Микроскопический метод исследования. Приготовление нативных и фиксированных препаратов. Окраска по Граму.. Практика-2-Микроскоп-м-д-исслед-Пригот-фикс-препаратов-. Занятие Микроскопический метод исследования. Приготовление нативных и фиксированных препаратов. Окраска по Граму
 Скачать 20.21 Kb.
|
|
Практическое занятие № 2. Микроскопический метод исследования. Приготовление нативных и фиксированных препаратов. Окраска по Граму. Для изучения морфологии микроорганизмов применяют микроскопический метод исследования. Важным условием успешного использования этого метода является правильное приготовление мазка из исследуемого материала или бактериальной культуры. Культурой называются микроорганизмы, выделенные из биоматериала от больных людей, выращенные на питательных средах в лабораторных условиях. Исследование микробов в живом состоянии (нативные препараты). Многие микроорганизмы в живом состоянии способны передвигаться. Скорость и характер движения зависят от возраста культуры, окружающей среды и вида микроба. Хорошо выражена подвижность у молодых особей, у старых она замедлена или совсем отсутствует. Подвижность прекращается с накоплением продуктов жизнедеятельности. Наличие или отсутствие движения - одно из признаков при определении вида микробов. Органами передвижения являются жгутики, которые осуществляют вращательные движения и по-разному располагаются на теле микробной клетки. В зависимости от их расположения все микробы делятся на монотрихи (один полярный жгутик), амфитрихи (жгутики имеются на обоих концах - по одному или несколько), лофотрихи (пучок жгутиков расположен на одном из концов микробной клетки) и перитрихи (жгутики находятся на всей поверхности микробной клетки). Для определения подвижности у микробов берут молодые (12 - 24-часовые) культуры. Готовят препараты - «висячая капля» и «раздавленная капля». Приготовление препарата «висячая капля». Висячую каплю готовят на предметном стекле с углублением (луночкой). Край луночки смазывают тонким слоем вазелина, на покровное стекло наносят микроорганизмы. Покровное стекло быстро переворачивают и аккуратно опускают на предметное так, чтобы капля оказалась в центре углубления. В таком препарате капля «подвешена» с внутренней поверхности покровного стекла и находится в герметической влажной камере. Это позволяет наблюдать за движением микробов в течение длительного времени. Препарат микроскопируют с помощью фазово-контрастного микроскопа или в затемненном поле светового микроскопа (сужают диафрагму), что увеличивает контрастность неокрашенных форм. Приготовление препарата «раздавленная капля». Препарат готовят на обычном предметном стекле. Для этого на его поверхность наносят каплю культуры микробов, покрывают покровным стеклом и рассматривают при тех же условиях, что и висячую. Приготовление и фиксированных препаратов. Материал для исследования наносят на предметное стекло бактериальной петлей, или пастеровской пипеткой. Перед приготовлением мазка рабочую часть петли прожигают в пламени горелки в вертикальном положении (стерилизация в пламени горелки называется фламбированием): сначала саму петлю, а затем металлический стержень. Эту манипуляцию проводят и после окончания приготовления мазка. Приготовление мазка из биоматериала. На предметное стекло, помещенное на подставку (чашку Петри, штатив), наносят культуру. Пробирку с биоматериалом держат большим и указательным пальцами левой руки. Петлю держат в правой руке. Не выпуская петли, мизинцем правой руки прижимают пробку к ладони и осторожно вынимают ее из пробирки. Движения должны быть плавными и спокойными. Горло пробирки обжигают в пламени горелки. Вводят петлю в пробирку. Охлаждают петлю о стенку пробирки и затем погружают ее в культуру. Вынимают петлю, не касаясь ею стенок пробирки. Закрывают пробку, предварительно проведя ее через пламя горелки. Ставят пробирку в штатив. Петлей наносят культуру на предметное стекло, круговыми движениями равномерно распределяя ее. Затем петлю прожигают в пламени горелки. Приготовление мазка из культуры, выращенной на плотной питательной среде. На подготовленное предметное стекло наносят пастеровской пипеткой или петлей каплю изотонического раствора натрия хлорида (0,9%). Культуру осторожно снимают петлей с агара в пробирке или чашке Петри и эмульгируют в капле на стекле. Приготовленный мазок должен быть равномерным и не густым. При его высыхании на предметном стекле остается слабый налет. Приготовление мазка из гноя или мокроты. Материал забирают стерильной пипеткой или петлей и наносят на середину предметного стекла. Вторым предметным стеклом покрывают первое так, чтобы свободными остались треть первого и второго стекол. Стекла с усилием раздвигают в стороны. Получают два больших мазка. Приготовление мазка из крови. Каплю крови наносят на предметное стекло на расстоянии одной трети от левого края. Затем краем специально отшлифованного стекла, наклонив его под углом 45°, прикасаются к капле крови. Прижимая отшлифованное стекло к предметному продвигают его вперед. Правильно приготовленный мазок имеет желтоватый цвет и просвечивает. Высушивание мазка. Мазок оставляют для высыхания. Фиксация мазка Мазки фиксируют после полного высыхания с целью: 1) закрепить микроорганизмы на стекле; 2) обезвредить материал; 3) убитые микроорганизмы лучше воспринимают окраску. Фиксированный мазок называется препаратом. Способы фиксации. 