Цитология растений. Ченцов - Общая цитология. Ю. С. Ченцоввведение в клеточную биологию. Общая цитология

• Название: Ю. С. Ченцоввведение в клеточную биологию. Общая цитология
• Анкор: Цитология растений
• Дата: 12.01.2022
• Размер: 1.71 Mb.
• Имя файла: Ченцов - Общая цитология.pdf
• Тип: Документы; #329335
• страница: 5 из 27

гетерохроматина, в отличие от остальной массы хроматина – эухроматина (собственно хроматина). По этим представлениям, гетерохроматин – компактные участки хромосом, которые в профазе появляются раньше других частей в составе митотических хромосом, и в телофазе не деконденсируются, переходя в интерфазное ядро в виде интенсивно красящихся плотных структур (хромоцентры). Первоначально понятие гетерохроматина имело сугубо морфологическое значение, потому что,
77

изучая препараты окрашенных ядер, конечно нельзя знать, может ли данный участок конденсированного хроматина, хромоцентр, перейти в будущем в разрыхленное, эухроматическое состояние, или нет. В связи с этим в специальной цитологической литературе часто без всякого основания любой участок конденсированного хроматина стали называть гетерохроматином.
Процесс же общей конденсации хроматина, например в ядрах лейкоцитов, называли гетерохроматизацией ядер. На самом же деле в составе ядерного хроматина только лишь некоторые участки практически никогда не теряют особого конденсированного состояния. Такими постоянно конденсированными зонами чаще всего являются центромерные и теломерные участки хромосом.
Кроме них постоянно конденсированными могут быть также некоторые участки, входящие в состав плечей хромосом – вставочный или интеркалярный гетерохроматин, который в ядрах также представлен в виде хромоцентров.
Такие постоянно конденсированные участки хромосом в интерфазных ядрах сейчас принято называть конститутивным (постоянным) гетерохроматином.
Здесь же необходимо отметить, что участки конститутивного гетерохроматина обладают целым рядом особенностей, которые отличают его от остального хроматина. Конститутивный гетерохроматин генетически не активен, он не транскрибируется, реплицируется он позже всего остального хроматина, в его состав входит особая (сателлитная) ДНК, обогащенная высокоповторяющимися последовательностями нуклеотидов (см. ниже); он локализован в центромерных, теломерных и интеркалярных зонах митотических хромосом. Доля конститутивного хроматина может быть неодинаковой у разных объектов. Так у млекопитающих на него приходится 10-15% всего генома, а у некоторых амфибий – даже до 60%. Функциональное значение конститутивного гетерохроматина до конца не выяснено, предполагается, что он несет ряд важных функций, связанных со спариванием гомологов в мейозе, со структуризацией интерфазного ядра, с некоторыми регуляторными функциями.
78

Вся остальная, основная масса хроматина ядра может менять степень своей компактизации в зависимости от функциональной активности, она относится к эухроматину. Эухроматические неактивные участки, которые находятся в конденсированном состоянии, стали называть
факультативным
гетерохроматином, подчеркивая необязательность такого его состояния.
Хорошим примером факультативного гетерохроматина может служить X- хромосома в организме человека. В клетках мужской особи X-хромосома деконденсирована, она активна, транскрибируется и морфологически не выявляется из-за своего рыхлого, диффузного состояния. В клетках женского организма, где присутствуют две X-хромосомы, одна из них находится в активном, диффузном состоянии, а вторая – в неактивном, конденсированном, она временно гетерохроматизована. В этом состоянии она может существовать в течение всей жизни организма. Но потомки ее, попадая в клетки мужского организма следующего поколения, снова будут активированы.
В дифференцированных клетках всего лишь около 10% генов находится в активном состоянии, остальные гены инактивированы и, соответственно, находятся в составе конденсированного хроматина (факультативный гетерохроматин). Это обстоятельство объясняет, почему большая часть хроматина ядра структурирована.
В таблице 1.
даны сравнительные общие характеристики эухроматических и гетерохроматических районов интерфазных хромосом.
Таблица 1.
79

Свойства
Эухроматин
Гетерохроматин конститутивный
Активный
Неактивный
(факультативный гетерохроматин)
Структура диффузный конденсированный конденсированный
Синтез РНК + - -
Синтез ДНК + + +
поздняя репликация
Тип нуклеотид- уникальные, уникальные, высокоповторяющаяся,
ных последова- умеренные умеренные сателлитная ДНК
тельностей ДНК повторы повторы
Локализация плечи плечи центромера, теломера,
хромосом хромосом интеркалярный гетеро- хроматин
Хромосомный цикл
Как известно, половые женские и мужские клетки несут одинарный набор хромосом и, следовательно, содержат в 2 раза меньше ДНК, чем все остальные клетки организма. Половые клетки (сперматозоиды и ооциты) с одинарным набором хромосом называют гаплоидными. Плоидность (от греч. ploos –
кратность) обозначают буквой n, так, клетки с 1n – гаплоидны, с 2n – диплоидны, с 3n – триплоидны и т.д. Соответственно количество ДНК на клетку
(с) зависит от ее плоидности: клетки с 2n числом хромосом содержат 2с количества ДНК. При оплодотворении происходит слияние двух клеток, каждая
80

