№4 Занятие. Занятие 4 Тема занятия Вирусологические методы исследования. Бактериофаги. Генетика бактерий и вирусов. Основы изменчивости модификации, мутации и генетические рекомбинации
 Скачать 34.76 Kb.
|
|
Практическое занятие №4 Тема занятия: Вирусологические методы исследования. Бактериофаги.Генетика бактерий и вирусов. Основы изменчивости: модификации, мутации и генетические рекомбинации. План занятия: Вирусологические методы исследования (индикация вирусов). Первично трипсинизированные культуры клеток. Фаги. Фаготипирование. Генетика микроорганизмов. Рекомбинация, модификация, мутация. Цель и задачи занятия: -Определяемся с принципами классификации вирусов. Подробно разбираем различные формы взаимодействия вирусов с клеткой с использованием таблиц – «Взаимодействие вируса с клеткой», «Строение вирусов», «Формы вирусов», «Виды симметрии вирусов». -Детально разбираем методы культивирования вирусов и методы диагностики вирусных инфекций с демонстрацией таблиц - «Заражение куриных эмбрионов», «Индикация вирусов на культурах клеток» -Знание генетических механизмов лекарственной устойчивости микроорганизмов необходимо в практике для правильного и рационального лечения инфекционных заболеваний. -Освоить методы селекции мутантов и рекомбинантов в бактериальной популяции и методы выявления плазмид бактерий. Содержание занятия: Взаимодействие вируса с клеткой хозяина – это сложный многоступенчатый процесс, который начинается с адсорбции вирусных частиц на рецепторах клетки хозяина и продолжается после их проникновения внутрь клетки. В результате такого взаимодействия развивается либо продуктивная форма, при которой происходит размножение вируса, либо абортивная при которой происходит нарушение репродукции вируса на одном из этапов, либо интегративная при которой происходит интеграция вирусной нуклеиновой кислоты в клеточный геном. Первая стадия – адсорбция – характеризуется прикреплением вириона к клеточным рецепторам, представляющим собой гликопротеины клеточной мембраны. Рецепторами вирусов являются прикрепительные белки, располагающиеся в капсиде и суперкапсиде. Первый этап адсорбции определяется неспецифическими силами межмолекулярного притяжения, второй – специфической структурной гомологией или комплементарностью рецепторов чувствительных клеток и вирусов. Вторая стадия – проникновение вируса в клетку хозяина – происходит несколькими путями. А) Рецепторно-опосредованный эндоцитоз характеризуется образованием в месте взаимодействия вириона с клеточным рецептором окаймленных пузырьков. В) Виропексис. Этим путем в клетку проникают сложные вирусы. Он заключается в слиянии мембран – вирусного суперкапсида с клеточной мембраной, в результате чего происходит высвобождение нуклекапсида в цитоплазму, а суперкапсид встраивается в плазматическую мембрану. С) Фагоцитоз. Данным путем вирус проникает в фагоцитирующие клетки, что приводит к незавершенному фагоцитозу. Третья стадия – транспорт вируса внутри клетки. Он происходит с помощью внутриклеточных мембранных пузырьков, в которых вирус переносится на рибосомы, эндоплазматическую сеть или в ядро. Четвертая стадия – «раздевание» вириона – заключается в их депротеинизации и освобождении от суперкапсида и капсида, препятствующих репликации вирусной нуклеиновой кислоты. Пятая стадия называется эклипс-фазой, которая характеризуется исчезновением вириона, поскольку он перестает обнаруживаться при электронной микроскопии. В эту стадию начинается синтез компонентов вириона. Она носит дизъюнктивный (раздельный) характер, поскольку компоненты вириона синтезируются в разных частях клетки: белки на рибосомах, нуклеиновые кислоты в ядре или цитоплазме. Вирус использует для этого генетический аппарат клетки, подавляя необходимые ей самой синтетические реакции. Эта стадия начинается с транскрипции и репликации вирусного генома. Шестая стадия – сборка вириона – состоит, прежде всего, в образовании нуклеокапсидов. Простые вирионы собираются на мембранах эндоплазматического ретикулума. У сложных вирионов сборка нуклеокапсида начинается на репликативных комплексах, а затем продолжается на плазматической мембране, с наружной стороны которой располагаются суперкапсидные гликопротеиды. Седьмая стадия – выход вирусных частиц из клетки – происходит двумя путями. Простые вирусы, лишенные суперкапсида, вызывают деструкцию клетки и попадают во внеклеточное пространство. Сложные вирусы выходят из клетки путем почкования, в результате чего она сохраняет свою жизнеспособность. Интегративный путь взаимодействия между вирусом и клеткой хозяина не одинаков для ДНК- и РНК-содержащих вирусов. В первом случае вирусная