НИД-2-курс-осень. Ячмень Hordeum vulgare L

• Название: Ячмень Hordeum vulgare L
• Дата: 18.05.2023
• Размер: 0.8 Mb.
• Имя файла: НИД-2-курс-осень.docx
• Тип: Реферат; #1141467

Содержание

Введение………………………………………………………………..		3
1	Оценка всхожести и ростовых показателей ячменя …………	5
2	Молекулярно – генетические методы исследования …………	10
2.1	Выделение РНК из проростков ячменя…………………………	10
2.2	Проведение реакции обратной транскрипции …………………	11
2.3	ПЦР в реальном времени………………………………………..	12
Заключение ……………………………………………………………..		15
Список используемой литературы…………………………………….		16

Введение
Ячмень (Hordeum vulgare L.) считается четвертой по значимости зерновой культурой в мире, во многом благодаря его исключительной адаптации к выращи- ванию в различных условиях окружающей среды. Ячмень особенно способен адаптироваться к различным условиям, таким как засуха и соль, по сравнению с другими злаками (Туманян А.Ф и др., 2010). Такая полезная характеристика поз- воляет ячменю расти в регионах, где другие злаки, например, пшеница, не могут хорошо расти.

Абиотические стрессовые условия являются широко распространенной про- блемой во всем мире, в то время как засуха является наиболее важным фактором, ограничивающим рост сельскохозяйственных культур, и становится все более распространенной, особенно в засушливых и полузасушливых регионах (Кондра- тьев М.Н и др., 2018). Влияние стресса от засухи очевидно на производительность и урожайность растений; фазы прорастания и развития проростков являются пе- риодом, наиболее чувствительным к таким условиям у ячменя (Гамзаева Р.С и др.,2017), а также у большинства других культур. Стресс от засухи на очень ран- ней стадии развития задерживает прорастание семян и снижает скорость прорас- тания (Илли И.Э и др., 2014). Таким образом, понимание естественной изменчи- вости и генетического контроля всхожести и связанных с ней признаков в усло- виях стресса от засухи может помочь улучшить рост и урожайность ячменя.

Устойчивость сортов к дефициту почвенной влаги на начальных этапах он- тогенеза имеет важное значение для дальнейшего развития растений. Для гаран- тий обеспечения сельского хозяйства от потерь в засушливые годы, необходимо иметь устойчивые к дефициту влаги сорта ячменя.

Прямая оценка засухоустойчивости в поле при всей ее объективности тре- бует многолетних наблюдений. Засуха бывает не каждый год, меняется ее харак- тер, периоды проявления. Для ускорения селекционного процесса в последнее время все чаще применяют косвенную оценку засухоустойчивости с помощью ла-

бораторно физиологических методов. Особый интерес представляют методы ран- ней диагностики на зерне и проростках, поскольку они дают возможность прово- дить исследования в течении года и анализировать большое количество образцов.

В Оренбургской области, где засухи различной интенсивности проявляются практически ежегодно, определяющее значение имеет засухоустойчивость сорта в сочетании с повышенной адаптивной способностью. Поэтому в местных усло- виях, всегда основным направлением селекции ячменя являлось и является даль- нейшее, постепенное усиление засухоустойчивости новых сортов, их пластично- сти и хозяйственной ценности.

1. Оценка всхожести и ростовых показателей ячменя

Засуха - один из самых сильных абиотических стрессов, препятствующих прорастанию семян, росту растений и урожайности сельскохозяйственных куль- тур. Высокая скорость и равномерность прорастания в стрессовых условиях жиз- ненно важны для создания и роста сельскохозяйственных культур, а, следова- тельно, и для продуктивности. Лучшее понимание генетической архитектуры прорастания семян в условиях засухи является необходимым условием для даль- нейшего повышения потенциала урожайности. Ячмень считается одним из наибо- лее устойчивых к абиотическим стрессам злаков. Выяснение засухоустойчивости ячменя во время прорастания семян действительно проложило бы путь к улучше- нию показателей всех зерновых культур. Однако еще относительно мало известно о генетическом контроле засухоустойчивости во время фазы прорастания семян.

Материалом для исследования послужили 120 образцов ячменя местных, отечественных и зарубежных сортов которые характеризуются как засухоустой- чивые и рассматриваются как перспективные для возделывания в климатической зоне Оренбуржья, а также интенсивно используются в селекционных программах.