из которых несет 1n набор хромосом, поэтому образуется исходная диплоидная
(2n, 2c) клетка, зигота. В дальнейшем в результате деления диплоидной зиготы и последующего деления диплоидных клеток разовьется организм, клетки которого, кроме половых, будут диплоидными.
Однако мы знаем, что процессу деления клеток предшествует фаза синтеза, редупликации ДНК, что должно приводить к появлению клеток с 4с количеством ДНК, у которых количество хромосом 4n, т.е. в два раза больше, чем у исходной диплоидные клетки. И только после деления такой
тетраплоидной (4с) клетки снова возникнут две исходные диплоидные клетки.
В ядрах интерфазных клеток выявить с помощью морфологических методов тела хромосом очень трудно. Собственно хромосомы как четкие, плотные, хорошо видимые в световой микроскоп тела выявляются только незадолго перед клеточным делением. В самой же интерфазе хромосом как плотных тел не видно, так как они находятся в разрыхленном состоянии. В интерфазе происходит удвоение, редупликация хромосом. Этот период характеризуется синтезом ДНК, он называется синтетическим, или s-периодом. Как раз в это время в клетках обнаруживается количество ДНК большее, чем 2с. После окончания s-периода количество ДНК в интерфазном ядре равно 4с, ибо произошло полное удвоение хромосомного материала. Однако морфологически регистрировать удвоение числа хромосом на этой стадии не всегда удается.
Собственно хромосомы как нитевидные плотные тела начинают обнаруживаться микроскопически в начале процесса деления клетки, а именно в профазе
митотического деления клетки
(рис
. 31). Если попытаться подсчитать число хромосом в профазе, то их количество будет равно 2n. Но это ложное впечатление, потому что в профазе каждая из хромосом двойная в результате их редупликации. На этой стадии пара хромосом тесно соприкасается друг с другом, взаимно спирализуясь одна относительно другой, поэтому трудно увидеть двойственность всей структуры в целом. Позднее хромосомы в каждой такой паре начинают обосабливаться, раскручиваться. Такая двойственность
81

хромосом в митозе наблюдается даже у живых клеток в конце профазы, когда видно, что общее число хромосом в такой начинающей делиться клетке равно
4n. Следовательно, уже в начале профазы хромосомы состояли из двух сестринских хромосом, или, как их еще называют, хроматид.
И в профазе, и в следующем периоде деления клетки – в метафазе –
сестринские хромосомы остаются связанными друг с другом в виде пары. В метафазе происходит выстраивание хромосом в экваториальной плоскости клетки и окончательное их разъединение. И в профазе и в метафазе клетки остаются тетраплоидными.
В анафазе идет расхождение каждой из хромосом данной пары к противоположным полюсам клетки, после чего начинает делиться тело исходной клетки. Затем в телофазе разошедшиеся диплоидные (2n) наборы хромосом начинают деконденсироваться. Отдельные хромосомы теряют свои четкие очертания и теперь уже внутри нового интерфазного диплоидного ядра с
2с ДНК трудно узнать хромосомы, которые мы могли видеть во время митоза.
Так заканчивается один хромосомный цикл и начинается следующий.
Общая морфология митотических хромосом
Хромосомы всех эукариотических клеток построены по одному плану. Они включают в себя три основных компонента: собственно тело хромосомы
(плечо), теломерный, конечный участок, и центромеру. Наиболее просто устроены хромосомы дрожжевых клеток: палочковидное тело хромосомы на одном конце имеет теломеру, а на другом – центромеру (
рис
. 32). Хромосомы животных и растений также представляют собой палочковидные структуры разной длины с довольно постоянной толщиной, но обычно имеют два хромосомных плеча, соединенных в зоне центромеры. Эта зона называется
первичной перетяжкой. Соответственно оба плеча хромосомы оканчиваются теломерами (
рис
. 32). Хромосомы с равными или почти равными плечами называют метацентрическими, с плечами неодинаковой длины –
82

субметацентрическими. Палочковидные хромосомы с очень коротким, почти незаметным вторым плечом – акроцентрические.
В области первичной перетяжки (центромеры) расположен кинетохор - пластинчатая структура, имеющая форму диска. К нему подходят пучки микротрубочек митотического веретена, идущие в направлении к центриолям.
Эти пучки микротрубочек принимают участие в движении хромосом к полюсам клетки при митозе.
Обычно каждая хромосома имеет только одну центромеру (моноцентрические хромосомы), но могут встречаться хромосомы дицентрические и полицентрические, т.е. обладающие множественными кинетохорами.
В зоне первичной перетяжки присутствует особая, центромерная, сателлитная
ДНК, отличающаяся высоким уровнем повторенности нуклеотидных последовательностей.
Некоторые хромосомы имеют вторичную перетяжку. Последняя обычно расположена вблизи дистального конца хромосомы и отделяет маленький участок, спутник. Вторичные перетяжки называют, кроме того, ядрышковыми
организаторами, так как именно на этих участках хромосом в интерфазе происходит образование ядрышка. Здесь же локализована ДНК, ответственная за синтез рРНК. В хромосомах человека ядрышковые организаторы расположены в коротких плечах вблизи центромер.
Плечи хромосом оканчиваются теломерами, конечными участками.
Теломерные концы хромосом не способны соединяться с другими хромосомами или их фрагментами, в отличие от концов хромосом, лишенных теломерных участков (в результате разрывов), которые могут присоединяться к таким же разорванным концам других хромосом. В теломерах локализована особая теломерная ДНК, защищающая хромосому от укорачивания в процессе синтеза
ДНК.
Размеры хромосом у разных организмов варьируют в широких пределах (
рис
33). Так, длина хромосом может колебаться от 0,2 до 50 мкм. Самые мелкие
83