1. Физический - в пламени горелки: стекло берут пинцетом или большим и указательным пальцами и троекратно проводят через верхнюю часть пламени горелки в течение 6 с. 2. Химический - в жидкости: клеточные элементы в мазках из крови и мазках-отпечатках при действии высоких температур разрушаются, поэтому их обрабатывают одной из фиксирующих жидкостей: а) метиловым спиртом5 мин; б) этиловым спиртом - 10 мин; в) смесью Никифорова - 10-15 мин; г) ацетоном - 5 мин; д) парами кислоты и формалина - несколько секунд. Окраска препаратов по Граму. После фиксации приступают к окраске препарата. Окраску препаратов производят на специально оборудованном столе. Отношение микроорганизмов к красителям называется их тинкториальными свойствами. В микробиологии широко используют анилиновые красители. Большинство микроорганизмов лучше воспринимает основные красители. Наиболее употребительны следующие красители: красные (фуксин основной, фуксин кислый, конго красный, нейтральный красный); синие (метиленовый и толуидиновый); фиолетовые (генциановый, метиловый, кристаллический); коричнево-желтые (везувин, хризоидин); зеленые (бриллиантовый, малахитовый). Все красители выпускают в виде аморфных или кристаллических порошков. Из них готовят насыщенные спиртовые и феноловые растворы, а затем для работы используют водно-спиртовые или водно-феноловые растворы красителей. Если при окраске используют концентрированные растворы красителей, то препарат предварительно накрывают фильтровальной бумагой, на которую наносят краситель. При этом кусочки красителя остаются на бумаге. Внимание! Каплю красителя наносят пипеткой так, чтобы он покрыл весь препарат. Красители и растворы для окраски по Граму. 1. Генцианвиолет (для окраски по Граму): насыщенного спиртового раствора генцианового фиолетового - 10 мл карболовой кислоты 5% - 100 мл Растворы смешивают и фильтруют через бумажный фильтр. 2. Раствор Люголя (для окраски по Граму и реактив на крахмал): йодида калия - 2 г кристаллического йода - 1 г дистиллированной воды - 10 мл Смесь помещают в бутыль матового стекла, хорошо закупоривают и ставят на сутки в термостат, затем добавляют 300 мл дистиллированной воды. 3. Спирт с йодом для обесцвечивания. 4. Фуксин. Красящие бумажки по Синеву (для окраски по Граму) более удобны в использовании: полоски фильтровальной бумаги пропитывают раствором генцианвиолета и фуксина и высушивают. Окраска по Граму (универсальный метод). Наиболее распространенным методом дифференциальной окраски является окраска по Граму. В зависимости от результатов окраски все микроорганизмы делят на две группы - грамположительные и грамотрицательные. Грамположительные бактерии содержат в клеточной стенке муреин, которых образует комплексное соединение с йодом и основным красителем (генциановым). Этот комплекс не разрушается при действии спирта, и бактерии сохраняют фиолетовый цвет. Грамотрицательные бактерии не способны удержать основной краситель. Под действием спирта краситель вымывается, клетки обесцвечиваются и окрашиваются дополнительным красителем (фуксином) в красный цвет. Методика окраски по Граму. Препарат помещают на подставку для окраски, исследуемым материалом вверх. 1. На препарат накладывают бумажку по Синеву с генцианвиолетом и наносят несколько капель воды. Окрашивают 1,5-2 мин. Снимают бумагу. Стряхивают в ванночку избыток жидкости. 2. Не промывая водой, наносят раствор Люголя до почернения (1,5 мин), затем краситель сливают. Стряхивают в ванночку избыток жидкости. 3. Не промывая водой, наносят 96% спирт до отхождения красителя (30 с). 4. На препарат накладывают бумажку по Синеву с фуксином и наносят несколько капель воды. Окрашивают 1,5-2 мин. Снимают бумагу. Стряхивают в ванночку избыток жидкости. 5. Промывают препарат водой до «чистых промывных вод» (меняя воду в химическом стакане пока она после опускания препарата не будет оставаться чистой) и высушивают. Микроскопируют с помощью иммерсионной системы светового микроскопа. При микроскопии Определяют морфологию одиночной клетки; Окраску по Граму; Характерный тип скоплений. Заносят полученные данные в журнал и приступают к бактериологическому исследованию. |