Главная страница
Навигация по странице:

  • Иммуноферментный анализ, или метод (ИФА)

  • Иммунная электронная микроскопия

  • Радиоиммунный анализ (РИА)

  • Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

  • Для амплификации РНК вирусов применяют ПЦР

  • Вирус гепатита В, патогенез и лабораторная диагнос­тика гепатита В.

  • Вирус гепатита С, патогенез и лабораторная диагнос­тика гепатита С.

  • Специфическая и неспецифическая профилактика гепати­тов.

  • ВИЧ-инфекция. Характеристика биологических свойств возбудителей.

  • Занятие 15 История открытия вирусов


    Скачать 244.4 Kb.
    НазваниеЗанятие 15 История открытия вирусов
    Дата10.12.2020
    Размер244.4 Kb.
    Формат файлаdocx
    Имя файлаMB15-16.docx
    ТипЗанятие
    #159371
    страница4 из 5
    1   2   3   4   5


    Иммуноблоттингметод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят их (блоттинг - от англ. blot, пятно) из геля на нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Полоски с “блотами” антигенов выпускаются различными фирмами. 1. На эти полоски наносят сыворотку больного. 2. Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом. 3. Образовавшийся на полоске комплекс [антиген + антитело больного + антитело против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата, изменяющего окраску под действием фермента.

    Иммуноферментный анализ, или метод (ИФА) — выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бета-галактозидазой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченой ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции — интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител

    Иммунная электронная микроскопия – электронная микроскопия чаще вирусов, обработанных соответствующими антителами. Вирусы, обработанные иммунной сывороткой, образуют иммунные агрегаты (микропреципитаты). Вокруг вирионов образуется “венчик“ из антител, контрастированный фосфорно-вольфрамовой кислотой или другими электроннооптически плотными препаратами хорошо видимый в электронном микроскопе.

    Радиоиммунный анализ (РИА), — высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген — антитело с применением антигенов или антител, меченных радионуклидом (125J, 14С, 3Н, 51Сr и др.). После их взаимодействия отделяют образовавшийся радиоактивный иммунный комплекс и определяют его радиоактивность в соответствующем счетчике (бета- или гамма-излучение): интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.

    Полимеразная цепная реакция (ПЦР) основана на амплификации, т. е . увеличении количества копий специфического (маркерного) гена возбудителя . Для этого двунитевую ДНК, выделенную из исследуемого материал а, денатурируют ( «расплетают» при нагревании) и достраивают (при охлаждении) к расплетенным нитям ДНК новые комплементарные нити . В результате из одного гена образуются два. Этот процесс копирования генов многократно по вторяется при заданных температурных режимах . Достраивание новых комплементарных нитей ДНК происходит при добавлении к искомым генам прай меров (затравки из коротких однонитевых ДНК, комплементарных 3'- концам ДНК искомого гена), ДНК - полимеразы и нуклеотидов. Для амплификации РНК вирусов применяют ПЦР с предварительным этапом обратной транскрипции (RT-PCR).

    1. Вирус гепатита А, патогенез и лабораторная диагнос­тика гепатита А.

    Гепатит А - острое циклически протекающее инфекционное заболевание, вызываемое РНК-содержащим вирусом и характеризую- щееся кратковременными симптомами интоксикации, преходящими нарушениями функций печени и, в большинстве случаев, доброкачественным течением.

    ЭТИОЛОГИЯ

    В настоящее время вирус гепатита А включён в род Hepatovirus семейства Picornaviridae. Возбудитель представлен одним антигенным типом и содержит главный Аг (HA-Аг), по которому его идентифицируют. Вирус гепатита А устойчив в окружающей среде, хорошо переносит низкую температуру, при 21 ?C сохраняется несколько недель; полностью инактивируется при температуре 85 ?C. Вирус устойчив к хлору, вследствие чего сохраняется в очищенной питьевой воде.