хромосомы обнаруживаются у некоторых простейших, грибов, водорослей, очень мелкие хромосомы – у льна и морского камыша; они настолько малы, что с трудом видны в световой микроскоп. Наиболее длинные хромосомы обнаружены у некоторых прямокрылых насекомых, у амфибий и у лилейных.
Длина хромосом человека находится в пределах 1,5-10 мкм.
Число хромосом у различных объектов также значительно колеблется, но характерно для каждого вида животных и растений. У некоторых радиолярий число хромосом достигает 1000-1600. Рекордсменом среди растений по числу хромосом (около 500) является папоротник ужовник, 308 хромосом у тутового дерева, у речного рака 196 хромосом. Наименьшее количество хромосом (1 хромосома на гаплоидный набор) наблюдается у одной из рас аскариды, у сложноцветного Haplopappus gracilis всего 4 хромосомы (2 пары).
Совокупность числа, величины и морфологии хромосом называется
кариотипом данного вида. Кариотип – это как бы лицо вида. Даже у близких видов хромосомные наборы отличаются друг от друга или по числу хромосом, или по величине хотя бы одной или нескольких хромосом, или по форме хромосом и по их структуре. Структура кариотипа данного вида не зависит ни от типа клеток, ни от возраста животного или растения. Все клетки индивидуумов одного вида имеют идентичные наборы хромосом. Простой морфологический анализ может убедительно показать различия в кариотипах даже у близких видов. Следовательно, структура кариотипа может быть таксономическим (систематическим) признаком, который все чаще используется в систематике животных и растений (
рис
. 34).
В последние годы в практику хромосомного анализа стали широко входить методы дифференциального окрашивания хромосом. Впервые метод был предложен Касперссоном, который показал, что при обработке препаратов митотических хромосом с помощью флуорохрома акрихиниприта во флуоресцентном микроскопе видна исчерченность по длине хромосом. В
84

хромосомах были видны поперечные светящиеся полосы («бэнды») (Q– полосы,
Q–окраска), расположение которых было характерно для каждой хромосомы.
Затем оказалось, что исчерченность тела хромосомы, ее способность дифференциально окрашиваться по длине, можно выявить с помощью нефлуоресцирующих красителей (например, смесь по Гимза: метилен-азур, метиленовый фиолетовый, метиленовый синий и эозин). Перед окраской препараты обрабатывают разными способами (короткая обработка трипсином, щелочными или кислыми растворами и др.). В зависимости от метода окраски можно выявить окрашивание прицентромерных участков (C-полосы или перевязки) или различные полосы в плечах и теломерах хромосом (G-полосы).
При этом, так же как при окраске акрихинипритом, расположение полос характерно для каждой хромосомы (
рис
. 35).
Интересно, что получение дифференциальной окраски хромосом связано, скорее всего, с различной способностью к искусственной деконденсации разных участков хромосом. Так, дифференциальную окраску, соответствующую C- и G- полосам, можно получить при окраске обычным гематоксилином или просто наблюдать под фазовым контрастом на нефиксированных хромосомах в процессе их постепенной деконденсации при удалении двухвалентных катионов из окружающих хромосомы растворов, т.е. наблюдать дифференциальную деконденсацию митотических хромосом.
Такая дифференциальная окраска позволила детально изучить строение хромосом человека. При обычных методах окраски весь набор из 46 хромосом человека принято подразделять по их размерам на 7 групп (A, B, C, D, E, F, G).
Если при этом легко отличить крупные (1, 2) хромосомы от мелких (19, 20), метацентрические от акроцентрических (13-я), то внутри групп трудно различить одну хромосому от другой. Так, в группе C 6-я и 7-я хромосомы схожи между собой так же, как и с X-хромосомой (
рис
. 36). Дифференциальное окрашивание позволяет четко отличить эти хромосомы друг от друга (
рис
. 37).
Этот прием цитологического анализа в сочетании с генетическими
85

наблюдениями уже в настоящее время позволил начать составлять хромосомные карты человека, т.е. находить места расположения генов на определенных участках хромосом (
рис
. 38).
Несмотря на то, что молекулярные механизмы такой специфической окраски до сих пор еще не ясны, многие исследователи такую способность отдельных участков хромосом к окрашиванию связывают с их химическими различиями.
Большое число наблюдений говорит о том, что избирательное окрашивание связано с локализацией так называемого гетерохроматина, ДНК которого обогащена A- и T-основаниями.
Клеточный цикл эукариот
В отличие от клеточного цикла прокариот эукариотические клетки удваивают число своих хромосом в результате синтеза ДНК задолго до цитотомии, до разделения исходной клетки на две дочерние. И время протекания клеточного цикла у эукариот значительно больше времени клеточного цикла бактерий. Так, если для бактериальных клеток время от деления до деления клетки составляет
20-30 мин., то у одноклеточных эукариот, таких как инфузория туфелька клеточный цикл занимает уже 10-20 часов, время клеточного цикла у амебы составляет около 1,5 суток. Около суток занимает клеточный цикл и у многоклеточных организмов.
Клетки многоклеточных организмов обладает разной способностью к делению. Если в раннем эмбриогенезе клетки животных организмов делятся часто, то во взрослом организме они большей частью теряют эту способность. У круглых червей и коловраток клетки теряют способность к делению после прохождения эмбрионального развития, и рост организма, например у аскариды, происходит не за счет роста числа клеток, а за счет увеличения их размера.
В организме высших позвоночных клетки различных тканей и органов имеют неодинаковую способность к делению. Здесь встречаются клетки, полностью потерявшие свойство делиться: это большей частью специализированные, дифференцированные клетки (например, клетки центральной нервной системы,
86

кардиомиоциты, клетки хрусталика глаза). В организме есть постоянно обновляющиеся ткани (различные эпителии, кровь, клетки рыхлой и плотной соединительных тканей). В этом случае в таких тканях существует часть клеток, которые постоянно делятся (например, клетки базального слоя покровного эпителия, клетки крипт кишечника, кроветворные клетки костного мозга и селезенки), заменяя отработавшие или погибающие клеточные типы. Многие клетки, не размножающиеся в обычных условиях, приобретают вновь это свойство при процессах репаративной регенерации органов и тканей.
Примерно такие же типы клеток по способности их вступать в деление встречаются и у растительных организмов: Это камбиальные клетки, дающие начало различным органам и тканям, клетки интенсивно делящиеся, это клетки, возобновляющие деление при регенерации, это дифференцированные клетки, потерявшие в естественных условиях способность делиться.
Клетки многоклеточных животных и растений, так же как одноклеточные эукариотические организмы, вступают в процесс деления после ряда подготовительных процессов, важнейшим из которых является синтез ДНК.
Весь смысл клеточного деления заключается в равномерном распределении редуплицированного генетического материала по двум новым клеткам.
Следовательно, нужно ожидать, что отделения до деления где-то в течение жизни клетки должен существовать период синтеза ДНК. Это предположение было подтверждено в радиоавтографических экспериментах. Если размножающимся клеткам животных или растений дать на короткое время меченый предшественник ДНК, а затем его убрать (так называемое импульсное мечение), то он будет включаться только в те клетки, в которых во время эксперимента шел синтез ДНК. В гетерогенной популяции клеток, среди которых были как делящиеся, так и неделящиеся клетки, метка включалась только в часть интерфазных клеток. Это наблюдение показывало, что синтез
ДНК происходит только в интерфазе, в которой существуют периоды, когда синтез ДНК не происходит; отсутствие метки в некоторых интерфазных клетках
87

