Биология 11 класс. Вирусы и эукариотические клетки.Image.Marked. Вирусы и эукариотические клетки стадии взаимодействия, стратегии экспрессии геномов, репродукция и исходы вирусной
 Скачать 248.13 Kb.
|
|
После депротеинизации каждая мРНК копируется в форме двуцепочечных молекул. В течение нескольких часов синтезируются множество “+” и “-“ нитей РНК, используемых для построения новых вирусных частиц (1, 5, 6, 11). Стратегия +РНК геномных вирусов с обратной транскрипцией. Ретровирусы являются оболочечными вирусами и входят в клетку посредством слияния с плазматической мембраной и, возможно, мембранами эндосом. ВИЧ содержит одноцепочечную +РНК, но применяет уникальную стратегию репликации создавая промежуточный продукт – двуцепочечную ДНК провируса (копию РНК- генома) (рис. 5)(1, 5, 6, 11, 19). Рис. 5. Схема репродукции вирусов с обратной транскрипцией Процесс протекает с участием уникального фермента-обратной транскриптазы (ОТ) и РНК-азы Н, присутствующих в вирионе. Вирусная одноцепочечная +РНК 9 сохраняется в качестве матрицы для вирионной РНК-зависимой ОТ. Последняя синтезирует молекулы ДНК из РНК матрицы. РНК-аза Н расщепляет нить РНК гибридной молекулы ДНК-РНК. Двуцепочечные ДНК-ые копии генома транспортируются в ядро и интегрируются в ДНК хромосом. В интегрированном состоянии геном вируса может находиться долгое время, и называются «провирусом», транскрибируются клеточными РНК-полимеразами, создавая молекулы РНК идентичные геному вируса. Молекулы этих РНК транспортируются в цитоплазму в несплайсированном виде или в виде нескольких сплайсированных мРНК. В этом отношении интегрированные ретровирусы (ДНК- провирусы) похожи на профаги лизогенных бактериофагов. Геномная РНК является мессенджером для трансляции серии молекул полипротеинов. Затем протеаза расщепляет полипротеиновую молекулу на полипептиды- предшественники отдельных структурных и неструктурных белков. Стратегия ДНК геномных вирусов. Двуцепочечные ДНК вирусы содержат НК линейной (герпес-, адено-и поксвирусы) и кольцевидной (паповавирусы) формы. ДНК-вирусы образуют мРНК, используя стратегии подобные таковым эукариотических клеток (рис. 6). Рис. 6. Схема репродукции двуцепочечных ДНК вирусов После связывания с рецепторами и пенетрации в клетку первым событием репликации является продукция мРНК из геномной ДНК. У папова-, адено-и герпесвирусов транскрипция вирусной ДНК в мРНК происходит в ядре клетки- хозяина клеточной ДНК-зависимой РНК-полимеразой. У паповавирусов (вирус SV-40) различают раннюю и позднюю транскрипцию. В период транскрипции образуются ранние мРНК, кодирующие регуляторные (ранние) белки – альфа (сверхранние) и бета(ранние), а затем образуются поздние мРНК, кодирующие поздние (гамма) белки(структурные). Геном аденовирусов, также характеризуются наличием ранних и поздних генов (рис. 8). Среди продуктов ранних генов имеется тимидинкиназа и вирус-специфическая ДНК-полимераза. Большинство поздних белков, являются структурными. При их продукции ингибируется биосинтез сверхранних и ранних белков. В промежутке между синтезом бета и гамма белков начинается биосинтез новых молекул геномной ДНК вирусов. Индивидуальные мРНК ранних и поздних генов соответствуют сиквенсу вирусной ДНК, т.