Занятие 14, 15. Занятие 14,15. Основы вирусологии. Особенности строения и жизнедеятельности. Механизмы вирусной репродукции. Методы выявления вирусов в инфицированном материале. Бактериофаги
 Скачать 1.58 Mb.
|
|
Занятие 14,15. Основы вирусологии. Особенности строения и жизнедеятельности. Механизмы вирусной репродукции. Методы выявления вирусов в инфицированном материале. Бактериофаги Цель занятия: Изучить биологические особенности вирусов, принципы классификации, методы выделения, культивирования и идентификации вирусов. План занятия: Морфология вирусов. Особенности биологии вирусов. Принципы классификации вирусов. Культивирование вирусов: клеточные культуры, эмбрионы птиц, организм лабораторных животных. Типы культур ткани, используемые для культивирования вирусов. Индикация вирусов на биологических моделях. Цитопатогенное действие вирусов. Вирусные включения. Бляшкообразование под агаровым покрытием. Гемадсорбция. Сероидентификация вирусов. Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций: вирусологический, серологический, Молекулярно-генетический. Принципы лабораторной диагностики. Бактериофаг. Его строение и свойства. Умеренные и вирулентные фаги. Виды взаимодействия с микробной клеткой. Умеренный бактериофаг. Фаговая и лизогенная конверсии. Использование бактериофага в медицине. Задание к практическому занятию: Задание 1. Используя рисунок, укажите вирусы и заболевания, вызываемые вирусами, относящимися к разным таксономическим группам, данные внесите в таблицу. Классификация вирусов по типу нуклеиновых кислот  Таблица
Ответьте на поставленные вопросы. 1.Главную роль в патологии человека играют РНК-содержащие вирусы, к ним относятся… 2.ДНК содержащие вирусы, патогенные для человека. Это… 3.Происхождение вирусов – вопрос, который на протяжении многих лет составлял предмет дискуссий. Было выдвинуто три основные гипотезы: Задание 2. Изучите методы культивирования вирусов и способы их индикации. Сделайте краткое описание методов индикации вирусов в культуре клеток. Индикация вирусов в культурах клеток проводится по: цитопатологическому действию вируса. Нарисуйте типы цитопатологического действия вирусов. Наличию внутриклеточных включений, располагающихся в цитоплазме и/или в ядрах пораженных клеток (сделайте соответствующие рисунки). феномену бляшкообразования (феномена Дюльбекко) это… реакции гемаггютинации или гемадсорбции: Изучите механизм реакций гемагглютинации и гемадсорбции и кратко опишите: 1) положительная реакция гемагглютинации (РГА) или гемадсорбции (РГАдс), сделайте рисунки.Рисунок – Реакции гемагглютинации (А) и гемадсорбции (Б). цветной реакции Солка. Рассмотрите демонстрацию результатов цветной реакции Солка, отразите результаты на рисунке, сделайте вывод о наличии вируса в культуре клеток. реакции нейтрализации. Изучите механизм реакции нейтрализации и кратко опишите ее. Дайте характеристику вирусологического метода исследования, основанного на использовании культуры клеток. 1. Полуперевиваемая культура клеток – это… 2. Полуперевиваемая культура клеток используется для… 3. Перевиваемая культура клеток – это… 4. Для получения перевиваемой культуры клеток используют… Бактериофаги Бактериофаги или фаги избирательно поражают бактериальные клетки. Размножаясь внутри бактерий, они вызывают их лизис. Бактериофаги широко распространены в природе и обнаруживаются в воде, почве, в организме человека и животных. Фаги состоят из белковой оболочки и генетического материала - ДНК или РНК (рис. 30, 31).   Бактериофаги различаются по форме: нитевидные, кубические, имеющие икосаэдрическую головку и отросток (хвост). Размеры фагов от 20 до 200 нм. Методы качественного обнаружения бактериофага в исследуемом материале: Прямой метод. Фаг получают и изучают непосредственно в фильтратах исследуемого материала. О наличии и активности фага узнают по лизису чувствительной к нему культуры. Для работы с фагом применяют как культуры в жидких средах, так и культуры, выращенные на агаре. Для жидких сред время выращивания 2-6 часов. Для агара – 20-24 часа. Для определения чистоты культуры используют мазки, окрашенные по Граму или фуксином Пфейффера. Метод обогащения. Исследуемый материал засевают в жидкую питательную среду, посевы инкубируют. Затем посевы фильтруют через бумажный, а затем через бактериальный фильтр, в фильтрате определяют свойства и активность фага. Этапы подготовки материалов к фильтрации: Жидкие материалы (кровь, воду, мочу и т. д.) очищают от крупных частиц, чтобы они не