Иммунология. ИММУНОЛОГИЯ 2. Занятие 1 4 Нсттест
 Скачать 23.95 Kb.
|
|
Занятие № 1 № 4 Нст-тест Важнейшей характеристикой функции гранулоцитов является оценка их фагоцитарной активности.Ее снижение может быть результатом как недостаточности опсонизирующих факторов сыворотки,так и дефектов самих клеток.(нарушения двигательной и метаболической активности врожденного или приобретенного характера).Для определения фагоцитарной активности используют стандартные штаммы непатогенных микроорганизмов (например стафилококки штамма 209,убитые бактериями, или аутофлора больного). Тест с нитросиним тетразолием используется для выявления так называемых активированных гранулацитов и моноцитов. В основе активации фагоцитов лежит резкое усиление окислительных реакций. К числу индикаторов этого явления относятся НСТ-тест. Поглощенные из раствора НСТ под влиянием окислительных процессов в клетке превращается в нерастворимый формазан. Последний определяется в клетке в виде темно-синих гранул. Различают спонтанный и стимулированный НСТ-тест. Результаты спонтанного теста указывают на количество активированных клеток по крови больного, например под влиянием инфекции. Результаты стимулированного теста дают представление о способности исследуемых нейтрофилов к активации in vitro. Этот тест следует проводить при сниженном числе спонтанных НСТ-положительных клеток у больного, чтобы выявить наличие или отсутствие окислительного метаболизма. Методика исследования Необходимые реактивы и материалы. КН42ОРО44О, На42ОРО44О,NaCl,глюкоза, НСТ, гепарин, спирт, однопроцентный водный раствор метиленового зеленого, микропипетки, микроскоп. Приготовление раствораа. Один процент 15м фосфатного буфера с рН 7,2 и 0,6 % раствора натрия хлора. б. 0,1 % НСТ в изотоническом растворе натрия-хлора. Для получения красителя необходимо длительное перемешивание и подогревание в горячей воде. Растворы а. и б. фильтруют через бумажные фильтры и хранят в холодильнике при температуре 10 с в течение 2-4 недель. Непосредственно перед установкой теста смешивают равное количество растворов а и б, смесь нагревают до 30-37 с. Кровь из пальца больного берут пипеткой, промытой гепарином. В центрифужной пробирке смешивают 0,1 мл крови и подогретой смеси. Инкубация 25 мин в термостате при 37 с , затем 10 мин при комнатной температуре. Из верхнего слоя клеточного осадка готовят мазки, высушивают на воздухе 3-5 мин, фиксируют СН3-ОН затем окрашивают метиленовым зеленым в течение 10 мин. Препараты просматривают под микроскопом с иммерсией. Постановка стимулированного нст-теста. Гипарнизированную кровь инкубируют со стимулятором (двух миллиардная взвесь стафилококка - штамм 209 и др.) в равных количествах. Затем проводят вышеописанный тест. Учет результатов В клинико-лабораторной практике при постановке теста распространение получил цитохимический учет результатов, основанный на микроскопическом определении процентного содержания нейтрофилов с гранулами формазана в цитоплазме. Обычно анализу подвергают 100-200 сегментоядерных нейтрофилов. Показатель индуцированного варианта реакции вычисляют как разницу процентного содержания поглотивших и восстановивших тетразолей клеток после действия фактора стимуляции по сравнению с данными, полученными до стимуляции. Для количественной оценки активности теста все клетки делят на 4 группы. К нулевой группе относят нейтрофилы без гранул, в первую группу включают клетки с единичными гранулами или в которых площадь окраски занимает от 25 до 30%. Во вторую группу относят нейтрофилы цитоплазма которых на 30-70% занята гранулами формазана (2степ активность), в третью - нейтрофилы до 100% заполненные гранулами. Определяют число клеток, принадлежащих в зависимости от активности ферментов к каждому из типов. Это число умножают на номер типа. Сумма полученных произведений - показатель реакции. Показатель НСТ-теста = 1а+2б+3с, где а, б, с -количество клеток соответственного типа. Фагоцитарный индекс Уровень активности фагоцитарных клеток называют фагоцитарным индексом. Процесс фагоцитоза лежит в основе защитных функций лейкоцитов и заключается в способности этих клеток крови распознавать, «убивать», «переваривать» и поглощать чужеродные агенты. Исследование системы фагоцитоза важно для диагностирования иммуно-дефицитных состояний, характеризующихся: часто возобновляющимися гнойно-воспалительными процессами; длительно незаживающими ранами; злокачественными опухолями. Характеристика фагоцитоза является полезным инструментом для общеклинической диагностики, анализ так же назначают при: абсцессе легкого; послеоперационных осложнениях; до и после пересадки тканей или органа; обследовании перед сложной операцией; подозрении на аутоиммунные заболевания; иммуно-дефицитных состояниях, которые вызваны приемом лекарственных средств. Подготовка к анализу Биоматериалом для исследования служит кровь из вены, отбор проводится с 8 до 10 утра, пациенту желательно не завтракать, не курить, допускается пить воду. Перед исследованием нужно придерживаться некоторых