могло говорить, что в них синтез ДНК или еще не начинался, или уже закончился.
Это положение было доказано следующим образом. Если клеткам дать импульсную метку (например, меченный тритием предшественник ДНК, тимидин), а затем наблюдать за распределением метки среди клеток, взятых через определенные интервалы времени, то можно наблюдать следующую картину. Через некоторое время в образцах будут встречаться как меченые интерфазные клетки, так и немеченые клетки и делящиеся клетки, не содержащие метку. Делящиеся, но не содержащие метки – это те клетки, которые уже закончили синтез ДНК до начала эксперимента. Позднее в препаратах начинают появляться меченые делящиеся клетки. Это как раз те клетки, которые в момент введения меченого предшественника в интерфазе синтезировали ДНК, были в синтетическом периоде (S-период). Через некоторое время снова появляются немеченые делящиеся клетки, те, которые в момент введения меченого предшественника в интерфазе еще не вступили в S- период. Наконец, снова появляются меченые делящиеся клетки – это те, которые вступили в деление уже второй раз. Если построить график встречаемости меченых митозов (
рис
. 39), то получится многовершинная кривая: точки между соседними вершинами будут отражать полную длительность времени от деления до деления клетки – длительность клеточного цикла. Время от начала эксперимента до появления первых меченых митозов – это время интерфазы после S-периода, постсинтетический период или, как принято его обозначать,
G
2
–период.
Оказалось, что S-периоду предшествует пресинтетический период, G
1
–
период, отрезок времени, предшествующий началу синтеза ДНК. Зная длительность клеточного синтеза, по проценту меченых клеток при импульсном введении меченого предшественника можно рассчитать длительность S- периода. Так, например, при времени Т, равным 20 часам, среди клеток встречается до 30% клеток, меченных
3
H -тимином, из чего следует, что
88

длительность S-периода занимает около 7 часов. Таким образом, весь клеточный цикл состоит как бы из четырех отрезков времени: собственно митоз (М), пресинтетический (G
1
), синтетический (S) и постсинтетический (G
2
) периоды: T
= G
1
+ S = G
2
+ M.
Как было найдено, общая продолжительность как всего клеточного цикла, так и отдельных его отрезков (периодов) значительно варьируют не только у разных организмов, но и у клеток разных органов одного организма.
Таблица 2.
Длительность митотического цикла и его периодов (в часах)
Вид
Митоти-
Ческий цикл
Митоз
G
1
S
G
2
Вика посевная (20
о
С)
Боковые корни 18,1 1,0 3,7 8,0 5,4
Горох (22
о
) 19,3 2,3 6,7 8,0 2,3
Кукуруза клетки периферии чехлика 22,5 2,2 6,3 6,7 7,3
Мышь
Эпителий тонкой кишки 18,75 1,0 9,5 7,5 0,75
Эпителий роговицы 72,0 0,75 - 8,50 4,0
L-клетки
(опухолевые фибробласты) 20,0 1,0 9-11 6-7 3-4
Кроветворные клетки 24,0 0,5-1 9,0 10 4,5 89

Существуют объекты с более коротким клеточным циклом . Так у некоторых дрожжей он занимает 1,5 часа, а при дроблении эмбриональных клеток амфибий
– 0,5 часа.
Различные периоды клеточного цикла отличаются друг от друга по общему содержанию в клетках белка, ДНК и РНК и по уровню (интенсивности) их синтеза.
В G
1
-периоде клетки имеют диплоидное содержание ДНК на ядро (2с), в S- периоде содержание ДНК колеблется от 2с до 4с, в G
2
-периоде содержание ДНК соответствует тетраплоидному (4с). Следовательно, если мы изучаем однородную популяцию клеток, то простым путем фотометрии ДНК в интерфазных клетках можно определить, в каком из периодов клеточного цикла находится та или иная клетка (
рис
. 40).
Количество РНК в клетках на разных этапах цикла также может меняться; в интенсивно делящихся клетках содержание РНК в течение интерфазы увеличивается по крайней мере в 2 раза. После деления в период G
1
поступают дочерние клетка, по объему и по общему содержанию белков и РНК вдвое меньшие, чем исходная родительская клетка. В это время начинается рост клеток, главным образом за счет накопления клеточных белков, что определяется увеличением количества РНК на клетку. Необходимо вспомнить, что в течение всего митоза (от поздней профазы до средней телофазы) в клетке синтез РНК полностью подавлен, поэтому накопление клеточных белков и РНК связано с возобновлением синтеза РНК в начале нового клеточного цикла. В S- периоде уровень синтеза РНК возрастает соответственно увеличению количества ДНК, достигает своего максимума в середине G
2
-периода. В конце
G
2
-периода или в профазе синтез РНК резко падает по мере конденсации митотических хромосом и снова полностью прекращается во время митоза.
Синтез белка во время митоза падает до 25% от исходного уровня и затем в последующих периодах достигает своего максимума в G
2
-периоде, в общем повторяя характер синтеза РНК.
90