е. экзонов, которые отделены участками нетранслируемымых последовательностей – интронами. Незрелые молекулы мРНК интенсивно разрезаются и в результате сплайсинга соединяются в одну 10 молекулу. Синтез мРНК начинается с участков перекрывания вирусной ДНК. Этот избыток снижает количество вирусной ДНК необходимой для кодирования некоторых вирусных белков и является механизмом геномной экономии. Однако ДНК полимеразы самостоятельно не способны начать синтез полинуклеотидной цепи. Они могут только наращивать ее в соответствии с инструкцией ДНК- матрицы. Образование новой цепи инициируется специфической РНК полимеразой, названной «альфа-примазой» или «короткой примазой». У вируса SV-40 альфа-примаза вначале синтезирует специальный праймер, инициирующий репликацию, а образовавшаяся репликационная вилка наращивается в двух направлениях. В результате образуются две двуцепочечные кольцевидные молекулы ДНК. У герпесвирусов геном является кольцевидным. Репликационная вилка наращивается только в одном направлении, конечным продуктом является одна молекула циркулярной двуцепочечной ДНК. У аденовирусов, в противоположность этому, геном является линейным. Репликационная вилка также наращивается только в одном направлении, а конечным продуктом является молекула двуцепочечной линейной ДНК. Рис. 8. Динамика репродукции вирусов и биосинтеза белков. А. Кривая цикла роста (репродукции) вируса в культуре клеток и динамика его высвобождения Б. Характеристика кривых репродукции вирусов, относящихся к разным семействам Наиболее сложно организованы поксвирусы. Начальные этапы транскрипции и трансляции происходят в цитоплазме клетки. Они не используют клеточные РНК полимеразы, так как их собственные ДНК-зависимые РНК полимеразы, обеспечивают начальные этапы транскрипции. Продукты ранних генов включают ДНК полимеразы, белки, связывающиеся с началом репликации и инициирующие процесс, а также белки стимулирующие клетку к вхождению в S фазу клеточного 11 цикла и повышающие продукцию материалов необходимых для биосинтеза ДНК, или продуктов необходимых для дальнейшей дезинтеграции субвирионных частиц. Ранние вирусные белки ответственны за вторую фазу депротеинизации. Репликация, транскрипция и этапы поздней сборки происходят в специальных участках цитоплазмы, называемых “фабриками“. Ранние белки включают ферменты (ДНК полимеразы, тимидинкиназы), так же как и некоторые структурные белки. Когда инициируется инфекция клетки, репликация ДНК в клетке начинается, синтез ранних неструктурных белков прекращается, а синтез поздних белков еще продолжается. Поздние белки являются структурными, но иные из них также являются ферментами или белками, участвующими в сборке вирионов (1, 5, 6, 7, 11, 21). Стратегия ДНК геномных вирусов с обратной транскрипцией (гепаднавирусов). Гепаднавирусы являются уникальными оболочечными ДНК вирусами животных c обратной транскрипцией (рис.7). После внедрения в клетку ДНК вируса транспортируется в ядро, где превращается в ковалентно закрытую, полностью кольцевидную двуцепочечную ДНК (кдцДНК) Рис.7. Схема репродукции ДНК вирусов с обратной транскрипцией. В отличие от ретровирусов ДНК вируса не интегрируется в геном клетки, а персистирует в ядре в виде нереплицирующейся эписомы. Она транскрибируется клеточными РНК полимеразами, используя несколько разных промоторов кдцДНК для образования серии разных типов РНК. Молекулы этих РНК транспортируются в цитоплазму, где и сохраняются в качестве мРНК. Одна из этих РНК, называемая РНК-предшественником несколько длиннее и выполняет функцию матрицы для обратной транскрипции в ДНК. Обратная транскрипция осуществляется ферментом ОТ с участнием РНК-азы Н, транслируемыми из соответствующих вирусных мРНК. Самой первой в результате обратной транскрипции синтезируется полная минус-смысловая ДНК. Синтез второй нити (плюс-смысловой ДНК) начинается позднее, но завершается только частично. В результате этого, сердцевина вириона содержит частично к дц ДНК (т.