Апоптоз.. Внутриклеточный апоптоз
 Скачать 31.24 Kb.
|
|
Внутриклеточный апоптоз На современном этапе развития биологической науки клетки рассматривается не только с точки зрения оценки той или иной их функции, но и с точки зрения их жизненного цикла. Жизненный цикл клеток включает в себя: процессы пролиферации, последующей дифференцировки и заканчивается их гибелью, в том числе и путем апоптоза. Апоптоз – это запрограммированная клеточная гибель. Данный термин был предложен группой английских ученых под руководством Джона Керра в 1972 году для описания процесса гибели лимфоцитов под действием глюкокорти- коидов [35]. В дословном переводе он означает «опадание листьев» или «отделение лепестков от цветка», что, применительно к клетке, рассматривается как образование апоптотических телец, формирующихся на терминальных стадиях клеточной гибели. Следует также отметить, что в 2002 году Нобелевской премии по физиологии или медицине были удостоены Сидней Бреннер, Джон Э. Салстон и Роберт Г. Хорвиц за «открытие принципов генетического регулирования развития органов и запрограммированного отмирания клеток». Однако, несмотря на столь долгую исто- рию исследований, интерес к механизмам ин- дукции и регуляции процесса программируемой клеточной гибели не ослабевает. Причиной тому служит важнейшая роль этого процесса в раз- личных аспектах функционирования многокле- точных организмов [21]. Помимо элиминации измененных – поврежденных, дефектных, му- тантных или инфицированных клеток, посред- ством апоптоза реализуются процессы дифференцировки и морфогенеза при формировании тканей и органов. Кроме того, осуществляется поддержание клеточного гомеостаза уже сфор- мированного организма, также как и его защита от патогенов при реализации защитных реакций [65]. Следует отметить, что апоптоз, как программируемая клеточная гибель, характерен для всех эукариот, начиная от одноклеточных простейших и заканчивая высшими многоклеточными животными [3, 29, 36]. Среди морфологических изменений, имеющих место в апоптотозирующей клетке, большинство исследователей выделяет следующие [66, 72, 73]: – изменение формы клетки, обычно, клетка приобретает шарообразную форму; – потеря поверхностных структур – микровиллей, псевдоподий и т.д.; – изменение объема клетки (в зависимости от фазы апоптоза); – конденсация хроматина в ядре и диссоциация ядрышек; – фрагментация ядра, конденсация цитоплазмы и формирование «апоптотических» телец на поздних стадиях апоптоза для облегчения фагоцитоза и т.д.; Механизм апоптоза Несмотря на разнообразие инициирующих факторов, выделяются два основных пути трансдукции (передачи) сигнала апоптоза: рецептор-зависимый (рецепторный) сигнальный путь с участием рецепторов гибели клетки (внеклеточная инициация) и митохондриальный путь (внутриклеточный механизм). У большинства эукариот в развитии апоптоза традиционно выделяют 4 стадии - инициация, программирование, реализации программы, удаление погибшей клетки. 1 стадия – стадия инициации (индукции). В зависимости от происхождения сигнала, стимулирующего апоптоз, различают:
2 стадия – стадия программирования (контроля и интеграции механизмов апоптоза). Для этой стадии характерно два, диаметрально противоположных процесса, наблюдающихся после инициации. Происходит либо:
На рис. 14 представлена примерная схема каспазного принципа активации каспаз. Видно, что откуда бы не запускался каскад, его узловым моментом является каспаза 3. Она активируется и каспазой 8 и 9. Всего в семействе каспаз – более 10 ферментов. Локализуются в цитоплазме клетки в неактивном состоянии (прокаспазы). Положение всех каспаз в данном каскаде до конца не выяснено, поэтому на схеме ряд из них отсутствует. Как только активируются каспазы 3,7,6 (возможно и их другие типы) наступает 3 стадия апоптоза.