    ЭПИДЕМИОЛОГИЯ

    Гепатит А - одно из наиболее распространённых инфекционных заболеваний детского возраста. По количеству регистрируемых случаев гепатит А занимает третье место после ОРВИ и ОКИ. В общей структуре заболеваемости гепатитом А на долю детей приходится более 60%. Наиболее часто заражаются дети в возрасте 5-14 лет, инфицирование взрослых обычно происходит при контакте с заражёнными детьми. В странах с низким уровнем экономического развития к 10- летнему возрасту у 90% детей обнаруживают АТ к вирусу гепатита А.

    Гепатит А - типичный антропоноз. Источник инфекции - больной человек. Вирус содержится в биологических субстратах (моче, фекалиях, крови и др.) и ткани печени. Больной становится заразным с последних дней инкубационного периода. Выделение вируса прекращается через 4-5 дней с момента появления желтухи. Передача возбудителя происходит фекально-оральным путём (через воду, пищевые продукты, грязные руки, различные предметы). Парентеральный путь передачи возможен, но наблюдают его исключительно редко, только при трансфузии крови донора, находящегося в инкубационном периоде болезни. Вирус не передаётся трансплацентарным путём. Фекальное загрязнение водных источников может вызвать развитие эпидемических вспышек. Возможны локальные эпидемические вспышки в детских учреждениях, среди военнослужащих. Восприимчивость к вирусу чрезвычайно высока. Пик заболеваемости приходится на позднюю осень. После перенесённого заболевания формируется стойкий иммунитет.

    ПАТОГЕНЕЗ

    Попадая в организм человека с водой или пищей, вирус гепатита А размножается в эпителии слизистой оболочки тонкой кишки и регионарных лимфоидных тканях. Затем наступает фаза кратковременной вирусемии. Максимальная концентрация вируса в крови возникает в конце инкубационного периода и в преджелтушном периоде. В это время возбудитель выделяется с фекалиями. Репродукция вируса в цитоплазме гепатоцитов приводит к гибели клеток (синдром цитолиза). Цитопатический эффект усиливают иммунные механизмы, в частности естественные киллеры, активированные интерфероном, синтез которого индуцируется вирусом. Вследствие лизиса гепатоцитов в сыворотке крови повышается активность печёночных ферментов. Фаза реконвалесценции характеризуется усилением репаративных процессов и восстановлением функционального состояния печени. У подавляющего большинства детей наступает выздоровление с полным восстановлением структуры и функций органа в сроки от 1,5 до 3 мес от начала болезни. У 3-5% больных болезнь принимает затяжное течение. Хронизации гепатита А не происходит.

    КЛИНИЧЕСКАЯ КАРТИНА

    При типичном течении болезни отчётливо выражена цикличность с последовательной сменой пяти периодов: инкубационного, продромального (преджелтушного), разгара (желтушного), постжелтушного и реконвалесценции.

    Инкубационный период

    Инкубационный период при гепатите А продолжается от 10 до 45 дней, обычно 15-30 дней. В этом периоде клинически болезнь ничем не проявляется. Однако в крови можно обнаружить Аг вируса гепатита А.

    Лабораторная диагностика гепатита А (инкубационный период 14-45 дней)

    Исследуемый материал: кровь (сыворотка), фекалии, вода и пищевые продукты

    Выявление антигена (реакции) ИФА - антиген вируса (HAVAg) выявляют в экстрактах фекалий со 2-й недели и до конца болезни;

    Выявление вируса (методы) Иммунная электронная микроскопия (ИЭМ), в научных и производственных целях используют заражение обезьян и культур клеток

    Выявление антител (классы Ат, сроки, реакции) ИФА, РИА IgM 4-8 недели, IgG с 4 недели, остаются на всю жизнь

    Генодиагностика (сроки, реакции) ПЦР - РНК вируса (HAV RNA)

    1. Вирус гепатита В, патогенез и лабораторная диагнос­тика гепатита В.

    Острый вирусный гепатит В (сывороточный, парентеральный) - инфекционное заболевание с преимущественно парентеральным ме- ханизмом передачи, клинически и морфологически характеризующееся поражением печени. Заболевание протекает длительно в различных клинико-морфологических вариантах: от «здорового» носительства до злокачественных фатальных форм. Возможно формирование хронического гепатита, цирроза печени и гепатокарциномы.