ДНК в кольцевой форме интегрирует в клеточный геном. При этом место интеграции определяется гомологичными нуклеотидными последовательностями, имеющимися в определенных участках – ДНК сайтах при участии ряда ферментов. Вирус, интегрированный в клеточный геном, называется провирусом. Провирус может реплицироваться в составе клеточного генома пропорционально делению клетки. Выщепление провируса из клеточного генома и его проникновение в новую клетку может вызвать продуктивную инфекцию. В случае РНК-содержащих вирусов включение РНК в клеточный геном происходит путем обратной транскрипции. Механизм обратной транскрипции состоит в первоначальном образовании ДНК-транскрипта на матрице РНК при обязательном участии обратной транскриптазы, который в дальнейшем замыкается в кольцо и встраивается в клеточный геном. Данный процесс объединения вирусной нуклеиновой кислоты с хромосомой клетки хозяина называется вирогенией. Вирусы являются облигатными внутриклеточными паразитами, которые неспособны размножаться на искусственных питательных средах и для их культивирования применяются три метода: 1) в культуре клеток, 2) в курином эмбрионе, 3) в организме восприимчивого животного. Причиной облигатного паразитизма вирусов является то, что вирусы не имеют клеточного строения и собственного обмена веществ. Выбор метода культивирования вируса зависит от особенности вируса и от целей исследования. Для создания моделей вирусных инфекционных болезней и выделения вирусов используют лабораторных животных, преимущественно новорожденных животных, поскольку они более чувствительны. Применяют подкожный, внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, субдуральный и другие методы заражения. Преимущество данного метода перед другими состоит в зависимости выделения тех вирусов, которые плохо репродуцируются в культуре или курином эмбрионе. К его недостаткам относятся контаминация организма подопытных животных посторонними вирусами и микоплазмами, а также необходимость последующего заражения клеточной культуры для получения чистой линии данного вируса, что удлиняет срок исследования. Куриные эмбрионы широко применяются для культивирования ряда вирусов (гриппа, герпеса, оспы), которые репродуцируются в амнионе, на хорион-аллантоисной оболочке, в желточном мешке, в аллантоисной полости. Куриные эмбрионы по сравнению с клеточными культурами и подопытными животными значительно реже бывают контаминированы вирусами и микоплазмами, а также обладают сравнительно высокой жизнеспособностью и устойчивостью к различным воздействиям. К недостаткам данного метода относятся невозможность обнаружения исследуемого вируса без предварительного вскрытия куриного эмбриона, а также наличия в нем большого количества белков и других соединений, затрудняющих последующую очистку вирусов при изготовлении различных препаратов. 2. Культуры клеток подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые. К первичным относятся культуры клеток, способные выдерживать 5-10 пассажей. Приготовление первичной культуры складывается из нескольких последовательных этапов: измельчение ткани, разъединение клеток путем трипсинизации, отмывание полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост. Клетки эпителиальной и соединительной тканей растут в суспензии, при оседании они довольно прочно прикрепляются к стенке пробирки или флакона и состоят из одного слоя клеток. Перевиваемые однослойные культуры клеток приготавливают из злокачественных и нормальных линий клеток, обладающих способностью длительно размножаться вне организма. К ним относятся злокачественные клетки Неlа и Нер-3, нормальные клетки амниона человека, почек обезьяны и другие. К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клетки человека. Они представляют собой клеточную систему, сохраняющуюся в процессе 50 пассажей диплоидный набор хромосом. О размножении вирусов в культуре клеток судят по цитопатическому действию (ЦПД), образованию бляшек, цветной реакции, образованию внутриклеточных вирусных включений, реакциям гемагглютинации и гемадсорбции. ЦПД – видимые под микроскопом морфологические изменения клеток в результате повреждающего действия вирусов. Бляшки – участки разрушенных вирусами клеток, можно обнаружить при культивировании вирусов на однослойных клеточных культурах. Цветная реакция основана на разнице в цвете питательной среды с индикатором. При росте клеток, не пораженных вирусом, происходит накопление продуктов метаболизма, что приводит к изменению цвета питательной среды. Внутриклеточные вирусные включения – скопления вирусных частиц и белков, которые можно обнаружить в ядре и цитоплазме при