Выше уже упоминалось о том, что апоптоз индуцируется в клетках, имеющих нерепарированное повреждение ДНК. В этом случае уничтожение клетки предупреждает появление клонов клеток-мутантов, существование которых может привести к весьма тяжелым последствиям (например, к развитию злокачественной опухоли). Рис. 1. Механизм апоптоза, индуцированного внутриклеточными факторами Нерепарированное повреждение ДНК (Рис. 1) приводит к активации двух генов: р21 и р53. Выработка белка р21 одноименным геном обеспечивает блокаду митотического цикла (клетка-мутант не должна производить себе подобные клетки-уроды). Напомним, что клеточный (митотический) цикл начинается с фазы G1 – подготовки к синтезу ДНК. За ней следуют фазы S – фаза синтеза ДНК и фаза G2 – постсинтетическая. Завершается цикл митозом клетки. Весьма важными являются и еще два момента в жизни клетки, вошедшей в митотический цикл. Это так называемые «контрольные пункты» (checkpoints): на границе фазы G1/S и на границе фазы G2/митоз. На уровне контрольных пунктов проверяется целостность ДНК, отсутствие ее мутаций и делеций. У клеток, имеющих поврежденную ДНК, клеточный цикл блокируется, и клетка вступает в стадию апоптоза. Активация гена р53 и синтез одноименного белка запускает механизм апоптоза. При этом белок р53 с одной стороны блокирует антиапоптозные механизмы белка Bcl-2, встроенного в мембраны митохондрий, а с другой – обеспечивает раскрытию пор митохондрий и выход в протоплазму клетки веществ, являющихся активаторами внутриклеточных протеаз - так называемых «казнящих каспаз» (более подробно о митохондриальном механизме апоптоза и о роли каспаз в этом процессе будет рассказано в дальнейшем). Активные каспазы вызывают протеолиз ядерных белков, активируют эндонуклеазы и обеспечивают протеолиз цитоплазматических белков. В конечном итоге это приводит к фрагментации ядра клетки, фрагментации цитоплазмы и образованию апоптозных телец. Апоптоз завершен. Каспазы. Каспазный каскад Цистеиновые протеазы – каспазы (в настоящее время описано до 10 видов этих ферментов) находятся в протоплазме клеток в неактивном состоянии (в виде прокаспаз). Каспазы способны активировать друг друга, образуя разветвленный протеолитический каскад (Рис. 2). В активации прокаспаз могут участвовать и некоторые другие вещества, например, цитохром С, содержащийся в митохондриях. В конечном итоге каспазы обеспечивают фрагментацию ядра и цитоплазмы клетки, то есть являются исполнителями уничтожения клетки, за что и получили название «казнящих каспаз». Рис. 2. Каспазный каскад Суммируя, можно описать два основных механизма активации прокаспаз. Первый из них реализуется в случае уже описанного нерепарированного повреждения ДНК. В этом случае активация митохондриального механизма апоптоза (подробнее – см. в следующем разделе лекции) приводит к выходу из митохондрий цитохрома С и протеазы AIF (Apoptosis Inducing Factor). Оба эти вещества участвуют в активации прокаспазы 9, которая, в свою очередь, обеспечивает активацию основной «казнящей каспазы» 3, а также каспаз 6 и 7. Активные «казнящие каспазы» завершают процесс апоптоза. Второй путь активации каспазного каскада связан с реализацией «инструктивного механизма апоптоза» (подробнее см. в последующих разделах лекции). Возбуждение «рецепторов смерти» клетки, реализуемое при посредстве адаптерных белков, приводит к активации прокаспазы 8, которая, в свою очередь, является активатором «казнящих каспаз» 3, 6 и 7.