е. геном вируса). Сердцевина вируса, содержащая ДНК генома, в дальнейшем использует несколько путей реализации. На ранних этапах инфекции 12 вновь образованные частицы могут усиливать образование кдцДНК в ядре. Они содержат геномную ДНК и не отличаются от аналогичных частиц поступающих в клетку при ее инфицировании. Вновь образованная геномная ДНК может транспортироваться в ядро и там превращаться в кдцДНК. Следует отметить, что амплификация кдцДНК, осуществляется только через промежуточную форму генома в виде молекулы РНК, используя путь описанный ранее. То есть прямая репликация ДНК в ядре отсутствует. На поздних стадиях инфекции клетки происходит созревание сердцевины, собираются полноценные вирионы, которые отпочковываются от ядерной мембраны в эндоплазматический ретикулюм. Переключение на процесс отпочковывания регулируется поверхностными белками перикапсида (1, 5, 6, 11, 16, 18, 28). Стратегия одноцепочечных ДНК геномных вирусов. Семейство парвовирусов является единственным из ДНК вирусов животных относящихся к данной группе. Они имеют очень малый размер генома – 2х106. Некоторые из парвовирусов, кроме того, имеют одноцепочечную ДНК ( – ) негативной полярности. Они реплицируются в быстроделящихся клетках. Другие из парвовирусов содержат (+) или (-) ДНК, являются ко-инфицирующими и зависят от репликации основного вируса “помощника”. Для создания двуцепочечного ДНК – генома вируса они используют кольцевидную ДНК полимеразу, называемого репликативной формой. При этом для прайминга используется собственная нуклеиновая кислота, образующая петлю с 3’конца. Это следует за смещением цепи родительской ДНК и синтезом комплементарных молекул к цепи-матрице. Молекулы мРНК синтезируются с использованием соответствующей цепи ДНК в качестве матрицы, которые затем транслируются в виде белков. Трансляция и биосинтез белков вируса. Трансляция вирусных мРНК осуществляется клеточными системами. Большинство мРНК вирусов животных имеют шапочку (кэп) на 5’ и полиаденилированы на 3’ концах. При этом используются те же самые пути, что и при трансляции клеточных мРНК. Хотя трансляция многих вирусных мРНК сопряжена с интерференцией с процессами трансляции клеточных мРНК с целью обеспечения первоочередности. Кроме того, имеются механизмы, используемые некоторыми вирусами, которые не свойственны клеточным: 1) «кэп» независимая трансляция; 2) рибосомный сдвиг рамки считывания. Наличие на 5’ конце молекулы мРНК шапочки является необходимым условием трансляции. Началом процесса трансляции является взаимодействие клеточных «кэп»-связываюших белков с мРНК. мРНК затем сканируется комплексом инициации, стартующим в участке кэп. Трансляция начинается со стартового кодона AUG. Однако мРНК некоторых вирусов (полиовирусы, гепатита С) лишены шапочки и используют другой механизм инициации трансляции. 5’ нетранслируемая область РНК полиовирусов является длинной – более 700 нуклеотидов. Последовательности этой области длиной около 400 нуклеотидов c 5’ конца называется внутренним участком (элементом) входа рибосом (ВУВР). Рибосомы связываются с ВУВР и инициируют трансляцию мРНК кэп-независимым способом. У различных вирусов структура этого фрагмента разная, но всегда выявляяется в 5’ нетранслируемой области РНК. У полицистронных мРНК имеются множественные ВУВР. Более того, вирусы способны блокировать кэп-зависимый механизм трансляции клеточных мРНК, разрушая кэп-связывающие белки. Этим же механизмом блокируются и 13 многие защитные противовирусные механизмы организма хозяина, а близкородственные вирусы могут обмениваться этими элементами. Эффективность варьирует между 5-20% (1, 2, 3, 6, 9, 11). Ретровирусы и большинство +РНК вирусов, как и некоторые другие, продуцируют полипротеиновые молекулы благодаря наличию длинной открытой рамки считывания, прерываемой стоп-кодонами. Терминация полипротеина в участке стоп-кодона приводит к