специальных методах окраски. Реакция гемагглютинации применяется для обнаружения вирусов в культуральной жидкости, клеточной культуры, хорион-аллантоисной или амниотической жидкости куриного эмбриона. Гемагглютинацию – скучивание эритроцитов кур, гусей, морских свинок, вызывают вирусы, содержащие в оболочке гемагглютинин. Реакция гемадсорбции – способность клеточных культур, зараженных вирусом, адсорбировать на своей поверхности эритроциты. Реакция гемадсорбции применяется для индикации вирусов в культурах клеток или куриных эмбрионах. Для постановки реакция гемадсорбции в культуру клеток, зараженных вирусами, добавляют взвесь эритроцитов и после некоторого времени контакта клетки промывают изотоническим раствором хлорида натрия. На поверхности пораженных вирусами клеток остаются прилипшие эритроциты. Определение типа вируса основано на нейтрализации биологической активности вируса с помощью типоспецифических сывороток. Конечный результат ее может быть установлен на основании следующих признаков. 1) нейтрализация цитопатического действия, 2) нейтрализация реакции гемадсорбции, 3) изменение проявлений цветной пробы, 4) задержка реакции гемагглютинации, 5) нейтрализация в опытах на животных. Кроме того, для идентификации вирусов применяют методы иммунофлюоресценции, а также ДНК-ДНК (РНК-РНК)-гибридизации. 3. Бактериофаги – вирусы бактерий. Бактериофагия – процесс взаимодействия фагов с бактериями, заканчивающийся очень часто их разрушением. Фагам присущи все биологические особенности, которые свойственны вирусам. Их геном представляет либо ДНК, либо РНК и заключен в белковую оболочку (капсид), структурные субъединицы которой уложены по типу либо спиральной, либо кубической симметрии. Крупные фаги, имеющие хвостик, устроены по типу бинарной симметрии. Фаги различаются по форме: нитевидные, сферические, фаги имеющие головку и хвостик. Различают фаги инфекционные, т.е. способные вызвать разные формы фаговой инфекции, и неинфекционные, находящиеся еще в стадии размножения. В свою очередь инфекционные фаги разделяют на покоящиеся (находящиеся вне клетки), вирулентные - способные вызвать продуктивную форму инфекции, умеренные фаги – способные вызывать не только продуктивную, но и редуктивную фаговую инфекцию. Жизненный цикл фага, сопровождающийся продуктивной инфекцией, складывается из последовательных стадий, каждая из которых в свою очередь состоит из нескольких этапов: 1. Адсорбция фагов на клеточной поверхности бактерий при помощи специфических рецепторов. 2. Проникновение фагового генома через клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану внутрь клетки и освобождение его от оболочки. 3. Установление фагового генома с помощью белка лоцмана для реализации, содержащейся в геноме информации. 4. Репликация фаговой геномной ДНК или РНК. 5. Сборка вновь синтезированных вирионов – заключение геномной НК в белковую оболочку, морфогенез фагов. 6. Выход вновь синтезированных фагов из клетки путем лизиса клетки изнутри. Редуктивная инфекция происходит тогда, когда геном фага проникает в клетку, однако размножение фага не происходит, его геном интегрируется в хромосому клетки хозяина, становится ее составной частью, т.е. фаг превращается в профаг, а клетка становится лизогенной. Ее вызывают только умеренные фаги, и жизненный цикл складывается из следующих стадий: А) адсорбция фага на поверхности клетки, В) проникновение фаговой ДНК в бактериальную клетку, С) сайт-специфическая интеграция фаговой ДНК в хромосому клетки-хозяина и превращение фага в профаг. По спектру своего действия на бактерии фаги подразделяются на поливалентные, монофаги и типоспецифические фаги, которые избирательно лизируют отдельные варианты бактерий внутри вида. Благодаря своему разрушающему действию на бактерии фаги могут быть использованы с лечебно-профилактической целью при различных заболеваниях. Наборы стандартных фагов используются для фаготипирования возбудителей ряда болезней. Фаги широко используются для изучения генетики микроорганизмов. Для получения вирулентного фага готовят фильтрат, пропуская исходный материал (вода, суспензия фекалий) через бактериальные фильтры. Фильтрат засевают в бульон и инкубируют при 37°С в течение 18-24 ч. После лизиса культуры оставшиеся бактериальные клетки удаляют центрифугированием и фильтрацией через бактериальный фильтр. Наличие фага в фильтрате определяют качественными и количественными методами. При качественном методе определения фагов в чашку Петри с питательным агаром засевают бульонную культуру и подсушивают при 37°С. Затем на поверхность газона наносят каплю фага, и наклоняют так, чтобы капля стекла к