практики вируса. Вирусологическая лаборатория и правила работы с вируссодержащим материалом

• Название: Вирусологическая лаборатория и правила работы с вируссодержащим материалом
• Дата: 13.01.2021
• Размер: 29.35 Kb.
• Имя файла: практики вируса.docx
• Тип: Документы; #167796

Вирусологическая лаборатория и правила работы с вируссодержащим материалом

Вирусологическую лабораторию (отдел) размещают в благоустро­енном, изолированном от других лабораторий (отделов) помещении или отсеке здания, оснащают необходимыми приборами, оборудова­нием и мебелью.

И помещениях лаборатории поддерживают чистоту, проводят ежед­невную влажную уборку и периодически обрабатывают растворами дезосредств. Для стерилизации боксов и помещений используют уль­трафиолетовые лучи (УФЛ), в качестве источника которых применя­ют бактерицидные лампы (БУВ-15, БУВ-30 и др.).

В составе лаборатории необходимо иметь приемную комнату для приема и регистрации поступающего патматериала, комнату для пред­варительной обработки материала, комнату для вирусологических ис­следований с двумя боксами и предбоксниками, автоклавную, моечную, комнаты для сотрудников лаборатории, гардероб, душевую, виварий для содержания здоровых и зараженных животных. Полы в рабочих комна­тах лаборатории должны быть гладкими, хорошо переносящие воздей­ствие дезосредств, стены облицовывают керамической плиткой или покрывают масляной краской. При входе в лабораторию оборудуют вой­лочный или губчатый резиновый коврик, пропитанный дезраствором.

В приемной размещают столы, обитые оцинкованной жестью или нержавеющим металлом и бак с дезраствором. Здесь доставляемый патматериал (трупы) принимают и регистрируют в журнале.

Комната предварительной обработки материала служит для вскры­тия трупов, осмотра и отбора поступившего патологического материа­ла для исследований. Здесь должен быть бокс с предбоксником, в боксе отбирают пробы, готовят и фиксируют мазки (мазки-отпечатки). В ком­нате необходимо иметь инструментарий для вскрытия и взятия мате­риала, стерильную посуду для материала, сосуды с дезраствором.

В комнате для проведения вирусологических исследований обору­дуют 2 бокса с предбоксниками, в одном боксе готовят культуры тканей и работают со стерильным материалом, другой служит для работы с ви­русологическим материалом (заражение куриных эмбрионов, культур тканей и сбор вируссодержащего материала и т. д.). Стерилизацию по­мещений, боксов и предбоксников проводят с помощью бактерицидных ламп, на столах размещают инструментарий, необходимый для работы, сосуд с дезраствором, газовые или спиртовые горелки. Работа в боксах проводится с соблюдением стерильности. В предбоксниках находятся стерильные халаты, тапочки, марлевые маски, колпачки, которые наде­вают перед входом для работы в бокс. Здесь же находятся кран и рако­вина для мытья рук, дезраствор для рук и полотенце.

В автоклавной проводят стерилизацию посуды, питательных сред и растворов, необходимой аппаратуры и приборов, обезвреживание зараз­ного материала. Здесь должно быть не менее двух автоклавов, в одном стерилизуют чистый материал, в другом обезвреживают и стерилизуют инфицированный материал. Сбор инфицированного материала прово­дят в баки или бюксы.

Моечная предназначена для мытья посуды, аппаратуры и приборов. Здесь необходимо иметь эмалированные ведра, кастрюли, баки для ки­пячения и мытья посуды, ванны. Для сушки мытой посуды используют сушильные шкафы, печи. Мытье посуды, пипеток и инструментов, заг­рязненных инфицированным материалом, проводят только после их сте­рилизации.

Для проведения люминесцентной микроскопии оборудуют специ­альную комнату или рабочее место и оснащают люминесцентными мик­роскопами (серии ЛЮМАМ) или люминесцентными устройствами.

В лаборатории должно быть в достаточном количестве стеклянной и эмалированной посуды (пробирки, матрацы, колбы, пипетки, мен­зурки, флаконы, мерные стаканы, цилиндры и т. д., баки, ведра, тазы, ванны, кастрюли и т. д.). Вирусологические лаборатории оснащают не­обходимыми приборами, аппаратурой и оборудованием (столы, шка­фы для инструментария и посуды, термостаты, холодильники бытовые и низкотемпературные, центрифуги, электромагнитные мешалки, весы, овоскопы, фильтры, водяные бани, микроскопы обычные и люминес­центные, дистилляторы и бидистилляторы, сушильные шкафы и т. д.).