синтезу белковых молекул с определенными функциями, образованию длинной молекулы с дополнительными функциями. Для игнорирования стоп-кодонов используются два механизма: 1) считывание стоп- кодона как смыслового, в этом случае, когда верхний (вышележащий) сиквенс некоторых рамок считывания является нижним (нижележащим) сиквенсом других.; 2) сдвиг рамки считывания на рибосомах на +1 или-1 верхнего стоп- кодона. Эффективность сдвига рамки считывания варьирует от 2 до 20% и зависит от вида вирусов. Полипротеиновые молекулы с помощью протеаз вирусов разрушаются на индивидуальные белки, за исключением белков-предшественников. Последние расщепляются ферментами клетки, расположенными в субклеточных компартментах. Некоторые протеазы вирусов разрушают молекулы полипротеинов в «cis»-мономолекулярной реакции (полипротеиновая молекула сама себя расщепляет), другие – в «trans»-бимолекулярном типе реакций (протеазы разрушают молекулы полипротеина другого типа). Серии этих реакций регулируют жизненный цикл вирусов. Вирусы используют три типа протеаз – сериновые (риновирусы), папаин подобные (+РНК вирусов) и металлопротеазы (вирус гепатита С). По своему строению и функции они подобны ферментам животных – химотрипсину, пепсину, ренину, катепсину Д и др. (1, 3, 5, 8, 11). Сборка предшественников вирионов. Важной стадией цикла репродукции вирусов в клетке является сборка компонентов в вирионы и созревание инфекционных частиц. Когда репликация генома вируса и синтез вирусных белков завершены, то интактные вирионы из отдельных компонентов собираются на липидных платформах мембранной сети аппарата Гольджи. Безоболочечные вирусы и нуклеокапсиды оболочечных вирусов образуются путем самосборки из капсомеров в кристалло-подобном стиле. Процесс самосборки вирионов называется морфогенезом. Стабильность вирионов зависит от соотношения отрицательных и положительных зарядов их образующих компонентов. Молекулы ДНК и РНК вирусов обладают сильным отрицательным зарядом. Для успешной сборки вириона заряд необходимо нейтрализовать. С этой целью в вирион включаются положительно заряженные полимеры. ДНК полиомавирусов комплексируется с гистонами клетки, образуя микрохромосомы. Аденовирусы кодируют основной белок, окружающий ДНК-геном. Герпесвирусы с этой целью включают полиамины (70 000 молекул спермидина и 40 000 молекул спермина), нейтрализующие до 40%. Белки нуклеокапсида РНК-вирусов также нейтрализуют до 40% отрицательного заряда вириона. По завершения сборки капсида он заполняется вирусной нуклеиновой кислотой и превращается в зрелый жизнеспособный вирион(1, 2, 5, 8, 11). Выход из клетки. Простые вирусы выходят из клетки путем лизиса. К разрушению клеток приводит ингибиция биосинтеза жизненноважных биомолекул, дезорганизация цитоскелета клетки и изменение структуры мембраны. 14 Лизосомальные протеолитические ферменты повышают ее проницаемость. Развивается структурно-функциональная недостаточность, не позволяющая восполнять потребности клетки богатыми энергией субстратами. В свою очередь нарушаются мембранные процессы-транспорт ионов, питательных веществ, удаление продуктов обмена. Оболочечные вирусы высвобождаются из клетки почкованием. Для клетки это может быть или не быть летальным исходом. Во всех случаях вирусспецифические белки инкорпорируются в липидные рафты мембраны клетки хозяина, замещая некоторые из ее нормальных компонентов, что также ведет к реструктуризации мембраны. Капсид вируса может связываться с вирусспецифическими матриксными белками, выстилающими со стороны цитоплазмы места повреждения мембраны (бляшки). У тогавирусов капсиды напрямую связываются с внутрицитоплазматическими доменами вирусных белков вкрапленных в мембране