Отдельные периоды интерфазы отличаются друг от друга не только общим содержанием и активностью синтезов ДНК, РНК и белка, но и характером синтезируемых РНК и белков.
Такое регулярное повторение последовательности клеточных циклов легко можно наблюдать во время прогрессивного роста клеток культуры ткани. В естественных условиях в растущих тканях растений и животных всегда есть клетки, которые находятся «вне цикла», не проходят регулярно из G
1
- в S-, затем в G
2
- и потом в M-фазу; такие клетки принято называть клетками G
0
-периода.
Именно эти клетки представляют собой так называемые покоящиеся, переставшие размножаться клетки. Под действием специфических белковых ростовых факторов или митогенов они могут снова вступать в клеточный цикл и начать делиться. В некоторых тканях такие клетки G
0
-фазы могут находиться длительное время, не изменяя особенно своих морфологических свойств: они сохраняют в принципе способность к делению, превращаясь в камбиальные, стволовые клетки (например, в кроветворной ткани). Чаще такая потеря (хотя бы и временная) способности делиться сопровождается специализацией, дифференцировкой клеток. В этом случае дифференцирующиеся клетки выходят из цикла, но в особых условиях могут снова входить в цикл. Так, например, большинство клеток печени находится в G
0
-периоде; они не участвуют в синтезе ДНК и не делятся. Однако если произвести удаление части печени, то многие клетки начинают подготовку к митозу (G
1
-период), переходят к синтезу ДНК и могут митотически делиться. В других органах, выходя из клеточного цикла, клетки необратимо дифференцируются и теряют способность к делению навсегда. Так происходит с нейронами: нейробласты, эмбриональные нервные клетки, после нескольких циклов клеточного деления теряют способность размножаться, дифференцируются и остаются в этом состоянии до конца жизни организма.
Следует отметить особо, что у многоклеточных зрелых организмов заведомо большая часть клеток находится в G
0
-фазе. Прохождение клетками клеточного
91

цикла как в интенсивно размножающихся популяциях, так и в клетках стимулированных к размножению, регулируется целой сложной системой циклирующих белков, от активности которых зависит прохождение каждой из стадий клеточного цикла (см. ниже, глава
).
Эндорепродукция и полиплоидия
Если делящиеся клетки на некоторое время охладить или обработать их каким-либо веществом, разрушающим микротрубочки веретена (например, колхицином), то деление клеток прекратится. При этом исчезнет веретено, а хромосомы без расхождения к полюсам будут продолжать цикл своих превращений: они начнут набухать, одеваться ядерной оболочкой. Так возникают за счет объединения всех неразошедшихся наборов хромосом крупные новые ядра. Они, естественно будут содержать вначале 4n число хроматид и соответственно 4c количество ДНК. По определению, это уже не диплоидная, а тетраплоидная клетка. Такие полиплоидные клетки могут из стадии G
1
переходить в S-период и, если убрать колхицин, снова делиться митотическим путем, давая уже потомков с 4n числом хромосом. В результате можно получить полиплоидные клеточные линии разной величины плоидности
(4n, 8n, 16n и т.д.). Этот прием часто используется для получения полиплоидных растений.
Как оказалось, во многих органах и тканях нормальных диплоидных организмов животных и растений встречаются клетки с крупными ядрами, количество ДНК в которых кратно больше 2n. При делении таких клеток видно, что количество хромосом у них также кратно увеличено по сравнению с обычными диплоидными клетками. Эти клетки являются результатом соматической полиплоидии. Часто это явление называют эндорепродукцией - появление клеток с увеличенным содержанием ДНК. Появление подобных клеток происходит в результате отсутствия в целом или незавершенности отдельных этапов митоза. Существует несколько точек в процессе митоза,
92

блокада которых приведет к его остановке и к появлению полиплоидных клеток.
Блок может наступить при переходе от G
2
-периода к собственно митозу, остановка может произойти в профазе и метафазе, в последнем случае часто происходит нарушение целостности веретена деления. Наконец, нарушения цитотомии также могут прекратить деление, что приведет к появлению двуядерных и полиплоидных клеток.
При естественной блокаде митоза в самом его начале, при переходе G
2
в профазу, клетки приступают к следующему циклу репликации, который приведет к прогрессивному увеличению количества ДНК в ядре. При этом не наблюдается никаких морфологических особенностей таких ядер, кроме их больших размеров. При увеличении ядер в них не выявляются хромосомы митотического типа.
Часто такой тип эндорепродукции без митотической конденсации хромосом встречается у беспозвоночных животных, обнаруживается он также и у позвоночных животных, и у растений.
У беспозвоночных в результате блока митоза степень полиплоидии может достигать огромных значений. Так, в гигантских нейронах моллюска тритонии, ядра которых достигают величины до 1 мм (!), содержится более 2 х 10 5 гаплоидных наборов ДНК. У некоторых беспозвоночных гигантские железистые и нервные клетки в результате 18-20 циклов эндоредупликации могут содержать
2097152c ДНК.
Другим примером гигантской полиплоидной клетки, образовавшейся в результате редупликации ДНК без вступления клеток в митоз, может служить клетка шелкоотделительной железы тутового шелкопряда. Ее ядро имеет причудливую ветвистую форму и может содержать огромные количества ДНК.
Гигантские клетки железы пищевода аскариды могут содержать до 100000c
ДНК.
Особый случай эндорепродукции представляет собой увеличение плоидности путем политении.
93