В виварии должны быть комнаты для здоровых и комнаты для экс­периментально зараженных лабораторных животных с отдельным ин­вентарем и спецодеждой. Животных содержат в клетках. Чистку кле­ток и вивария проводят ежедневно. В виварии необходимо иметь дезоковрики и дезраствор для обработки рук, кран с водой.

Сотрудники вирусологической лаборатории обязаны соблюдать следующие правила работы:

1. 
   Выполнять работы только в специальной одежде - халат, шапоч­ка (колпачок), марлевая маска па рот и нос (респиратор). При работе с особо опасным материалом кроме того используют резиновые пер­чатки, защитные очки, резиновый фартук. Для работы в боксе исполь­зую! стерильную спецодежду, обязательно меняют обувь.
   
2. 
   Запрещается выходить за пределы лаборатории в халатах или надевать верхнюю одежду на халат.
   
3. 
   В лаборатории запрещается курить или принимать пищу, ходить и разговаривать во время работы.
   

Весь поступивший в лабораторию на исследование материал дол­жен рассматриваться как инфицированный и работать с ним следует осторожно, с соблюдением стерильности и мер профилактики.

5. Инфицированный материал, инструменты и посуда подлежат обязательному обезвреживанию - стерилизации по возможности в тот же день. Трупы экспериментально зараженных животных и продукты их выделения обезвреживают сжиганием или автоклавированием. Ра­боту с инфицированным материалом проводят с наличием на рабочем месте дезраствора.

6. По окончании работы рабочее место убирают, дезинфицируют и приводят в порядок. Комнату подвергают обработке бактерицидными лампами до начала и после окончания работы. Руки тщательно моют с мылом и обрабатывают 70° спиртом.

Диагностика вирусных болезней

Диагностика вирусных болезней принципиально мало чем отлича­ется от диагностики бактериальных инфекций, т. е. она тоже прово­дится комплексно с применением различных методов. Однако при ди­агностике вирусных болезней есть и некоторые особенности. Так, при­меняют специальные серологические реакции - преципитации в ага­ровом геле, реакция задержки гемагглютинации и гемадсорбции и др., а также специальные методы выделения вирусов культуры тканей и куриные эмбрионы.

В комплексную диагностику при вирусных заболеваниях включаются:

1. 
   Эпизоотологический метод, при котором учитывают данные о заболеваемости, сезонности, наличие данного заболевания в предше­ствующие годы, о массовых прививках скота и его перегруппировках, о предшествующих контактах животных с источником инфекции, на­личии в данной местности переносчиков возбудителя (дикие живот­ные, насекомые, грызуны) и т. д.
   
2. 
   Клинический метод, позволяющий ставить предварительный ди­агноз на основании типичных признаков болезни. Однако, не во всех случаях можно наблюдать четко выраженные клинические признаки, иногда болезнь может протекать скрытно (лейкоз, инфекционная ане­мия, плазмоцитоз и др.). При ряде вирусных болезней клинические признаки могут быть сходными, что не позволяет правильно поста­вить диагноз. Клинический метод диагностики нередко дополняют гематологическими исследованиями и особенно это ценно при диаг­ностике лейкоза и инфекционной анемии.
   
3. 
   Патологоанатомический метод, при котором учитывают резуль­таты вскрытия павших животных, т. е. наличие наиболее характерных изменений в органах или тканях. Результаты вскрытия нередко допол­няют данными гистологического исследования материалов.
   
4. 
   Лабораторные методы диагностики. Лабораторную диагнос­тику при вирусных болезнях проводят независимо от точности по­ставленного предварительного диагноза. Особенно велико значение лабораторных методов диагностики тогда, когда заболевание про­текает атипично, скрытно или как смешанная инфекция.
   