    ЭТИОЛОГИЯ

    Возбудитель впервые обнаружили Д. Дейн и соавт. (1970). Вирус гепатита В включён в состав рода Orthohepadnavirus семейства Hepadnaviridae. Вирионы вируса гепатита В (частицы Дейна) сферической формы, 42 нм в диаметре, имеют суперкапсид. Геном образует неполная (одна нить короче) двухнитевая кольцевая молекула ДНК. Вирус чрезвычайно устойчив к высокой и низкой температурам, химическим и физическим воздействиям. Основные Аг частиц Дейна - поверхностный HBsAg и сердцевинный HBcAg. АТ к HBsAg и HBcAg появляются в течение заболевания. Наличие АТ к HBsAg - причина невосприимчивости к инфекции (постинфекционного или поствакцинального иммунитета).

    • HBsAg постоянно циркулирует в сыворотке инфицированных лиц, а его очищенные агрегаты входят в состав вакцины против вируса гепатита В.

    • HBcAg представлен единственным антигенным типом; его обнаруживают только в сердцевине частиц Дейна. Аг маркирует репликацию вируса в гепатоцитах. Может быть обнаружен только при морфологическом исследовании биоптатов или аутопсийного материала печени. В крови в свободном виде его не определяют.

    • HBeAg не входит в состав частиц Дейна, но связан с ними, так как появляется в сыворотке в инкубационном периоде, сразу после появления HBsAg. HBeAg можно расценивать как наиболее чувствительный диагностический показатель активной инфекции. Обнаружение HBeAg у пациентов с хроническим гепатитом указывает на активацию процесса, что представляет высокую эпидемическую опасность. HBeAg может отсутствовать при инфекции, вызванной мутантным штаммом вируса.

    Вирусная ДНК появляется в сыворотке одновременно с другими Аг вируса. Исчезает из крови в начале 2-й недели острого заболевания. Длительное персистирование - признак хронической инфекции.

    ЭПИДЕМИОЛОГИЯ

    Острый вирусный гепатит В - типичная антропонозная инфекция. Источник инфекции - больные любыми формами острого и хронического гепатита В и вирусоносители, представляющие наибольшую опасность. Механизм передачи инфекции - парентеральный. Основные пути передачи вируса гепатита В - инъекционный, гемотрансфузионный и половой. Также доказана возможность вертикальной передачи вируса гепатита В от матери к плоду. Восприимчивость населения к вирусу гепатита В, по-видимому, стопроцентная, но заражение в большинстве случаев заканчивается бессимптомной инфекцией. Большое значение имеет величина инфицирующей дозы. Инфицирование при гемотрансфузии обычно приводит к развитию манифестных и злокачественных форм болезни, при перинатальном инфицировании и бытовом контакте формируется хроническая вялотекущая инфекция. Наибольшая заболеваемость характерна для детей первого года жизни, что объясняется частыми парентеральными вмешательствами и перинатальным инфицированием. Вертикальная передача вируса гепатита В осуществляется от матери-носительницы вируса или больной гепатитом В, особенно в последнем триместре беременности. Заражение может быть трансплацентарным или произойти сразу после родов. Риск инфицирования возрастает в случае выявления у матери HbsAg, особенно при высокой его концентрации.

    ПАТОГЕНЕЗ

    Вирус гепатита В гематогенно заносится в печень и размножается в гепатоцитах. В патогенезе поражений важную роль играют аутоиммунные гуморальные и клеточные реакции, что подтверждает связь между началом клинических проявлений и появлением специфических АТ. Патологический процесс начинается после распознавания вирус-индуцированных Аг на мембранах гепатоцитов иммунокомпетентными клетками, что приводит к цитолизу гепатоцитов. Высвобождение вирусных Аг приводит к образованию специфических АТ, прежде всего анти-HBc и анти-HBc, с последующей элиминацией возбудителя. Анти-HB,, появляются через 3-4 мес от начала заболевания и сохраняются длительное время. Появление анти-HBs, свидетельствует о выздоровлении и формировании иммунитета. HBcAg свободно не выявляется, но у большинства лиц, инфицированных гепатитом В, сыворотка содержит АТ к нему (анти-HBc).

