 1. На рисунке представлен оптический микроскоп. Цифрами отмечены детали. Подпишите их. К механической системе микроскопа относятся №_____________ 2. Видимое изображение больше реального в 400 раз, объектив имеет увеличение х40, окуляр: А) х 10; Б) х20; В) х8; Г) х15. 3. Данный рисунок получен с использованием: А) трансмиссионной микроскопии; Б) флуоресцентной микроскопии; В) сканирующей микроскопии; Г) оптической микроскопии. 4. Заполнить таблицу «Приготовление препаратов для электронной микроскопии». Этап Сущность этапов 1 2 3 4 5 5. Для чего появились замороженные срезы? 6. Какими методами подготовки гистологических препаратов и окраски нужно воспользоваться для получения препарата жировых капель в белой жировой ткани? 7. Заполнить таблицу «Специфические методы окраски» 17 Тип окраски Окрашиваемые структуры Принцип метода 1 2 3 4 5 8. Дайте определение линейного увеличения микроскопа. Рассчитайте линейное увеличение светового микроскопа, если увеличение окуляра 7х, а увеличение объектива 40х. Самостоятельная контрольная работа № 3 1.На рисунке представлен оптический микроскоп. Цифрами отмечены детали. Подпишите их. К осветительной системе микроскопа относятся №_____________ 2. Видимое изображение больше реального в 900 раз, окуляр имеет увеличение х10, объектив: А) х80; Б) х100; В) х90; Г) х9. 3. Какими видами микроскопии и окраски воспользовались для получения данной фотографии? 4. Заполнить таблицу: Виды фиксаторов для оптической и электронной микроскопии. 18 Оптическая Электронная 1 2 3 4 5 5. Какими видами микроскопии и окраски можно воспользоваться для изучения ультраструктуры митохондрий? 6. Как настроить фокус микроскопа при большом увеличении и не разбить покровное стекло препарата? 7. Заполнить таблицу «Типы микроскопии». Тип микроскопии Облучающая система Увеличение Разрешение Тип окраски Оптическая 1 2 Электронная 1 2 8. Дайте определение понятия «Разрешающая способность микроскопа». Напишите формулу, по которой она вычисляется. Рассчитайте разрешающую способность светового микроскопа. |