На основании лабораторных методов диагностики ставят оконча­тельный диагноз. При проведении лабораторной диагностики пресле­дуют три цели:

а)              обнаружить вирус в исследуемом патологическом материале, обычно путем выявления телец-включений или элементарных телец, с помощью микроскопии мазков или мазков-отпечатков в обычном све­товом или люминесцентном микроскопах. Иногда для этих целей при­меняют электронную микроскопию;

б)             выделить вирусы из патологического материала путем зараже­ния чувствительных лабораторных животных, развивающихся кури­мых эмбрионов и культур тканей. При необходимости проводят не менее трех пассажей;

в)              идентифицировать выделенные вирусы путем постановки раз­личных серологических реакций (РСК, РДП, РНГА, реакция нейтра­лизации вируса и др.) с использованием в них стандартных (биофаб­ричных) специфических или типоспецифических иммунных сывороток. Постановкой этих же серологических реакций можно исследовать при­сылаемые из хозяйств сыворотки крови животных на наличие в них антител, но для этого в лаборатории нужно иметь стандартные (био­фабричные) антигены - диагностикумы.

Лабораторные методы диагностики вирусных болезней

Современные методы лабораторной диагностики такие, как выде­лите вирусов на культурах тканей и на куриных эмбрионах, биопро­ба на лабораторных животных, люминесцентная и электронная мик­роскопии, методы иммуноферментного анализа, постановка различ­ных серологических реакций (с учетом всех других методов диагностики) позволяют точно поставить диагноз при большинстве вирусных заболеваний животных.

Лабораторные методы диагностики вирусных болезней включают:


 

I. Вирусологический метод

(вируссодержащий материал на наличие вируса) Схема исследований:

1. 
   Обнаружение вируса
   

1)                  микроскопией мазков (лучше отпе­чатков) на тельца-включения (ТВ)

а)        обычная

б)        люминесцентная

-                   метод флуорохромирования (МФ)

-                   методы флуоресцирующих антител (МФА)

в)        электронная

2)                  индикация вирусов - РГА, РГАд

1. 
   Выделение вируса заражением чув- твчтелтых 0-5 пассажей)'.
   

а)        лаб. животных, животных

б)        куриных эмбрионов (КЭ)

в)        культур тканей (КТ)

И

децщифищцин вируса (опредш- ние вида), типизация (определение тццд, варианта) и дифференциации*

Постановкой серологических реакций с известными биофабричны­ми диагностическими иммунными сыворотками.

II. Серологический метод

(испытуемые сыворотки на наличие

антител -Am), постановка реакций с известными био­фабричными вирусными антигенами

РН (на лаб. жив., на КЭ и на КТ) РСК

РИД(РИД) РИЭОФ МФА ИФА

РЗГА(РТГА)

РИГА

РЗГАд


 

Взятие патологического материала для лабораторной диагностики и его подготовка

При взятии вируссодержащего патологического материала большое значение имеет правильность выбора материала и его свежесть. Виру­сы очень чувствительны к нагреванию и гниению. Поэтому материал нужно брать от свежих трупов (не позже 12 часов после гибели), а еще лучше от забитых клинически больных животных. При выборе мате­риала учитывают тропизм вирусов и клиническое проявление бо­лезни, вид и возраст животного, стадию течения болезни, наличие видимых изменений в органах и тканях и т. д.

При жизни животного в качестве вируссодержащего материала мо­жет служить: афты и их содержимое (ящур), пустулы (оспа), истече­ния из носа и глаз (инфекционные заболевания и др.), слизь и смывы со слизистых, моча (чума свиней и др.), фекальные массы (при вирус-

ных энтеритах), кровь и лимфа (при пантропных инфекциях), кусочки органов, взятые биопсией, и т. д. Посмертно кроме указанных материа­лов можно брать кусочки паренхиматозных и других органов (печень, селезенка, почки, мозг, лимфоузлы и др.). Трупы мелких животных направляют обычно целиком.

Берут материал по возможности стерильно с помощью стерильно­го инструмента и в стерильную посуду. Если лаборатория рядом, ма­териал отправляют неконсервированным и обычно в термосах со льдом. Если же материал нужно транспортировать далеко, то его обычно кон­сервируют и тщательно упаковывают (особенно, если отправляют по почте или самолетом). Кусочки органов консервируют в 50% стериль­ном глицерине или насыщенном растворе хлористого натра и допол­нительно помещают в термос со льдом. Жидкий материал консерви­руют замораживанием и сохраняют при -20° С (в термосе с сухим льдом). Пересылка материала сопровождается направлением, в кото­ром сообщаются эпизоотологические и клинические данные, картина патологоанатомических изменений.