При политении в S-периоде при репликации ДНК новые дочерние хромосомы продолжают оставаться в деспирализованном состоянии, но располагаются друг около друга, не расходятся и не претерпевают митотическую конденсацию (
рис
41). В таком истинно интерфазном виде хромосомы снова вступают в следующий цикл репликации, снова удваиваются и не расходятся. Постепенно в результате репликации и нерасхождения хромосомных нитей образуется многонитчатая, политенная структура хромосомы интерфазного ядра.
Последнее обстоятельство необходимо подчеркнуть, так как такие гигантские политенные хромосомы никогда не участвуют в митозе, более того - это истинно интерфазные хромосомы, участвующие в синтезе ДНК и РНК.
От митотических хромосом они резко отличаются и по размерам: они в несколько раз тоще митотических хромосом из-за того, что состоят из пучка множественных неразошедшихся хроматид - по объему политенные хромосомы дрозофилы в 1000 раз больше митотических. Они в 70-250 раз длиннее митотических из-за того, что в интерфазном состоянии хромосомы менее конденсированы (спирализованы), чем митотические хромосомы (
рис
. 42).
Кроме того, у двукрылых их общее число в клетках равно гаплоидному из-за того, что при политенизации происходит объединение, конъюгация гомологичных хромосом. Так, у дрозофилы в диплоидной соматической клетке
8 хромосом, а в гигантской клетке слюнной железы - 4.
Встречаются гигантские полиплоидные ядра с политенными хромосомами у некоторых личинок двукрылых насекомых в клетках слюнных желез, кишечника, мальпигиевых сосудов, жирового тела и т.д. Кроме того, политенные хромосомы встречаются в ядрах синергид некоторых луков, в ядрах антипод аконита и пшеницы. Описаны политенные хромосомы в макронуклеусе инфузории стилонихии.
Лучше всего этот тип эндорепродукции изучен у насекомых. Было подсчитано, что у дрозофилы в клетках слюнных желез может произойти до 6-8 циклов редупликации, что приведет к общей плоидности клетки, равной 1024. У
94

некоторых хирономид (их личинку называют мотылем) плоидность в этих клетках достигает 8000-32 000. В клетках политенные хромосомы начинают быть видны после достижения политении в 64-128n, до этого такие ядра ничем, кроме размера, не отличаются от окружающих диплоидных ядер.
Отличаются политенные хромосомы и своим строением: они структурно неоднородны по длине, состоят из дисков, междисковых участков и пуфов (
рис
43). Рисунок расположения дисков строго характерен для каждой хромосомы и отличается даже у близких видов животных.
Диски представляют собой участки конденсированного хроматина. Если на одной интерфазной хромосоме участки конденсированного хроматина будут выглядеть как глобулярные сгустки (хромомеры), то при латеральном расположении множества одинаковых интерфазных хромосом эти отдельные участки выстроятся в диск, лежащий поперек хромосомы.
Хромомерное строение дисков политенных хромосом отчетливо проявляется при искусственной деконденсации этих хромосом растворами с низким содержанием двухвалентных катионов. При этом диски (особенно мелкие) распадаются на ряд хромомеров (0.2-0,3 мкм), от которых радиально отходят фибриллы ДНП, подобно тому, что наблюдается при такой же деконденсации митотических хромосом и хроматина интерфазных ядер.
Диски могут отличаться друг от друга по толщине. Общее их число у политенных хромосом хирономид достигает 1,5-2,5 тыс. У дрозофилы имеется около 5 тыс. дисков.
Диски разделены междисковыми пространствами, состоящими, так же как и диски, из фибрилл хроматина, только более рыхло упакованных (
рис.
30б).
На политенных хромосомах двукрылых часто видны вздутия, пуфы.
Оказалось, что пуфы возникают на местах некоторых дисков за счет их деконденсации и разрыхления. В пуфах выявляется РНК, которая там же и синтезируется. Следовательно, пуф является местом транскрипции на этих
95

интерфазных хромосомах, а диски представляют собой экспрессированные хромосомные участки.
Рисунок расположения и чередования дисков на политенных хромосомах постоянен и не зависит ни от органа, ни от возраста животного. Это является хорошей иллюстрацией одинаковости качества генетической информации в каждой клетке организма (
рис
. 43).
Однако в расположении пуфов такой однозначности нет. Пуфы являются временными образованиями на хромосомах, и в процессе развития организма существует определенная последовательность в их появлении и исчезновении на генетически различных участках хромосомы (
рис.
44). Эта последовательность различна для разных тканей. Сейчас доказано, что образование пуфов на политенных хромосомах - это выражение генной активности: в пуфах синтезируются РНК, необходимые для проведения белковых синтезов на разных этапах развития насекомого. Оказалось, что можно вызывать специфическую индукцию активности пуфов. Так, на определенной стадии развития личинки гормон экдизон вызывает активацию специфических пуфов, что предшествует линьке. Если же этот гормон ввести на другой стадии развития, то в этом случае активируется тот же пуф, хотя на этой стадии он в норме не функционирует.
В естественных условиях у двукрылых особенно активны в отношении синтеза РНК два самых крупных пуфа, так называемые кольца Бальбиани, который описал их 100 лет тому назад. Совсем недавно с помощью микроманипулятора удалось выделить кольца в достаточном количестве, чтобы определить тип их РНК. Это оказалась информационная РНК с гигантским мол. весом (70 тыс. нуклеотидов), кодирующая образование секреторных белков слюнных желез. Эта же РНК была выделена из полисом цитоплазмы. Размер гранул РНП, которые образуются в кольцах (пуфах) Бальбиани, достигает 40-60 нм.
96