забили поры бактериального фильтра. Очистка производится с помощью бумажного фильтра или центрифугированием. Вязкие материалы (кал, гной) диспергируют в изотоническом растворе натрия хлорида или бульоне, затем освобождают от крупных частиц тем же способом, что и для жидких материалов. Плотные материалы (кусочки пищи, органов и т. д.) обычно растирают в ступке со стерильным кварцевым песком. Полученный материал эмульгируют в изотоническом растворе натрия хлорида или бульоне. Затем освобождают от крупной взвеси. Полученный материал, освобождая от посторонней микрофлоры, пропускают через бактериальный фильтр. Количественные методы. После выявления бактериофага в исследуемом материале необходимо определить его количественное содержание (или титр фага). Для этого используют 2 показателя: количество активных частиц бактериофага, содержащихся в 1 мл исследуемого материала, или величину наибольшего разведения, при котором бактериофаг проявляет свое литическое действие. Полученную при этом величину выражают отрицательным логарифмом 10, где степень указывает разведение фага. Для титрования бактериофага предложены различные методы, однако наибольшее распространение получили способ титрования фага в жидкой питательной среде, предложенный Аппельманом, и метод агаровых слоев Грациа. Метод Аппельмана Метод Грациа Метод Аппельмана (титрование фага в жидкой среде). При титровании фага температура, объем и состав среды, количество микробов, аэрация, пробирки (толщина стекла), в которых проводят титрование, должны быть одинаковыми. Меняется только количество фага. Должна соблюдаться стерильность бульона и фага, а также жизнеспособность культуры. Постановка опыта: готовятся десятикратные разведения фага в питательном бульоне от 10-2 до 10-8. Затем в каждую пробирку добавляют по 0,2 мл бульонной культуры и разведения ставят в термостат при 37 на 8-12 часов. После инкубации в термостате, учитывают результаты. При положительном результате наблюдают просветление среды. За титр принимают разведение в последней пробирке, где произошел полный лизис. Метод Грациа (титрование фага на плотной агаровой среде) Постановка опыта. Делают ряд последовательных разведений фага по 1,0 мл, смешивают в пробирке с 0,5 мл бактериальной культуры и добавляют в эту же пробирку расплавленный МПА.  Содержимое пробирок быстро перемешивают, не давая застыть агару, и выливают на поверхность среды в чашки Петри. Через 30 мин чашки ставят в термостат. Учет результатов проводят через 18-20 часов. Происходит лизис бактерии, и образуются негативные колонии фага. В первых чашках как правило наблюдается сплошной лизис культуры, что связано большой концентрацией. В остальных же появляются изолированные колонии, которые подсчитывают. Для подсчета количества частиц фага в 1 мл фаголизата используют формулу: n = x×y, где n - искомое число частиц; x - разведение фага в чашке, в которой подсчитаны колонии; y - количество выросших на чашке колоний фага. Практическое применение фагов Применение фагов основано на их строгой специфичности и способности лизировать микробные клетки или вступать с ними в симбиоз. Бактериофаги применяют для лечения и профилактики инфекционных заболеваний (фагопрофилактика и фаготерапия), в лабораторной диагностике: для идентификации бактерий (реакция фаголизиса), с целью выявления источника инфекции в эпидемиологии (реакция фаготипирования). Бактериофаги применяют также в генной инженерии в качестве векторов для получения рекомбинантных ДНК. Фагопрофилактика и фаготерапия – это предупреждение и лечение бактериальных инфекций с помощью фагов. В настоящее время фаги широко применяют при профилактике и лечении стрептококковых и стафилококковых поражений, даже таких, которые не поддаются действию антибиотиков. Также фаги применяются при лечении холеры, чумы и ряда других инфекций, например, инфекций, вызванных кишечной палочкой и протеем. Домашнее задание. Ответить письменно на контрольные вопросы по теме занятия, подготовиться к устному опросу . Контрольные вопросы по теме занятия. 1. Положение вирусов в системе органического мира, принципы классификации. 2. Биологические особенности вирусов. 3. Строение простых и сложных вирусов: типы симметрии, составные части вирусной частицы, внешняя оболочка; примеры простых и сложных вирусов. 4. Методы культивирования вирусов. Методы обнаружения вирусов в культуре ткани. 5. Бактериофаги. Морфология и строение фагов. Вирулентные и умеренные фаги. Лизогения. 6. Фагодиагностика и фагоиндикация. |