Присланный в лабораторию материал принимают и, по возможно­сти, сразу же начинают исследовать, а, если это невозможно, то мате­риал хранят до исследования в холодильнике при -20° С (в морозил­ке). Подготовка материала к вирусологическим исследованиям заклю­чается в следующем. После осмотра органов и тканей, если материал был консервирован, их отмывают стерильным физраствором от кон­серванта. Если труп поступил целый, его осматривают и затем прово­дят вскрытие, измененные органы тщательно осматривают и извлека­ют в стерильные баночки или чашки Петри. При бешенстве часто по­ступает голова трупа, которую также сначала осматривают, а затем вскрывают и извлекают мозг. Жидкий материал проверяют на бакте­риальную загрязненность микроскопией мазков и посевом на среды (МГ1Б, МПА, среду Китт-Тароцци и среду Сабуро) и при необходи­мости обрабатывают антибиотиками (пенициллин и стрептомицин по 500-2000 ЕД на мл среды в зависимости от степени загрязненности).

Из кусочков органов готовят суспензию. Для этого из присланных органов и тканей берут небольшие кусочки (1.0-1.5 г) и помещают в стерильную ступку, где после измельчения ножницами тщательно ра­стирают до кашицеобразной массы со стерильным песком или стек­лом. !1атем добавляют стерильный физраствор в соотношении 1:10 или 1:5 и получается суспензия. Ее переносят в центрифужные пробирки и туда же вносят вышеуказанные антибиотики в дозе 500-2000 ЕД на 1 мл суспензии. Суспензию в пробирках 2-3 раза замораживают (при -20°-50°С) и отстаивают при комнатной температуре или в термостате при 37° С. При этом происходит дополнительное разрушение клеток и освобождение вируса. Затем пробирки с суспензией центрифугируют 15-20 минут при 3000 оборотов в минуту. Надосадочную жидкость про­веряют на стерильность посевом на среды в аэробные и анаэробные условия и затем используют как вируссодержащий материал для за­ражения лабораторных животных, куриных эмбрионов и культур тка­ней и для постановки серологических реакций в качестве антигена. Од­новременно из исходного патологического материала готовят мазки или мазки-отпечатки, которые исследуют на наличие телец-включе­ний и вируса в клетках после специальной окраски под обычным мик­роскопом или применяют люминесцентную микроскопию с исполь­зованием иммунофлуоресценции (флуоресцирующие антитела). При необходимости можно из органов готовить гистосрезы и исследовать их гистологически (например, при бешенстве).

Обычная микроскопия

При некоторых вирусных болезнях в пораженных клетках обнаруживают сравнительно крупные образования, специфические для каждой инфекции, получившие название телец-включений. В одной клетке их количество может быть от 1 до 6.  Они имеют разную форму (круглые, овальные, квадратные, треугольные и т.д.); отличаются размерами (колеблются от 1 до 20 мкм). Их можно увидеть в световом микроскопе в препаратах окрашенных специальными методами. По локализации в клетке они могут быть внутриядерные или цитоплазматические; по составу нуклеиновой кислоты - ДНК, или РНК-содержащие; по тинкториальным свойствам – базофильные или оксифильные; по гомогенности - аморфные, зернистые и т.д.

В настоящее время хорошо изучены тельца Бабеша-Негри - при бешенстве,  тельца Боллингера при оспе птиц, тельца Пашена при оспе овец, тельца Лентца - при чуме плотоядных, тельца Руборта - при инфекционном гепатите плотоядных,  тельца Зейфрида -  при инфекционном ларинготрахеите птиц и др.  Поскольку их количество, расположение и форма  строго спецефичны для каждого возбудителя, то их обнаружение имеет большое диагностическое значение.

Природа включений разнообразна. Включения представляют собой «вирусные фабрики», т. е. очаги, в которых идет транкрипция и репликация вирус­ных геномов и сборка вирусных частиц (скопление вирусных частиц, либо скопление молекул вирусных белков, либо продукты дегенерации клетки).

Существуют разные способы окраски для выявления телец-включений -  по методу Романовского, по Муромцеву, по Михину, по Селлерсу, по Борману, по Манну, метод серебрения по Морозову и др.

Для микроскопии из патологического ма­териала готовят мазки, мазки-отпечатки, гистосрезы. Мазки и мазки-отпечатки фиксируют на пламени или химическим методом (в метиловом спирте, смеси этилового спирта с эфиром поровну, химически чистым ацетоном). При бешенстве мазки-отпечатки и гистологические срезы делают из головного мозга (аммоновы рога, мозжечок, продолговатый мозг) и из слюнных желез.