Существуют несколько механизмов участия митохондрий в реализации клеточной гибели. Интересно то, что все они включаются как механизмы программированной клеточной смерти, но одни из них являются истинным апоптозом, а другие могут завершаться некробиозом и некрозом клетки (Рис. 3). Рис. 3. Митохондриальный механизм апоптоза и некроза клетки Запуск всех процессов начинается с того, что факторы индуцирования апоптоза (в частности, белок р53) блокируют действие антиапоптозного белка Bcl-2, встроенного в мембрану митохондрий и способствуют открытию пор (каналов) в митохондриальной мембране и ее частичное повреждение, что, в свою очередь, обеспечивает выход в протоплазму цитохрома С и белка – фактора индуцирования апоптоза (AIF), Smac/DIABLO, эндонуклеазы G, а также проформ каспаз 2, 3 и 9 – индуцирующих каскад каспаз [50]. И цитохром С, и AIF также являются активаторами прокаспаз, которые включают завершающий механизм апоптоза через каскад «казнящих каспаз». При митохондриальном пути апоптоза ключевое место отводится о ранее упомянутой каспазе-9, в составе которой находится специфический домен (CARD), отвечающий за связывание с аналогичным доменом соответствующего белка (APAF-1), что, в конечном итоге, приводит к формированию апоптосомы. Следует отметить, что это приводит к активации каспазы-3 – одной из основных эффекторных каспаз [24]. К основным мишеням последних относятся белки и ферменты, отвечающие за фрагментацию ДНК (каспазазависимые эндонуклеазы, PARP), сохранение целостности ядерной мембраны (ламины А, В и С), целостность цитоскелета клетки (актин, фодрин), передачу внутриклеточных сигналов (некоторые изоформы протеинкиназы С и др.), а также белки-ингибиторы апоптоза (например, антиапоптотические белки семейства bcl-2). 3 стадия – стадия реализация программы (исполнительная, эффекторная). Непосредственными исполнителями («палачами» клетки) являются выше указанные каспазы и эндонуклеазы. Местом приложения их действия (протеолиза) служат (рис. 14):
Фрагментация ДНК является одним из харак- терных признаков апоптозаПроцесс деградация ДНК рассма- тривают как один из отличительных признаков апоптоза и выделяют несколько стадий. Перво- начально происходит образование крупных фрагментов, в дальнейшем процесс фрагментации продолжается, и образуются фрагменты, состоящие в среднем из 30-50 тыс. пар оснований. Все это является следствием активации каскада каспаз (каспазы-3, -6 и -7), который приводит к появлению низкомолекулярный фрагментов ДНК [24]. Первый механизм связан с нарушением способности ДНК к репарации за счет инактивации каспазой-3 фермента поли (АДФ-рибозо) полимеразы – PARP-топоизомеразы, отвечающей за репарацию ДНК. Второй механизм связан с активацией ДНКаз. Каспазы (в первую очередь, каспаза-3) способны вызывать диссоциацию комплекса CAD-ICAD, в состав которого входят эндонуклеаза СAD (сaspase-activateddeoxyribonuclease – каспазоактивируемая дизоксирибонуклеаза) и ICAD, являющийся ингибитором СAD. В норме этот комплекс локализуется в цитоплазме, и участки, отвечающие за ядерную локализацию и эндонкулеазную активность CAD, в нем инактивированы. После взаимодействия с каспазами происходит активация CAD, что сопровождается транслокацией этого фермента в ядро, где и проявляется его эндонуклеазная активность. Еще одним субстратом каспаз является гистон Н1, блокирующий посадку эндонуклеаз на фрагменты ДНК между отдельными нуклеосомами. Помимо CAD, наиболее исследованной к настоящему времени эндонуклеазы, в процессах деградации ДНК задействованы ДНКаза-I, -II и -Х, роль которых при апоптозе еще до конца не исследована. После чего начинается «межнуклеосомная деградация» ДНК с формированием участков, содержащих в среднем 180 пар оснований или кратных им по протяженности, что равняется длине нити ДНК в одной или нескольких нуклеосомах, соответственно. Параллельно идет процесс конденсации хроматина, и нарушается целостность ядерной оболочки и поверхностной мембраны клеток. 4 стадия – стадия удаления апоптозных телец (фрагментов клетки). На поверхности апоптозных телец экспрессируются лиганды, в частности, фосфатидилсерин, они распознаются рецепторами фагоцитов. Процесс обнаружения, поглощения и метаболизирования фрагментов погибшей клетки происходит сравнительно быстро. Это способствует избежать попадания содержания погибшей клетки в окружающую среду и тем самым, как отмечено выше, воспалительный процесс не развивается. Клетка уходит из жизни «спокойно», не беспокоя «соседей» («тихий суицид»). |