В качестве селективного агента использовали ПЭГ 6000, наиболее часто применяемый в качестве имитанта засухи. Для оценки влияния селективного агента на ростовые показатели проростков и выявления сублетальной концентра- ции семена изучаемых сортов проращивали согласно ГОСТ 12038-84 на растворе ПЭГ 6000 в концентрациях 20%. Контролем служило проращивание семян в ди- стиллированной воде.

Для определения коэффициента всхожести использовали метод проращива- ния семян в растильнях. Для проращивания отбирали три пробы по 10 семян в каждой.

Семена проращивали на фильтровальной бумаге, которую нарезали по раз- мерам посуды, укладывали на дно и увлажняли. На рисунке 1 изображен процесс работы по закладке семян ячменя в растильни для оценки всхожести сортообраз- цов.


Рисунок 1 – Процесс закладки семян ячменя для проращивания

Предварительно нарезанную фильтровальную бумагу стерилизовали в су- шильном шкафу при температуре 130°С в течение 1 часа. Перед проращиванием фильтровальную бумагу увлажняли до полной влагоемкости, опуская в воду, и давая стечь избытку влаги. Семена равномерно раскладывали. В каждую рас- тильню помещают заполненную простым карандашом этикетку с указанием названия образца, даты учета энергии прорастания и всхожести, сверху накрывали крышками и помещали в термостат. Семена проращивали при температуре 21 ° С в течение 12 суток. Количество проросших семян в контрольных образцах считали начиная со второго дня, проросшие семена на 20% растворе ПЭГ 6000 считали начиная с 5 дня. Всхожесть оценивали с интервалом в 24 часа в течение 12 дней. Семена считаются проросшими при достижении побегом размера 2-3 мм, на рисунке 2 показаны проросшие семена ячменя на пятый день эксперимента.




Рисунок 2- Семена ячменя на пятый день эксперимента

Параметры всхожести оценивались в соответствии с правилами Междуна- родной ассоциации тестирования семян (ISTA) следующим образом:

Процент всхожести выражается как (G%)




Где n - количество проросших семян в конце эксперимента, а N-общее ко- личество всего посеянных семян.

Скорость прорастания выражается как (GP)




Где N - общее количество проросших семян в конце эксперимента, а n-ко- личество проросших семян в день g (1, 2, 3,..).

Индекс засухоустойчивости (DTI) был рассчитан для G% и GP в соответ- ствии с уравнениями:


Снижение G% и GP также были рассчитаны следующим образом:



Для измерения длины побега и длины корня проращивали семяна в рулонах по 10 семян в трех повторнорстях. Стресс от засухи вызывали добавлением ПЭГ- 6000 в концентрации 20% (мас./об.), в то время как в качестве контроля использо- вали дистиллированную воду.

Семена проращивали в рулонах из фильтровальной бумаги. Для этого наре- зали полосы бумаги шириной 30-40 см и длиной 35-40 см и складывали по ширине вдвое, затем разворачивали, смачивали дистилированной водой или раствором ПЭГ- 6000 и на половине полосы раскладывают семена рядами зародышем вниз. Количество полос бумаги соответствует количеству повторностей. Семена при- крывали второй частью полосы, бумагу сворачивали в рулоны, которые помещали

вертикально и неплотно один к другому по нескольку штук в пластиковые емко- сти. Емкости помещали в термостат на 12 суток при температуре 21°С. На рисун- ках 3, 4 изображен процесс проращивания контрольных образцов семян ячменя в рулонах на 7 и 12 день эксперимента соответственно.
3) 4)

Рисунок 3, 4 – Процесс проращивания ячменя в рулонах для оценки росто- вых показателей сортообразцов.