Окраска по Муромцеву.  (чаще применяют для обнаружения телец-включений Бабеша-Негри при бешенстве).

Влажные мазки или мазки-отпечатки фиксируют в этиловом или метиловом спирте, или в смеси спирта пополам с эфиром, или ацетоном (химически чистым)  (сосуд с фиксатором должен быть хорошо закрыт, чтобы фиксирующая жидкость не испарялась). После фиксации мазок промывают дистиллированной водой и погружают на 5-10 минут в раствор краски Мансона разбавленной дистиллированной водой 1:40 (краска Мансона: 5 г буры и 2 г кристаллической метиленовой сини растворяют в 100 мл дистиллированной воды). Затем краску сливают, а мазки погружают в 10 % водный раствор танина на 8—10 минут до появления голубоватой окраски. После этого мазки промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой, проводят через смесь из равных частей спирта с ацетоном (химически чистым) или спирта с ксилолом и высушивают фильтровальной бумагой. Заливают в канадский бальзам. Окрашенный мазок должен иметь светло-голубой фон, ядра нервных клеток синего цвета, а тельца Бабеша—Негри — бледно-фиолетовые с темными включениями.

Окраска по Михину.Мазки или мазки-отпечатки фиксируют в смеси спирта и эфира (поровну) в течение 5—10 минут, высушивают фильтровальной бумагой и окрашивают в течение 30-40 минут краской Гимза, разведенной 1:10 (1-2 капли на 1 мл дистиллированной воды), быстро промывают подкисленным спиртом (1 капля ледяной уксусной кислоты на 30 мл 96° спирта), а затем водой, просушивают фильтровальной бумагой и смотрят под микроскопом.

В окрашенном препарате основной фон должен быть красным с фиолетовым оттенком. Пирамидальные нервные клетки синеватые, ядро клеток интенсивно черное, а тельца Бабеша—Негри — розово-красные с точечными включениями темно-синего цвета.

Окраска по Романовскому. Мазки-отпечатки высушивают на воздухе, фиксируют 3-5 мин. метиловым спиртом или 10-15 мин. в смеси эфира со спиртом (1:1). Затем погружают в раствор краски Романовского (1 каплю основного раствора краски смешивают с 1 мл дистиллированной воды). Окрашивание проводят в специальных ванночках или чашках Петри методом подливания краски под препарат, красят 30-40 минут, затем мазок промывают, высушивают фильтровальной бумагой, ополаскивают спиртом, снова промывают и высушивают. При микроскопии на голубом фоне препарата элементарные тельца Пашена будут красные, а тельца-включения - темно-фиолетовые.

Люминесцентная микроскопия: методы флуорохромирования и метод флуоресцирующих антител. Электронная микроскопия.

ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ (ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ) МИКРОСКОПИЯ (ЯМ, ФМ)

Среди новейших способов диагностики бактериальных и вирусных заболеваний особое место занимает люминесцентная (флуоресцент­ная) микроскопия. Повышенная чувствительность, цветное изображе­ние на темном нефлуоресцирующем фоне, возможность обнаружения телец-включений, некоторых крупных вирусов и риккетсий, простота и надежность - ценные качества этого вида микроскопии.

Особое значение люминесцентная микроскопия имеет при ускорен­ной диагностике инфекционных заболеваний, при ускоренной инди­кации возбудителя во внешней среде.

Результаты люминесцентной микроскопии являются довольно спе­цифичными и высокоточными. По данным ряда авторов этот метод не уступает по показаниям данным биопробы и другим методам, однако для люминесцентной микроскопии нужно иметь высококачественные специфические флуоресцирующие сыворотки или иммуноглобулины. Люминесцентная микроскопия в последние годы находит все большее применение и является одним из главных методов при диагностике многих вирусных болезней.