Долгое время неясной оставалась природа междисковых участков в политенных хромосомах. Однако была выдвинута гипотеза, что в междисковых участках могут также располагаться гены, которые находятся в деконденсированном состоянии, в отличие от генов в дисках, где они неактивны.
Это предположение в последнее время получило ряд подтверждений. Так, в междисковых участках были обнаружены гранулы и фибриллы РНП такой же морфологии, как и в мелких пуфах. В междисковых участках зарегистрировано слабое включение в РНК, там с помощью иммунохимических методов удалось локализовать РНК-полимеразу и ДНК-РНК комплексы, что указывает на участие междисковых зон в синтезе РНК. Характер этой РНК совсем неясен, возможно, что это РНК генов, работа которых в клетке необходима постоянно, генов, которые кодируют белки основного метаболизма клетки, белки "для домашнего хозяйства". Информация же, необходимая для специализации, дифференцировки, в таком случае должна поступать от пуфов.
Так как расположение дисков на хромосомах зависит только от видовой специфики, то удалось с помощью генетических методов локализовать целый ряд генов и нанести их на морфологических картах хромосом. Отдельный диск может быть вместилищем одного или нескольких генов. Однако целый ряд признаков удалось локализовать в определенных участках хромосом.
Как уже указывалось, гигантские хромосомы встречаются в некоторых клетках зародышевых тканей растений. Такие гигантские хромосомы были описаны, например, у фасоли и ячменя. Это толстые короткие хромосомы, во много десятков раз превосходящие по объему митотические хромосомы. В антиподиальных клетках ячменя в огромных ядрах видны 7 (гаплоидное число) хромосом, которые претерпели до 20 циклов репликации. Однако общая их организация резко отлична от таковой у двукрылых насекомых. Во-первых, в данном случае нет разделения тела хромосомы на диски и междисковые участки, во-вторых, нет пуфов. Все РНП-продукты равномерно расположены вдоль хроматиновых участков. Хроматин же этих гигантских хромосом обладает
97

типичной хромонемной организацией, характерной для интерфазных ядер этого объекта (
рис
. 45).
Итак, мы разобрали два случая, два способа образования полиплоидных клеток, возникающих при блокаде вступления их в митотическое деление.
В других случаях эндорепродукции полиплоидные клетки возникают в результате нарушений аппарата деления - веретена: при этом происходит митотическая конденсация хромосом. Такое явление носит название эндомитоз, потому что конденсация хромосом и их изменения происходят внутри ядра, без исчезновения ядерной оболочки (
рис
. 46).
Впервые явление эндомитоза было хорошо изучено в клетках различных тканей водяного клопа - геррии. В начале эндомитоза хромосомы конденсируются, благодаря чему становятся хорошо различимы внутри ядра, затем хроматиды обособляются, вытягиваются. Эти стадии по состоянию хромосом могут соответствовать профазе и метафазе обычного митоза. Затем хромосомы в таких ядрах исчезают, и ядро принимает вид обычного интерфазного ядра, но размер его увеличивается в соответствии с увеличением плоидности. После очередной редупликации ДНК такой цикл эндомитоза повторяется. В результате могут возникнуть полиплоидные (32n) и даже гигантские ядра.
Сходный тип эндомитоза описан при развитии макронуклеусов у некоторых инфузорий, у целого ряда растений. Так, в клетках клубней картофеля хромосомы практически все время находятся в спирализованном состоянии, время собственно интерфазы здесь значительно укорочено.
Следующий вариант появления полиплоидных клеток связан с отсутствием веретена на стадии метафазы: при этом происходит слияние двух хромосомных наборов, как в случае применения колхицина.
Иной процесс появления полиплоидных соматических клеток в результате блокады деления клеточного тела подробно изучен на клетках млекопитающих.
Было обнаружено, что в печени взрослых, и особенно стареющих, крыс и
98

мышей встречаются кроме диплоидных тетра- и октоплоидные клетки, а также двуядерные клетки разной степени плоидности. Оказалось, что в этом случае процесс полиплоидизации клеток можно описать следующим образом (
рис.
47).
После S-периода клетки, обладающие 4c количеством ДНК, вступают в митотическое деление, проходят все его стадии, включая телофазу, но не приступают к цитотомии. Таким образом, образуется двуядерная клетка (2 х 2n).
Она может снова пройти S-период, в результате чего оба ядра в такой клетке станут содержать по 4c ДНК и 4n хромосом. Такая двуядерная клетка входит в митоз, на стадии метафазы происходит объединение хромосомных наборов
(общее число хромосом равно 8n), а затем нормальное деление, в результате которого образуются две тетраплоидные клетки. Процесс попеременного появления двуядерных и одноядерных клеток может привести к появлению ядер с 8n, 16n и даже 32n количеством хромосом. Таким способом образуются полиплоидные клетки в печени, в эпителии мочевого пузыря, в пигментном эпителии сетчатки, в ацинарных отделах слюнной и поджелудочной желез, на ранних стадиях образования мегакариоцитов и др.
В целом ряде случаев процессы эндорепродукции используются организмом как для построения тканей, так и для их функционирования. В чем же биологический смысл этого явления? Необходимо отметить, что соматическая полиплоидизация встречается на терминальных участках пути развития клеток, тканей и организмов, она большей частью характерна для специализированных, дифференцированных клеток и не встречается при генеративных процессах, таких, как эмбриогенез (исключая провизорные органы) и образование половых клеток, нет полиплоидии среди стволовых клеток. Действительно, гигантские полиплоидные клетки в деление не вступают; клетки с политенными хромосомами также не делятся и в процессе метаморфоза насекомых лизируются. Многоядерные и полиплоидные клетки у млекопитающих встречаются главным образом у стареющих организмов.
99

По-видимому, главным результатом соматической полиплоидии является увеличение размера клеток и тем самым увеличение их продуктивности.
Пространственное расположение хромосом в интерфазном ядре
Представление о том, что митотические хромосомы после деления клеток превращаются в хроматин интерфазного ядра, не теряют своей целостности (не распадаются на фрагменты), а сохраняют свою физическую индивидуальность, переходя лишь в разрыхленное, деконденсированное состояние, было высказано
Т. Бовери еще в 1887 г. Эти представления получили название теории непрерывности хромосом, которая гласит: хромосомы, вошедшие в состав дочернего ядра в телофазе, сохраняются в нем хотя бы и в очень измененном виде в качестве индивидуальных структур и появляются снова в собственном смысле слова в следующей профазе.
Основой для этого вывода послужило наблюдение Е. Бовери за поведением хромосом в дробящихся яйцах одного из видов аскариды (Ascaris megalocephala
univaiens), в клетке которой всего две хромосомы. Было обнаружено, что в профазе первых двух делений зиготы хромосомы вновь обнаруживаются в местах бывших телофазных хромосом предыдущего деления, повторяя их форму и локализацию (
рис.
48). Конечно эти наблюдения не могут служить прямым доказательством этой теории, но являются основой для высказывания предположения о судьбе хромосом в клеточном цикле. Однако, кроме этого наблюдения существует целая серия косвенных данных, говорящих в пользу теории непрерывности хромосом. Вот некоторые из них.
Было найдено, что в интерфазных ядрах целого ряда объектов удается регистрировать отдельные специфические участки, аналогичные по своим свойствам теломерам и центромерам митотических хромосом. Так, например, у некоторых луков все хромосомы имеют постоянно конденсированные участки на теломерах (
рис.
49). Эти теломеры митотических хромосом обладают свойством окрашиваться как C-сегмент. В интерфазных ядрах этих видов также обнаруживаются C-положительные зоны, в количестве вдвое меньшем, чем
100