Через 12 дней для проведения учета рулоны вынимали из сосудов и развер- тывали на столе, осторожно отделяя верхний слой бумаги, SL (длина побега) и RL (длина корня), (в см) измеряли вручную с помощью масштабированной ли- нейки. Свежий вес (FW) проростков регистрировали (г) с использованием чув- ствительных весов. Соотношение побегов к корням (SRR) было рассчитано как отношение SL к RL. Снижение SL, RL и FW было рассчитано следующим обра- зом:


Также был рассчитан индекс засухоустойчивости (DTI) для SL и RL:






Сравнение физиологических показателей проростков ячменя, обладающих различной полевой засухоустойчивостью, показало, что образцы существенно различаются по реакции на повышенное содержание хлорида натрия и осмотиче- ский стресс, вызванный полиэтиленгликолем. Это подтверждает возможность изучения механизмов устойчивости к засолению и засухе за счет генотипической изменчивости образцов. Способность семян прорастать является критическим мо- ментом для получения ростков обладающих энергией роста.

2. Молекулярно – генетические методы исследования

   1. Выделение РНК из проростков ячменя

Для выделения РНК из тканей ячменя использовали набор реагентов «РНК экстран» (ООО «Синтол») (рисунок 6).

Рисунок 6 – набор реагентов «РНК – экстран» Первый этап – лизис клеток.

1. 
   Образцы тканей помещали в пробирки типа Эппендорф объемом 1,5 мл и гомогенизировали.
   
2. 
   К полученному гомогенату добавляли 300 мкл лизирующего раствора, перемешивали содержимое пробирок на вортексе кратковременно, затем смесь инкубировали при комнатной температуре в течении 10 минут.
   
3. 
   Центрифугировали смесь 10 минут при 12000 g и 2-8 °С. Отбирали супернатант и переносили его в новую пробирку 1,5 мл.
   

Второй этап – разделение фаз.

1. 
   Добавляли в пробирки по 40 мкл осаждающего реагента 1 и переме- шивали встряхиванием на вортексе трижды по 15 секунд.
   
2. 
   Смесь инкубировали при комнатной температуре при комнатной тем- пературе в течении 10 минут.
   
3. 
   Центрифугировали сместь 15 мин при 12000 g и 4-8 °С. Отбирали верхнюю водную фазу и переносили ее в чистую пробирку 1,5 мл.
   

На 7 рисунке изображен промежуточный результат после второго этапа вы- деления РНК из проростков ячменя.


Рисунок 7- Второй этап (разделение фаз) выделения РНК Третий этап - осаждение РНК.

1. 
   К водной фазе добавить равный объем Осаждающего реагента 2.
   
2. 
   Перемешивали содержимое пробирок на вортекск и оставляли стоять при комнатной температуре 5-10 минут.
   
3. 
   Центрифугировали смесь 8 минут при 12000 g и 4-8 °С. Осторожно удаляли супернатант.
   

Четвертый этап – промывка и осаждение РНК.

1. 
   Добавляли 400 мкл промывочного раствора и перемешивали не- сколько раз переворачиванием.
   
2. 
   Центрифугировали 8 минут при 12000 g и 4-8°С. Осторожно удаляли супернатант.
   
3. 
   Открытые пробирки сушить на воздухе или при 37°С до видимого ис- чезновения капель влаги.
   
4. 
   Добавляли к осадку 40 мкл воды свободной от нуклеаз содержащей 0,5 ед/мкл ингибитора РНКаз. Перемешивали и оставляли стоять при комнатной температуре 5-10 минут для растворения РНК.
   

Полученный раствор РНК хранили при -20°С.

На данный момент РНК выделено более чем из 50 сортов из 120 сортов вы- борки.

2. Проведение реакции обратной транскрипции

Для проведения реакции обратной транскрипции использовали «Набор ре- агентов для проведения обратной транскрипции» (ООО «Синтол»).

В отдельной чистой пробирки готовили реакционную смесь для исследуе- мых образцов. Полученную реакционную смесь перемешивали на микроцентри- фуге – встряхивателе и центрифугировали в течении нескольких секунд.

Отбирали необходимое число микропробирок объемом 0,2 мл для проведе- ния реакции ОТ. Готовую реакционную смесь вносили по 15 мкл в подготовлен- ные 0,2 пробирки, установленные в штатив типа «IsоFreeze». Затем вносили в про- бирки исследуемые образцы, перемешивали на микроцентрифуге- встряхивателе и центрифугировали. Устанавливали пробирки в амплификатор и инкубировали при температуре 40°С 40 минут. Для инактивации фермента пробирки нагревали до 92°С и инкубировали 3-5 минут.

Полученную кДНК хранили при -20°С.