В люминесцентной микроскопии используется явление фотолюми­несценции, т. е. способность объекта светиться (издавать свечение) в момент облучения его ультрафиолетовыми лучами. Источниками та­ких лучей в люминесцентном микроскопе являются ргутно-кварцевые лампы. Для проведения микроскопии в настоящее время выпускаются люминесцентные микроскопы серии ЛЮМАМ, а также люминесцент­ные устройства, которые монтируются на обычный световой микроскоп, такие как ОИ-28 и другие. Результаты, получаемые при работе с лю­минесцентными устройствами, лишь незначительно уступают резуль­татам, получаемым при работе со специальными люминесцентными микроскопами. Как микроскопы люминесцентные, так и устройства должны быть хорошо настроены, комнату для работы затемняют. Для иммерсионной микроскопии при люминесцентном исследовании ис­пользуют специальное нефлуоресцирующее масло, заменители его (ди- метилфтолат ДЭТА) или просто дистиллированную воду при водной иммерсии. Настройку микроскопа или устройства проводят согласно прилагаемой к ним инструкции.

Объекты, рассматриваемые при люминесцентной микроскопии, мо­гут давать собственную люминесценцию (аутолюминесценция), как, например, грибки микроспории, и такие объекты смотрят без всякой дополнительной окраски. Однако большинство патогенных микроор­ганизмов и вирусы аутолюминесценцией не обладают, а поэтому маз­ки надо обрабатывать либо специальными красками (флуорохромы), либо мечеными (флуоресцирующими) антителами. В связи с этим все методы обработки мазков для люминесцентной микроскопии можно разделить на две группы:

1. 
   Метод флуорохромирования (МФ).
   
2. 
   Методы флуоресцирующих антител (МФА) или иммунофлуо- ресценция (ИФ).
   

а) Метод флуорохромирования. По своей технике этот метод принципиально почти ничем не отличается от методов обычной ок­раски мазков, применяемых при световой обычной микроскопии. Для этих целей используют также анилиновые красители, но краски берут такие, которые обладают явлением фотолюминесценции, т.е. светятся в момент облучения их ультрафиолетовыми лучами. Такие краски на­зываются флуорохромами, а окраска ими - метод флуорохромирования. К флуорохромам относят такие красители как акридин оранжевый и желтый, аурамин, корифосфин, родамин, трипафлавин, риванол, флуо- ресцеина изотиоцианат (ФИТЦ) и другие. Продается специальный набор - «Набор красителей для флуоресцентной микроскопии», со­держащий 20 красителей. Растворяют флуорохромы в дистиллирован­ной воде (или буфере), к некоторым из них добавляют фенол до 5%. Разведения для большинства красителей обычно готовят 1:1000 (ак­ридин желтый 1:500, акридин оранжевый, родамин и корифосфин 1:10.000). Наибольший интерес здесь представляет акридин оранже­вый, который окрашивает ДНК в ярко светящийся желто-зеленый цвет, а РНК в оранжево-красный. Для исследований можно готовить мазки из патматериала, мазки-отпечатки, гистосрезы, зараженные культуры ткани, выращенные на покровных стеклах. Чтобы различить проис­хождение ДНК или РНК (клеточное или вирусное) препараты (маз­ки, мазки-отпечатки) обрабатывают 0,5%-ным раствором ДНК-азы или PIIK-азы в течение 5-10 минут. При этом свечение клеточных ДНК или РНК сразу же исчезает, а вирусные ДНК или РНК продолжают светиться еще 20-30 минут. Это служит доказательством специфично­сти вирусных нуклеиновых кислот.

Метод флуорохромирования широко применяется при диагности­ки бактериальных болезней и для этого имеются разработанные ВИЭВ рекомендации для окрашивания различных микробов и спор.

б) Методы флуоресцирующих антител (МФА), иммунофлуо- ресценция (ИФ). МФА (ИФ) основаны на принципе специфическо­го взаимодействия антигена со специфическими антителами, но ис­пользуют здесь антитела меченые, т.е. предварительно окрашенные флуорохромом, и поэтому такие антитела под ультрафиолетовыми лучами светятся (флуоресцирующие антитела). Наиболее часто для окрашивания антител применяют ФИТЦ, эта краска дает антителам салатно-зеленое свечение. Поэтому, если в мазке есть антиген специ­фический данным антителам, то антитела, оседая и связываясь с дан­ным антигеном, будут обеспечивать образовавшемуся комплексу свечение салатно-зеленым цветом. Следовательно, здесь свечение ан­тигена происходит не за счет окрашивания его, а за счет связавшихся с антигеном специфических окрашенных антител. Таким образом, все МФА являются по своей сущности разновидностью серологических реакций, но ставятся они не в пробирках, а на предметном стекле (в мазках) и используются флуоресцирующие антитела. В настоящее вре­мя налажено производство флуоресцирующих иммунных сывороток и гамма-глобулинов централизованным путем. Выпускаются они в сухом виде в ампулах с приложением на каждую упаковку инструк­ции по применению с указанием титра антител. Растворяют их для использования по мере надобности согласно инструкции, хранят в хо­лодильниках при +4° С. Некоторые флуоресцирующие сыворотки вы­пускают в жидком виде.