число плечей митотических хромосом, вероятно, за счет того, что в интерфазе эти теломерные участки соседних хромосом могут ассоциировать друг с другом.
Интересно, что в интерфазном ядре эти участки располагаются на одном из полюсов, как бы повторяя теломерную ориентацию хромосом в митозе.
Подобным же образом можно наблюдать в интерфазных ядрах центромерные участки хромосом. Так у мыши центромеры всех акроцентрических хромосом интенсивно окрашиваются по методике выявления C-сегментов (
рис.
50). Таким же свойством обладают связанные с периферией ядра плотные участки интерфазного хроматина - хромоцентры. Показано, что эти участки по своей молекулярной композиции аналогичны центромерным участкам митотических хромосом.
Наконец, в интерфазных клетках можно наблюдать целые отдельные хромосомы; например, одну из X-хромосом самок млекопитающих. Правда, такие целиком конденсированные хромосомы (тельца Барра) не обладают общей морфологией митотических хромосом, но по объему и количеству ДНК полностью соответствуют X-хромосоме в митозе. У пашенной полевки
(Microtus agrestis) Х половые хромосомы обладают способностью целиком интенсивно окрашиваться по C-методике. В интерфазных ядрах различных клеток этого животного можно с помощью этой же окраски видеть два больших блока интенсивно окрашенного хроматина в клетках самок.
Каково же пространственное расположение отдельных деконденсированных интерфазных хромосом в трехмерном объеме клеточного ядра? Существует ли какой-либо порядок в размещении хромосом в интерфазном ядре или же они хаотически разбросаны внутри ядра? Первые исследования о порядке расположения хромосом внутри ядра принадлежат К. Раблю (1885), который изучая профазные ядра растений, предположил, что внутри ядра хромосомы повторяют свою анафазную ориентацию (центромеры - на одном полюсе, теломеры на другом) в течение всего клеточного цикла.
101

В пользу этого говорит расположение в интерфазном ядре центромерных и теломерных участков деконденсированных хромосом. Но особенно демонстративно это положение было показано при изучении пространственной локализации политенных хромосом. С помощью послойных оптических разрезов, используя компьютерную технику воспроизведения изображения, удалось создать объемную стереоскопическую реконструкцию интерфазного ядра и проследить в его трехмерном пространстве каждую из четырех гигантских политенных хромосом (
рис.
51). Было обнаружено, что действительно в объеме ядер хромосомы располагаются повторяя ана- телофазную ориентацию (т.н. ориентацию по Раблю). При этом каждое плечо хромосомы занимает определенную зону, объем которой не заходит в объем соседних хромосом, хотя они расположены тесно друг с другом. Каждая из хромосом образует пологую правую спираль (5-7 витков), которая в нескольких местах связана с ядерной оболочкой, как бы фиксируясь на ней. Фиксированы на ядерной оболочке и теломерные участки всех хромосом, которые располагаются на одном из полюсов интерфазного ядра. На противоположном полюсе ядра также в связи с ядерной оболочкой располагаются центромерные районы хромосом, часто объединенные в один хромоцентр - крупный блок интерфазного хроматина.
Прямые наблюдения за локализацией в ядре интерфазных хромосом были сделаны используя метод FISH (флуоресцентная in situ гибридизация нуклеиновых кислот) в сочетании с конфокальной микроскопией. Вначале были выделены индивидуальные митотические хромосомы, из них были получены
ДНК, которые метились разными флуорохромами. Такие меченые хромосомные
ДНК наносились на препараты интерфазных ядер, ДНК которых была предварительно денатурирована. В результате молекулярной гибридизации флуоресцирующая ДНК ренатурировала только со сходной хромосомой. С помощью конфокального микроскопа просматривалась флуоресцентная метка в трехмерном пространстве интерфазного ядра. Было обнаружено, что
102

интерфазное ядро состоит из тесно расположенных хромосомных территорий, объем которых значительно превосходил объем митотических хромосом.
Некоторые особенно крупные хромосомы действительно проявляли ана- телофазную ориентацию.
Суммируя общие представления о формах организации хромосом можно прийти к заключению, что они могут находиться в двух альтернативных состояниях, в двух морфологических выражениях: 1 - максимально конденсированное, компактное, метаболически неактивное, транспортное состояние, предназначенное для того, чтобы в минимальном объеме без структурных нарушений перенести во время клеточного деления огромные по длине молекулы ДНК; 2 - деконденсированное, при котором линейная длина развернутых хромосом увеличивается в десятки, а иногда и в сотни раз, метаболически активное состояние, связанное с синтезом ДНК и РНК
(интерфаза).
Отличительной особенностью интерфазной хромосомы от митотической, кроме всего, является то, что по своей длине она может быть деконденсирована, развернута неравномерно - есть участки полной деконденсации и есть участки, находящиеся в плотном, деконденсированном и, соответственно, в неактивном состоянии. Это и придает интерфазному ядру своеобразную структуру, где хромосомы - хроматин - могут быть представлены то плотными блоками, то участками рыхлого, деконденсированного хроматина (
рис.
52).