противоположному краю. После суточной инкубации в термостате просматривают чашки, отмечая наличие зоны лизиса по месту стекания капли фага. При количественном методе считают количество "стерильных" пятен на сплошном бактериальном газоне, что соответствует количеству фаговых частиц в засеянной смеси. Исходя из чего, можно вычислить количество пятнообразующих единиц в 1 мл исходной суспензии фага. Эта величина, характеризующая концентрацию фага, называется его титром. Чашку с питательным агаром делят на квадраты, в которые наносят каплю соответствующей бульонной культуры, и каплю испытуемого фага. После инкубации отмечают те квадраты, где имеется сплошной лизис бактерий. По количеству различных бактериальных культур, которые лизируются испытуемым фагом, определяют широту спектра его литического действия. Исследуемую суточную бульонную культуру центрифугируют для отделения фага от бактерий. В том случае если бактерии спонтанно продуцируют фаг, то он будет содержаться в надосадочной жидкости. Для выявления фага надосадочную жидкость засевают на газон индикаторной бактериальной культуры, на котором через сутки инкубации образуются очаги лизиса. 1. Генетическая система бактерий имеет, по крайней мере, 4 особенности, присущие только этим микроорганизмам. Хромосомы бактерий располагаются свободно в цитоплазме, не ограничены от нее мембранами, но связаны с определенными рецепторами на цитоплазматической мембране. Бактерии являются гаплоидными микроорганизмами. У бактерий передача генетической информации происходит не только по вертикали, т.е. от родительской клетки дочерним, но и по горизонтали с помощью различных механизмов: конъюгации, сексдукции, трансдукции, трансформации и трансфекции. У бактерий имеется дополнительный плазмидный геном, наделяющий их важными биологическими свойствами. Возможность регулировать скорость собственного размножения – одно из главных условий, обеспечивающих выживание бактерий в окружающей среде, а, следовательно, и сохранение вида в природе. 2. У бактерий различают три типа репликации ДНК: 1. Вегетативная репликация хромосомной и плазмидной ДНК обуславливают передачу генетической информации по вертикали. 2. Конъюгативная репликация осуществляется при конъюгативном способе обмена генетическим материалом. 3. Репаративная репликация является механизмом, посредством которого осуществляется устранение из ДНК структурных рекомбинаций. Выражение генетической информации, т.е. работа генов, цель которой является осуществление за короткий срок жизненного цикла клетки, поскольку он включает в себя множество биохимических реакций сопряженных между собой. Это предполагает хорошо согласованную во времени работу генов, при определенном жестком и четком управлении ими структурно-функциональной единицей хромосомы, опероном. Он представляет собой группу структурных генов цистронов, связанных с геном оператором. В свою очередь, оперон или их группа находится под управлением одного гена - регулятора. Так возникает сложная структурно-функциональная единица - регулон. Трансформация перенос генетического материала, заключающийся в том, что бактерия-реципиент захватывает из внешней среды фрагменты чужеродной ДНК. Трансформация может быть спонтанной или индуцированной. Индуцированная трансформация происходит при добавлении к культуре бактерий очищенной ДНК, полученной из культур тех бактерий, генетические признаки которых стремятся передать исследуемой культуре. Спонтанная трансформация происходит в естественных условиях и проявляется в возникновении рекомбинантов при смешивании генетически отличающихся клеток. Трансфекция – вариант трансформации бактериальных клеток, лишенных клеточной стенки, осуществляемых вирусной (фаговой) нуклеиновой кислотой. С помощью трансфекции удается вызвать у таких бактерий вирусную инфекцию. Трансдукция – перенос генетического материала от одних бактерий другим с помощью фагов. Различают три типа трансдукции: неспецифическую, специфическую и абортивную. При неспецифической трансдукции в процессе репродукции фага в момент сборки фаговых частиц в их головку вместе с фаговой ДНК может проникнуть какой-либо фрагмент ДНК бактерии-донора, при этом фаг может утратить часть своего генома и стать дефектным. Специфическая трансдукция осуществляется только умеренными фагами, обладающими способностью включаться в строго определенные участки хромосомы бактериальной клетки и трансдуцировать определенные гены. При абортивной трансдукции принесенный фагом фрагмент ДНК бактерии-донора не включается в хромосому бактерии-реципиента, а располагается в ее цитоплазме и может в таком виде функционировать. Сексдукция - перенос генетического материала между бактериальными клетками, осуществляемый F-плазмидой с помощью механизма, аналогичного специфической трансдукции. Конъюгация – перенос генетического материала из клетки-донора в клетку реципиента при их скрещивании. Донорами генетического материала являются клетки, несущие F-плазмиду (половой фактор). Бактериальные клетки, не имеющие F-плазмиды, не способны быть генетическими донорами. Они являются реципиентами генетического материала и обозначаются как Fˉ-клетки. При скрещивании F+ с Fˉ- клеткой половой фактор передается независимо от хромосомы донора с высокой частотой, близкой к 100%. При этом почти все реципиентные клетки получают половой фактор и становятся F+ клетками. Первым этапом конъюгации является прикрепление клетки-донора к реципиентной клетке с помощью половых ворсинок. Затем между обеими клетками образуется конъюгационный мостик, через который из клетки-донора в клетку реципиент могут передаваться F-фактор и другие плазмиды. Для переноса бактериальной хромосомы необходим разрыв одной из цепей ДНК. При конъюгации передается только одна нить ДНК-донора. Большая роль в изменчивости бактерий и других организмов принадлежит транспонируемым генетическим элементам, то есть генетическим структурам, способным в интактной форме перемещаться внутри данного генома или переходить от одного генома к другому. Различают три класса транспонируемых элементов: IS-элементы, транспозоны и эписомы. 1. IS-элементы, или вставочные последовательности. Они несут только один ген, кодирующий белок транспонозу, с помощью, которой IS-элементы встраиваются в различные участки хромосомы. 2. Транспозоны представляют собой более крупные сегменты ДНК. 3. Эписомы – еще более крупные и сложные саморегулирующие системы, содержащие IS-элементы и транспозоны и способные реплицироваться в любом из двух своих альтернативных состояний – автономном или интегрированном – в хромосому клетки-хозяина. Гены в хромосоме располагаются линейно, поэтому можно изучать их последовательность и составлять хромосомную карту, с помощью методов трансформации, трансдукции и конъюгации. В настоящее время изучение геномов не ограничивается только картированием генов, стало возможным изучить последовательность расположения нуклеотидов в составе любого гена. Решающим шагом на пути к решению этой проблемы явилось применение особых ферментов - рестрикционных эндонуклеаз и разработка метода клонирования генов. Технические и инструментальные средства обучения: проектор, таблицы. 1. Спиртовки 2. Стерильные шприцы 3. Куринный эмбрион 4. Спирт 5. Йод 6. Парафин 7. Стерильные маски, перчатки 8. МПА,МПБ 9. Микробиологические петли Порядок проведения занятия: - обсуждение вопросов учебной дисциплины в соответствии с планом занятия; - обсуждение вопросов и заданий, предложенных обучающимися; -освоить технику заражения вирусами и вскрытия куриного эмбриона; -освоить методы выделения фагов из объектов окружающей среды и их идентификация; - освоить методы титрования фага по Грациа; - освоить методы обнаружения лизогенных бактерий. -- изучить S- и R-формы колоний бактерий; Уровневые задания (до 20 баллов): I уровень: 1.Типы взаимодействия вируса с клеткой. 2. Стадии взаимодействия вируса с клеткой 3. Особенности генетики бактерий – как одно из главных условий сохранения их как вида в природе. II уровень: Культивирование вирусов в организме чувствительных животных. Культивирования вирусов в курином эмбрионе. III уровень: 1. При культивировании вирусов в однослойной клеточной культуре, покрытой тонким слоем агара, обнаружены участки разрушенных вирусами клеток. Обоснуйте изменения. 2. В культуру клеток, зараженных вирусами, добавлена взвесь эритроцитов, после контакта и промывания раствором хлорида натрия на поверхности пораженных вирусами клеток остаются прилипшие эритроциты. Обоснуйте такие изменения. Задания для самостоятельной работы студентов (до 30 баллов): Генетическое картирование микроорганизмов. Внехромосомные факторы наследственности: плазмиды, транспозоны, Is-последовательности. Генетика бактерий и вирусов. Список литературы по теме занятия: Лекции по теме. Борисов Л.Б. с соавт. "Медицинская микробиология, вирусология, иммунология" 2002 г.в. стр. 29-31 Борисов Л.Б. с соавт. "Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии" 1984 г.в. стр. 5-8, 14-15 Коротяев А.И. с соавт. "Медицинская микробиология" 2000 г.в. стр. 14-20, 31-32 Покровский В.И. "Медицинская микробиология" 1998 г.в. Определитель бактерий Берджи 1997 г.в. Маянский А.Н. " Микробиология для врачей" 1999 г.в. Тец П.Н. " Руководство к лаб. занятиям по микробиологии" 2002 г.в. |