МФА находят широкое применение при диагностике многих ви­русных болезней - бешенство, грипп, болезнь Аусеки, вирусный гепа­тит плотоядных и чума, оспа, ИРТ, ИЛТ и многие др.

Все методы флуоресцирующих антител можно разделить на 2 раз­новидности:

1. 
   Прямой МФА (предложен Кунсом и Капланом, 1942, 1950 гг.).
   
2. 
   Непрямые МФА:
   

а) с использованием антивидовой флуоресцирующей сыворотки или иммуноглобулина (метод Уэллера и Кунса, 1954 г.) ;

б) с использованием антикомплементарной флуоресцирующей сы­воротки или иммуноглобулина (метод Гольдвассера-Шепарда, 1858 г.).

Прямой МФА. Этот метод технически наиболее прост и более специфичен по результативности и поэтому более широко применя­ется в практической работе.

Сущность и техника прямого МФА заключатся в том, что на пред­метное стекло с фиксированным на нем м^шГ(или мазком-отпечат­ком) из вируссодержащего материала наносят небольшое количество (2-3 капли) специфической подозреваемому антигену (вирусу) флуо­ресцирующей иммунной сыворотки, или иммуноглобулина, в рабочем титре и выдерживают во влажной камере (в чашке Петри с кусочком ваты, смоченной водой) в термостате в течение 30-40 минут при 36-37° С, а затем промывают буферным солевым раствором и дистил­лированной водой, высушивают на воздухе и просматривают под им­мерсионной системой в люминесцентном микроскопе. Если антиген и антитела специфичны, образуется комплекс «антиген + антитело», ко­торый не смывается при промывании мазка и при микроскопии пре­парата будет отчетливо видно яркое салатно-зеленое свечение антиге­на за счет адсорбированных на нем флуоресцирующих антител. Если же антитела были неспецифичны антигену, находящемуся в мазке, или антигена в мазке вообще не оыло (от здоровых животных), то свече­ния антигена не будет и поле зрения будет темным потому, что анти­тела не связались с фиксированным мазком и смылись при промыва­нии мазка. Предметные стекла для МФА должны быть тонкие, чистые и хорошо обезжиренные. Мазки и мазки-отпечатки нужно готовить тонкие, высушивают мазки на воздухе и фиксируют химическим спо­собом (ацетон, метиловый спирт, спирт + эфир), можно фиксировать пламенем. В мазках-отпечатках при вирусных инфекциях наблюдают свечение при просмотре в ядрах или цитоплазме пораженных виру­сом клетках в виде различных гранул и телец-включений, а если клет­ка поражена вся и антиген содержится как в ядре, так и в цитоплазме, может светиться вся клетка. Непораженные вирусом клетки обычно не светятся и создают темный фон.

К недостаткам прямого метода следует отнести то, что при этом ме­тоде в лаборатории на каждое вирусное заболевание нужно иметь спе­цифическую флуоресцирующую сыворотку или глобулины, а они пока еще сравнительно дорогие и имеют небольшой срок хранения.

Непрямые МФА называются так потому, что флуоресцирую­щие антитела адсорбируются не на сам вирусный антиген, а на посред­ника, в качестве которого может быть специфическое вирусному ан­тигену неокрашенное антитело (при антивидовом методе) или комп­лемент (при антикомплементарном методе). Непрямые МФА связа­ны с обработкой мазка в два этапа: вначале наносят специфическую вирусному антигену нефлуоресцирующую сыворотку (при антикомп­лементарном методе и комплементе одновременно) и контактируют 30-40 минут во влажной камере при 37° С, затем промывают буфером и водой (или просто водой ) и наносят флуоресцирующую сыворотку специфичную противовирусным неокрашенным антителам (при ан­тивидовом методе) или комплементу (при антикомплементарном ме­тоде), опять контактируют 30-40 минут во влажной камере в условиях термостата, промывают, высушивают на воздухе и смотрят под люми­несцентным микроскопом.