    При адекватном иммунном ответе на Аг вируса развивается типичный острый гепатит с циклическим течением и полным выздоров- лением, при недостаточном ответе цитолиз выражен незначительно, быстрой элиминации возбудителя не происходит. Клиническая картина атипична. Вирус в организме персистирует длительно, возможно развитие хронического гепатита. Чрезмерная активность аутоиммунных процессов может привести к гибели не только инфицированных, но и здоровых гепатоцитов, что приводит к тяжёлым и злокачественным формам болезни.

    Диагностика

    Исследуемый материал кровь (сыворотка), биоптаты печени

    Выявление антигенов (очередность, сроки, длительность) ИФА, РПГА в сыворотке крови определяют поверхностный антиген HВsAg 1-5 месяцев, “антиген инфекционности” HBеAg 2-3 месяца; HBс Ag в крови не циркулирует в свободном виде, его можно обнаружить только в биоптатах печени- в ядрах гепатоцитов

    Выявление антител (классы Ат, сроки, реакции) ИФА, РПГА в сыворотке крови определяют: антитела к поверхностному антигену (анти-HВsAg)- с 6 месяцев; антитела к “антигену инфекционности” анти-HВеAg с 4-5 месяцев). Антитела к сердцевинному антигену (анти-HВсAg IgM и антиHВcAg IgG) служат индикатором вирусемии и могут определяться в гепатоцитах методом РИФ с 2 месяцев;

    Генодиагностика. Выявление НК (сроки, реакции) ДНК (HBV DNA вируса в крови и биоптатах печени с момента заражения до выздоровления (в среднем 6 месяцев) методом ПЦР и молекулярной гибридизации .

    1. Вирус гепатита С, патогенез и лабораторная диагнос­тика гепатита С.

    Гепатит С - острое вирусное заболевание с парентеральным путём передачи и преимущественным развитием хронических форм гепатита с исходом в цирроз и первичную карциному печени.

    Этиология. Вирус гепатита C включён в состав рода семейства Flaviviridae. Вирионы сферической формы, диаметром 35-50 нм, окружены суперкапсидом. Геном образует РНК. Выделяют 6 сероваров вируса.

    Эпидемиология. Источник инфекции - инфицированный человек. Основной путь передачи вируса - парентеральный. Основное отличие от эпидемиологии вируса гепатита В - более низкая способность вируса гепатита С к передаче от беременной к плоду и при половых контактах. Выделение вируса больным начинается за несколько недель до появления клинических признаков и продолжается в тече- ние 10 нед после начала проявлений. До 2% доноров в мире являются носителями вируса гепатита С. Распространённость носительства вируса гепатита С колеблется от 0,5 до 50%. Среди здоровых детей в России частота обнаружения анти-HCV составляет от 0,3 до 0,7%. Заболеваемость гепатитом С характерной периодичности и сезонности не имеет.

    Патогенез. Считают, что вирус гепатита С может оказывать на ге- патоциты прямое цитотоксическое действие. В то же время в повреждении гепатоцитов не исключают и роль иммунного цитолиза. Существует связь между тяжестью заболевания и уровнем виремии. При инокуляции значительного количества вирусных частиц (при переливании крови) заболевание протекает тяжелее, чем при менее массивном попадании вирусов в организм. Клиническая картина

    Инкубационный период при остром вирусном гепатите С продолжается 5-12 нед. Заболевание чаще начинается постепенно с астенодиспептического синдрома. Дети жалуются на общую слабость, не- домогание, головную боль, тошноту, сниженный аппетит. Возможны повторная рвота, ноющие или приступообразные боли в животе. У 1/3 больных повышается температура тела до субфебрильных значений. Печень увеличена и болезненна. Желтушный период продолжается от 1 до 3 нед. С появлением желтухи симптомы интоксикации сохраня- ются или усиливаются. Помимо ещё больших увеличения и болезненности печени, у части больных увеличивается селезёнка, темнеет моча, обесцвечивается стул. В сыворотке крови повышаются концентрация билирубина (преимущественно за счёт конъюгированной фракции) и активность печёночных ферментов в 5-15 раз. В постжелтушном периоде нормализуется самочувствие больного, уменьшаются размеры печени и селезёнки, значительно снижается активность АЛТ и АСТ.