3. ПЦР в реальном времени

В последние годы все больше молекулярно-биологических методов находят практическое применение в различных областях медицины, промышленности и сельского хозяйства. Один из таких методов — полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяющая нарабатывать в пробирке определенный участок молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) практически в неограниченных количе- ствах.

Полимеразная цепная реакция в реальном времени (или количественная ПЦР, кПЦР, ПЦР-РВ, англ. Real-time PCR, qPCR) — лабораторный метод, осно- ванный на методе полимеразной цепной реакции, позволяющий определять не только присутствие целевой нуклеотидной последовательности в образце, но и измерять количество её копий. Количество амплифицированной ДНК измеряется после каждого цикла амплификации с помощью флуоресцентных меток: зон- дов или интеркаляторов. Оценка может быть количественной (измерение количе- ства копий матрицы) и относительной (измерение относительно внесённой ДНК или дополнительных калибровочных генов).

Открытие полимеразной цепной реакции стало одним из наиболее выдаю- щихся событий в области молекулярной биологии за последние десятилетия. Это

позволило поднять данную область науки на качественно новый уровень. Внедре- ние полимеразной цепной реакции в медицину открыло новое диагностическое направление — ДНК-диагностику. Основные принципы полимеразной реакции и состав реакционной смеси для получения копий ДНК впервые были описаны Kleppe с соавт. в 1971 году (Kleppe et al, 1971). Однако исследователями не была продемонстрирована главная черта ПЦР — экспоненциальное увеличение коли- чества копий фрагмента исходной ДНК.

Поскольку в ходе полимеразной цепной реакции происходит наработка определенного участка ДНК, по окончании реакции можно зарегистрировать по- лученный фрагмент при помощи ряда методов, первым и наиболее часто исполь- зуемым из которых является метод электрофореза молекул ДНК в геле с окраши- ванием бромистым этидием. Однако регистрация результата реакции по ее завер- шении не дает информации об эффективности процесса (если не использовать специальную постановку эксперимента), снижая тем самым потенциальную ин- формативность ПЦР. Применение метода было ограничено задачами, в которых было достаточно ответа «да»–«нет». В начале 90-х годов прошлого столетия ис- следователи предложили регистрировать накопление ДНК непосредственно в ходе ПЦР (Higuchi et al, 1992). К этой идее их подтолкнуло желание использовать метод ПЦР для количественного определения исходного числа матриц, попавших в реакционную пробирку. Несмотря на то, что ПЦР и ранее использовали для ко- личественного определения нуклеиновых кислот, изобретение ПЦР «в реальном времени» существенно упрощало технику измерения и делало подход более точ- ным (Higuchi et al, 1993). С этого момента началось бурное развитие как прибор- ной, так и реагентной базы для выполнения ПЦР с регистрацией накопления про- дуктов амплификации непосредственно в ходе реакции. Уже в середине 90-х го- дов появились первые детектирующие амплификаторы (термоциклеры), а к насто- ящему моменту их разнообразие перевалило за 30 (на рынке присутствует более 10 компаний, промышленно выпускающих приборы данного типа).

В основе полимеразной цепной реакции лежит природная способность тер- мофильного фермента ДНК-зависимой Taq-ДНК полимеразы осуществлять копи- рование одной из цепей ДНК, стартуя с короткой ДНК-затравки (прямого прай- мера), комплементарной другой цепи.

Необходимыми компонентами реакционной смеси являются (праймеры ограничивают зону амплифицируемого участка ДНК - ампликон), смесь четырех Дезоксинуклеозидтрифосфатов (являются «строительными» ампликона), а также буфер, содержащий ионы двухвалентного магния. Протеканию ПЦР спо- собствует быстрое и точное циклическое изменение температуры реакционной

смеси.

Таким образом, в течение 1-2 часов исследователю удается экспоненци- ально увеличить количество исходной нуклеиновой кислоты – мишени и из одной молекулы ДНК получить до нескольких десятков миллиардов копий ее фраг- мента.

Для проведения ПЦР в режиме реального времени, была использована 2,5х Реакционная смесь для проведения ПЦР-РВ в присутствии EVA Green (ООО

«Синтол»). Согласно протоколу, готовили реакционную смесь, затем подготавли- вали пробирки объемом 0,2 мл и вносили в них по 20 мкл подготовленной реак- ционной смеси и по 5 мкл образца кДНК. Готовые пробирки устанавливали в при- бор и вводили условия проведения ПЦР.