перикапсида. Вирусы рассматриваются и как биологические наномашины, строительство которых происходит в клетках, сборка динамично регулируется по интенсивности и времени из нескольких молекулярных компонентов – нуклеиновых кислот, белков, липидов (15, 16, 19, 25, 27, 30, 36). Образование дефектных вирионов. Ряд вирусов не могут реплицироваться самостоятельно. Для репликации такие “дефектные” вирусы (дельта вирус гепатита В) нуждаются в вирусе “помощнике”. Дельта инфекция является ко- инфекцией гепатита В и не встречается в его отсутствии, определяет более тяжелое течение болезни (фульминантные формы). Дефектные формы вирусов выявляются и при адено-ассоциированной парвовирусной инфекции. Кроме того, в процессе репликации могут образовываться вирионы, содержащие нестандартные или дефектные геномы. Они, как правило, несколько короче оригинальных геномов, и содержат, по крайней мере, одну делецию и называются дефектными интерферирующими частицами (ДИЧ) (1, 5, 11). Этапы репродукции вирусов в культуре клеток. Репликативный цикл вируса во многом зависит от метаболических процессов клетки. Задача вируса ингибировать их и обеспечить синтез собственных компонентов. Исходом этого является продукция десятков, сотен или тысяч новых вирионов. Потомство вирионов накапливается в питательной среде и инфицируют новые клетки. цикл репродукции некоторых вирусов представлен на рисунке 8. Фаза эклипса начинается после инокуляции определенной дозы вируса в культуру клеток. Часть вирионов утрачивает инфекционность, а часть проникает в клетки, новые частицы не образуются. Затем вирус репродуцируется в клетках, формируя потомство новых частиц. Скорость их накопления в культуре клеток описывается в виде логарифмической фазы. В этот период отмечается увеличение числа вирионов в логарифмической прогрессии (фаза экспансии). Эта фаза завершается по достижении пика количества вирионов в 10,0 мл среды. Клетки при этом начинают стремительно погибать. Как видно из рисунка интервалы времени достижения пика репродукции у разных вирусов существенно варьируют (1, 5, 6). Типы вирусной инфекции клетки. Основные типы вирусной инфекции клетки и, соответственно, механизмы взаимодействия с клеткой представлены в таблице 2. Таблица 2 Типы взаимодействий вирусов с клеткой 15 Цитолитическая продуктивная инфекция наблюдается при высокой интенсивности репродукции вируса в клетке с образованием многочисленного потомства (урожая) и выходе вирионов путем взрыва. Мембрана пораженной клетки при этом не успевает закрыться и клетка разрушается. В культуре клеток это проявляется цитопатическим эффектом, характерным для определенного вируса. Такие культуры клеток называются пермиссивными. Типичными примерами литических инфекций являются полиомиелит и грипп. Нецитолитическая продуктивная инфекция характерна для некоторых вирусов, способных инфицировать клетки продуктивно, но клетки не погибают в результате репликации вируса. При гепатите В гепатоциты остаются жизнеспособными и продолжают продуцировать вирусные частицы с низкой скоростью, отделяясь почкованием. Для развития нелитической продуктивной инфекции значение имеет тип клеток. Ингибиторный эффект репродукции вируса на уровне метаболизма отсутствует, а на мембране клеток могут быть экспрессированы антигены вирусов. Их выявление можно использовать в диагностических целях. Кроме того, экспрессированные на мембране индуцированной клетки антигены (гликопротеины) вируса являются мишенями для гуморальных и клеточных факторов иммунной системы. Этот тип инфекции может привести к формированию “персистентной“ инфекции, при которой клетки и, содержащиеся в них вирусы, сосуществуют в течение длительного периода. |