    Гепатит С (инкубационный период 2 недели -3месяца)

    Исследуемый материал кровь (сыворотка), биоптаты печени

    Скрининговые тесты: выявление в донорской крови антител к белкам капсида (С22) и функциональным белкам (NS3-NS5) вируса тест-системами третьего поколения ИФА-3,

    Подтверждающие тесты в образцах с первично положительным результатом ИФА проводят:

    1. ИФА с раздельным определением антител к различным белкам вируса,

    2. иммуноблоттинг с использованием рекомбинантных антигенов к белкам капсида (С22) и функциональным белкам (NS3-NS5).

    Оценка результатов иммуноблотанализа положительный при выявлении антител к двум и более АГ

    Генодиагностика РНК вируса (HCV RNA) методом ПЦР и молекулярной гибридизации на протяжении болезни.

    1. Специфическая и неспецифическая профилактика гепати­тов.

    Для снижения и предотвращения заболеваемости гепатитом существуют специальные меры профилактики, подразделяющиеся на специфические и неспецифические. Специфическая профилактика подразумевает плановую или экстренную иммунизацию от вируса гепатита В.

    Неспецифическая профилактика гепатита – это соблюдение санитарно-эпидемиологических норм и техники безопасности.

    Стоит отметить, что эффективных мер специфической профилактики гепатита С до сих пор не существует.

    1. ВИЧ-инфекция. Характеристика биологических свойств возбудителей.

    Вирус иммунодефицита человека вызывает ВИЧ-инфекцию, заканчива­ющуюся развитием синдрома приобретенно­го иммунного дефицита.

    Возбудитель ВИЧ-инфекции — лимфотропный вирус, относящийся к семейству Retroviridae роду Lentivirus.

    Морфологические свойства: РНК-содержащий вирус. Вирусная частица сферической формы Оболочка состоит из двойного слоя липидов, пронизанного гликопротеинами. Липидная оболочка проис­ходит из плазматической мембраны клетки хозяина, в которой репродуцируется вирус. Гликопротеиновая молекула состоит из 2 субъединиц, находящихся на поверхности вириона и пронизывающих его липидную оболочку.

    Сердцевина вируса конусовидной формы, состоит из капсидных белков, ряда матриксных белков и белков протеазы. Геном образует две нити РНК, для осуществления процесса репродукции ВИЧ имеет обратную транскриптазу, или ревертазу.

    Геном вируса состоит из 3 основных струк­турных генов и 7 регуляторных и функциональных генов. Функциональные ге­ны выполняют регуляторные функции и обеспечивают осуществление процессов репродукции и участие вируса в инфекционном процессе.

    Вирус поражает в основном Т- и В-лимфоциты, некоторые клетки моноцитарного ряда (макрофаги, лейкоциты), клетки нервной системы.

    Культуральные свойства: на культуре клеток Т-лимфоцитов и моноцитов человека (в присутствии ИЛ-2).

    Антигенная структура: 2 типа вируса — ВИЧ-1 и ВИЧ-2 ВИЧ-1, имеет более 10 генотипов (субтипов): А, В, С,D,E,F…, отличающихся между собой по аминокислотному составу белков.

    ВИЧ-1 делят на 3 группы: М, N, О. Большинство изолятов относится к группе М, в которой выделяют 10 подти­пов: А, В, С,D,F-l,F-2,G, Н,I, К.Устойчивость: Чувствителен к физическим и химическим факторам, гибнет в при нагревании. Вирус может длительно сохраняться в высушенном состоянии, в высохшей крови.
    1. 1   2   3   4   5


    написать администратору сайта