Температурно-временной режим амплификации

№ п/п	Температурно – времен- ной режим	Число циклов
1	95°С – 180 с	1
2	95°С – 15 с	40
3	62°С – 60 с

Заключение

В результате описанных в отчете исследований была проведена оценка всхожести и ростовых показателей 120 сортообразцов ячменя, для дальнейшего фенотипического анализа. Параметры всхожести рассчитали в соответствии с правилами Международной ассоциации тестирования семян (ISTA). Отработана методика выделения РНК из проростков ячменя и проведения реакции обратной транскрипции, выделили РНК и провели реакцию обратной транскрипции более шестидесяти сортов рабочей выборки. В настоящее время ведется отработка ме- тодики работы с ПЦР в реальном времени.

По результатам проведенной работы опубликованы одна обзорная статья в журнале «Животноводство и кормопроизводство» и тезис в постерной сессии 6-й Международной научной конференции “Генетика растений, геномика, Биоинфор- матика и биотехнология” (plantgen2021),14-18 июня 2021 года, Новосибирск, Рос- сия, запланирована публикация обзорной статьи.

1. 
   Новикова А. А., Богданова О. В. ВОЗМОЖНОСТИ МАРКЕР-ОРИЕНТИ- РОВАННОЙ СЕЛЕКЦИИ ДЛЯ СОЗДАНИЯ СОРТОВ ЯЧМЕНЯ, УСТОЙЧИ- ВЫХ К БИОТИЧЕСКИМ И АБИОТИЧЕСКИМ ФАКТОРАМ (ОБЗОР) //Живот- новодство и кормопроизводство. – 2021. – Т. 104. – №. 1. – С. 138-148.
   
2. 
   Новикова А. А., Богданова О. В. Молекулярно-генетические методы оценки засухоустойчивости ярового ячменя //Генетика растений, геномика, био- информатика и биотехнология. – 2021. – С. 158-158. DOI 10.18699/PlantGen2021- 142
   

Список литературы

1. 
   Higuchi R. et al. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences //Bio/technology. – 1992. – Т. 10. – №. 4. – С. 413-417.
   
2. 
   Higuchi R. et al. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA am- plification reactions //Bio/technology. – 1993. – Т. 11. – №. 9. – С. 1026-1030.
   
3. 
   Kleppe K. et al. Studies on polynucleotides: XCVI. Repair replication of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases //Journal of molecular biology.
   

– 1971. – Т. 56. – №. 2. – С. 341-361.

4. 
   Гамзаева Р.С. Влияние регуляторов роста на физиолого - биохимиче- ские показатели и продуктивность ярового ячменя // Известия СПбГАУ. 2017. №1 (46). URL: https://cyberleninka.ru/article/n/vliyanie-regulyatorov-rosta-na-fiziologo- biohimicheskie-pokazateli-i-produktivnost-yarovogo-yachmenya.
   
5. 
   Илли И.Э., Клименко Н.Н., Абрамова И.Н., Кузнецова Е.Н., Половин- кина С.В., Парыгин В.В. Влияние температуры при формировании семян на рост тканей прорастающего зародыша яровой пшеницы в условиях Предбайкалья // До- стижения науки и техники АПК. 2014. №7. URL: https://cyberleninka.ru/arti- cle/n/vliyanie-temperatury-pri-formirovanii-semyan-na-rost-tkaney-prorastayuschego- zarodysha-yarovoy-pshenitsy-v-usloviyah-predbaykalya.
   
6. 
   Кондратьев М.Н., Роньжина Е.С., Ларикова Ю.С. Влияние абиотических стрессов на метаболизм вторичных соединений в растениях // Известия КГТУ. 2018. №49. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/vliyanie-abioticheskih-stressov-na- metabolizm-vtorichnyh-soedineniy-v-rasteniyah.
   
7. 
   Туманян А.Ф, Хамдан Васим, Тютюма Н.В. Засухоустойчивость сортооб- разцов ярового ячменя // Вестник РУДН. Серия: Агрономия и животноводство. 2010. №2. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/zasuhoustoychivost-sortoobraztsov- yarovogo-yachmenya.