иммунотурбидиметрия. Иммунотурбидиметрия. Зао диаконИммунотурбидиметрия высокоточное определение специфических белков
 Скачать 181.3 Kb.
|
|
ЗАО «ДИАКОН» Иммунотурбидиметрия – высокоточное определение специфических белков, имеющих большую диагностическую и прогностическую значимость. Иммунотурбидиметрическое определение концентрации специфических белков сыворотки крови, спинно-мозговой жидкости и мочи – один из наиболее прогрессивных методов современной лабораторной диагностики. Иммунотурбидиметрия (ИТ) применяется тогда, когда в практике КДЛ концентрацию белка нельзя определить методами измерения его ферментативной активности. В целом ИТ имеет большое диагностическое значение и используется как для диагностики заболеваний, так и и для оценки рисков возникновения серьезных патологий, пока они еще находятся в бессимптомной, субклинической стадии, для прогнозирования состояния пациента и для мониторинга эффективности его лечения. