Векторы и векторные системы. Векторы и векторные системы - копия. Векторы и векторные системы для клонирования крупных фрагментов днк что такое вектор Вектор
 Скачать 0.79 Mb.
|
|
Векторы и векторные системы для клонирования крупных фрагментов ДНК Что такое вектор? ВЕКТОР - молекула ДНК, способная самостоятельно реплицироваться, включать чужую ДНК, переносить ее в реципиентные клетки и стабильно там поддерживать. Векторы используют для создания in vitro молекул рекДНК и для последующего введения их в клетки, в результате чего индивидуальные молекулы из исходной смеси рекДНК разделяются по отдельным клонам и в составе последних умножают (клонируют) число чужеродных генов. Подлежащий переносу генетический материал вводится в состав вектора с помощью различных ферментов (рестриктазы, ДНК-лигазы). Классификация векторов По области использования различают: векторы общего назначения (клонирование геномных генов, кДНК, любых фрагментов ДНК); векторы для экспрессии клонированных генов (синтез мРНК и белков); специализированные векторы (секвенирование и мутирование генов, изучение особенностей регуляции клонированных генов, идентификация в клонируемой ДНК промоторов и других регуляторных сайтов). По происхождению ДНК векторы делят на: плазмидные (существуют в клетке и вне ее только в виде молекул ДНК); фаговые (существуют в виде молекул ДНК и вирионов); гибридные (сочетают отдельные свойства плазмид и фагов). По структуре ДНК различают кольцевые и линейные векторы. По способу поддержания в клетке выделяют: автономные (реплицируются самостоятельно); интегративные (реплицируются в составе клеточной хромосомы) векторы. Основные свойства векторов Способность к автономной репликации, то есть обладание ori (точка инициации репликации). Другими словами – генетический вектор должен содержать последовательности нуклеотидов, обеспечивающие не только его собственную репликацию, но и воспроизведение встроенной в него вставки чужеродной ДНК. Наличие в структуре вектора хотя бы одного уникального, то есть встречающегося на молекуле ДНК только один раз, сайта для какой-либо эндонуклеазы рестрикции, по которому происходит встраивание вставки ДНК. Наличие в структуре ДНК вектора селективного маркера – гена или генов, кодирующих белки, которые отсутствуют в клетках реципиента, например – белки, обеспечивающие устойчивость к антибиотикам. Это обеспечивает возможность вести отбор клонов, содержащих вектор со встроенной вставкой ДНК. Небольшой размер ДНК вектора. Обеспечение достаточной копийности в клетке-хозяине. Векторные системы для клонирования крупных фрагментов ДНК Для работы c более крупными фрагментами были разработаны векторы: На основе ДНК фагов, в частности, на основе ДНК бактериофага λ E.coli. Фаговые векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК длиной 15-25 т.п.н., что недостаточно для клонирования генов животных и растений, длина которых превышает 35-40 т.п.н. Космиды (представляют собой небольшие плазмиды, в которые in vitro введены cos-сайты ДНК фага λ. Отсюда происходит название всего типа данных векторов (cosmid). Искусственные бактериальные хромосомы (BAC) Векторные системы для клонирования крупных фрагментов ДНК Космиды – один из видов гибридных векторов, которые реплицируются, используя плазмидный тип репликации, и обладают способностью упаковываться in vitro в оболочки частиц фага λ. Такие векторы могут включать до 40 т.п.н. чужеродной ДНК. Схема, демонстрирующая принцип конструирования рекомбинантных ДНК на основе космидного вектора Векторные системы для клонирования очень крупных фрагментов ДНК Векторные системы, способные интегрировать крупные вставки (>100т.п.н.), имеют большую ценность при анализе сложных эукариотических геномов. Без таких векторов не обойтись, например, при картировании генома человека или при идентификации отдельных генов. Возможности использования разных типов векторов при клонировании в клетках E.coli PAC-клонирование Для клонирования фрагментов ДНК размером от 100 до 300 т. п. н. был сконструирован низкокопийный плазмидный вектор на основе бактериофага Р1. Природная форма бактериофага Р1 Е. coli в виде профага не интегрирует в хромосому, а существует в плазмидной форме. Фактически ДНК фага Р1 представляет собой природную фазмиду. Вектор РАС — химерная конструкция, называемая искусственной хромосомой на основе фага Р1. Схема клонирования больших фрагментов ДНК с помощью вектора pAd10 BAC-клонирование В 1992 году Хируоко Шизуя создал также очень стабильный вектор, способный интегрировать вставки длиной от 150 до 350 т. п. н., на основе F-плазмиды (F-фактора, или фактора фертильности) Е. coli, которая представлена в клетке одной или двумя копиями, с селекционной системой lacZ' векторов pUC. Эта конструкция называется бактериальной искусственной хромосомой (ВАС, англ. bacterial artificial chromosomes). Клонирование фрагментов ДНК большого размера с помощью ВАС BAC-клонирование и линейные векторы на базе плазмиды N15 Строение линейного вектора pLV3, сконструированного на базе репликатора плазмиды N15 Строение вектора pBAC108L, сконструированного на базе репликатора плазмиды F YAC-клонирование Искусственные дрожжевые хромосомы (YAC – yest artificial chromosome). Эта система предназначена для клонирования очень больших фрагментов ДНК (до 2000 т.п.н.), которые потом поддерживаются в дрожжевой клетке как отдельные хромосомы. YAC-система клонирования Благодарю за внимание! |