правил: за сутки до анализа отменить спортивные тренировки; ужинать накануне следует не позднее 22 часов, желательно не переедать, не принимать спиртные напитки; хорошо отдохнуть и не нервничать. Интерпретация полученных результатов анализа Количество фагоцитирующих нейтрофилов определяется процентным соотношением от общего количества нейтрофилов. Нормальные показатели: от 83 до 88%. Количество фагоцитирующих моноцитов так же определяется процентным соотношением от общего количества моноцитов. Нормальные показатели: от 72 до 82%. Фагоцитарная активность клеток, как правило, становится выше в начале воспалительных процессов. Снижение уровня активности приводит к перерождению острого воспалительного процесса в хронический, потому что при этом происходит нарушение функции разрушения и выведения иммунных комплементов из организма. Снижение уровня наблюдается при: паразитарных инвазиях - заражение эхинококками и кандидами; гнойных воспалительных процессах; длительно незаживающих ранах; послеоперационных осложнениях; лучевой терапии и химио-терапии; хроническом гранулематозе. Данные фагоцитарного индекса позволяют оценить запас возможностей организма для борьбы с чужеродными агентами. Фагоцитарное число Фагоцитарное число (ФЧ) — среднее число микробов, поглощенных одним нейтрофилом (частное от деления общего числа поглощенных бактерий (ЧП) на число клеток, вступивших в фагоцитоз (ФП)). Характеризует поглотительную способность нейтрофилов. Норма: 6-14 у. е. Реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) Реакция ставится с целью выявления лимфоцитов, сенсибилизированных к предполагаемому антигену. Если антиген является специфичным в данной ситуации, то диффузия лимфоцитов будет минимальной. Такая положительная проба свидетельствует о наличии фактора ингибиции. Методика исследования Необходимые материалы и оборудование: среда 199, 10% раствор желатина, 5% инактивированная сыворотка человека, 0.35% раствор NaOH, тирс-буфер (рН 7,65), 0,4% раствор ЭДТА, центрифужные пробирки, центрифуга, термостат, пластмассовые капилляры длиной 7 мм и диаметром 0,6-0,7 мм. Венозную кровь смешивают с антикоагулянтом ЭДТА (рН 7.4). Эритроциты осаждают 10% раствором желатина, добавленным к крови из расчета 1:9. После отстаивания и осаждения эритроцитов при комнатной температуре в течение 40мии плазму, обогащенную лейкоцитами, осаждают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 7 мин. Осадок лейкоцитов ресуспензируют в 0,5 мл среды 199 с 5% инактивированной сывороткой человека, добавив 4,5 мл смеси, состоящей из 9частей 0,35% раствора NaOH и 1 части тирс-буфера (рН 7,65), для растворения эритроцитов. Лейкоциты отмывают и снова ресуспензируют в среде 199, содержащей 5% человеческой инактивированной сыворотки и 0,4% ЭДТА, затем готовят густую лейкоцитарную взвесь, которой заполняют пластмассовые капилляры длиной 7 мм и диаметром 0,6-0.7 мм Капилляр, заполненный лейкоцитарной взвесью, прикрепляют на дно лунки глубиной 20 мм, диаметром 15 мм, которая затем заполняется средой 199 с добавлением антибиотиков (пенициллин со стрептомицином по 10 000 ЕД на 1 мл среды и 5% инактивированной прогреванием при 56°С в течение часа человеческой сыворотки 1; можно также использовать сыворотку лошади, кролика, оспа и др. Лунки диаметром 1,5 мм расположены в пластинке из органического стекла (4 ряда по 4 лунки). Заполненные средой и капиллярами с исследуемыми лимфоцитами лунки закрывают крышкой, края которой смазывают вазелином для герметизации. Всю систему помещают в термостат при 37°С, Учет реакции производят под лупой с малым увеличением. Микрометром, размеченным в окуляре, измеряют ширину и длину площади миграции лимфоцитов, которая вырисовывается под увеличением в еще своего рода "дерева", стволом которого является капилляр, а кроной - лимфоциты, располагающиеся вокруг капилляра Регистрацию можно проводить с помощью планиметра и рисовального аппарата. Показатель торможения миграции выражают в процентах по сравнению с контролем (сравнивается площадь миграции). Уменьшение площади миграции свидетельствует о наличии фактора, ингибирующего ее. РТМЛ – позволяет косвенно судить о эфекторной функции лимфоцитов и отражает ГЗТ. Кроме того, функциональное состояние CD 4+ клеток. Тестируют по цитокиновому профилю, по функциональной способности синтезировать γ – ИФН, а Тх2 – синтезировать ИЛ – 4. Для CD 8 ЦТЛ – тест цитотоксичности – клетки мишени в т.ч. различные линии опухолевых клеток меченных радиоактивным изотопом, а по количеству высвобождаемого изотопа судят о величине цитотоксической активности лимфоцитов. Патология систем Т-клеточного иммунитета. Врождённая недостаточность Т-системы иммунитета и приобретенная. Пример: врождённая патология тимуса – синдром Диджорджи врождённое недоразвитие тимуса или его отсутствие вместе с паращитовидными железами. Смерть в первые недели жизни без пересадки. Приобретённые: СПИД. Влияют так же факторы: стрессы, опухоли, инфекции (особенно вирусные), нарушения питания, возрастные изменения. |