Непрямой МФА с использованием антииилоной флуорес­цирующей сыворотки» На фиксированный мазок или отпечаток на­носят специфическую предполагаемому в мазке антигену (вирусу) им­мунную неокрашенную сыворотку или иммуноглобулин, и выдержи­вают во влажной камере или термостате при 37°С 30-40 минут, затем промывают буферным раствором и водой. Если в мазке имеется анти­ген специфичный антителам сыворотки, образуется комплекс «анти­ген + антитело» (Аг + Ат), который не смывается при промывании мазка, но и не светится в люминесцентном микроскопе. Поэтому ма­зок дополнительно обрабатывают флуоресцирующей антивидовой сы­вороткой или глобулином (антивидовую сыворотку или глобулин получают путем гипериммунизации кроликов или другие виды животных сывороткой или глобулинами того вида животных, на кото­рых получают специфическую для вируса гипериммунную нефлуо­ресцирующую сыворотку и такую антивидовую сыворотку обрабатывают флуорохромом, обычно ФИТЦ). Антивидовую флуоресцирующую сыворотку наносят на мазок и выдерживают во влажной камере при 37° С 30-40 минут, затем промывают водой или буфером и водой, высу­шивают на воздухе и смотрят. Антитела из флуоресцирующей анти­видовой сыворотки, если они специфичны глобулинам неокрашенной иммунной противовирусной сыворотки, адсорбируются на комплек­се Аг + Ат и образуется новый комплекс «Аг (вируса) + Ат противо­вирусной неокрашенной сыворотки (они же являются Аг для антиви­довой сыворотки) + Ат (флуоресцирующие) антивидовой сыворотки».

При просмотре под люминесцентным микроскопом образовавшийся комплекс будет светиться ярко салатно-зеленым цветом за счет флуо­ресцирующих антител антивидовой сыворотки.

Если же в первом этапе обработки компоненты были неспецифич­ны или не было в мазке антигена, комплекс «Аг + Ат» не образуется и антивидовые флуоресцирующие антитела не свяжутся, при промыва­нии мазка смоются с него и поэтому свечения не будет.

Непрямой МФА с использованием антикомплементарной флуоресцирующей сыворотки. Этот метод по своей сущности и технике является разновидностью РСК, но ставится реакция на пред­метном стекле и вместо гемолитической системы используют флуо­ресцирующую антикомплементарную сыворотку. Получают антиком­плементарную сыворотку путем гипериммунизации кроликов натив- ной свежей сывороткой морской свинки (комплемент) и у кролика образуются антикомплементарные антитела, которые будут специ­фичны белкам сыворотки крови морской свинки (комплементу) и в реакцию будут вступать только с сывороткой крови морской свинки, которая является комплементом в РСК. Такую антикомплементарную сыворотку обрабатывают флуорохромом ФИТЦ-ем и получает­ся флуоресцирующая сыворотка.

На приготовленный и фиксированный мазок вначале наносят спе­цифическую предполагаемому в мазке антигену (вирусу) нефлуорес- цирующую иммунную сыворотку и комплемент в рабочих титрах, кон­тактируют в термостате при 37° С во влажной камере 30-40 минут (про­ходит реакция в баксистеме), а затем промывают водой. В случае, если, как и в пробирочной РСК, антиген в мазке будет специфичен нанесен­ным антителам, образуется комплекс «Аг вируса + Ат», на который адсорбируется комплемент и весь этот комплекс «Аг вируса + Ат им­мунной неокрашенной сыворотки + комплемент» не смоется, но све­чения под люминесцентным микроскопом не будет. Чтобы обнаружить этот комплекс, на мазок дополнительно затем наносят антикомпле­ментарную флуоресцирующую сыворотку и вновь контактируют во влажной камере термостата 30-40 минут, после чего промывают, высушивают на воздухе и смотрят под люминесцентным микро­скопом. Флуоресцирующие антитела из антикомплементарной сы­воротки адсорбируются на комплексе и весь вновь образовавшийся комплекс «Аг вируса + Ат специфической неокрашенной противови­русной сыворотки + комплемент + антикомплементарное Ат» в резуль­тате будет ярко светиться салатно-зеленым цветом. Преимуществом данного метода является то, что при этом методе для диагностики на любое бактериальное или вирусное заболевание достаточно иметь в лаборатории лишь одну антикомплементарную флуоресцирующую сыворотку и наборы специфических гипериммунных неокрашенных сывороток.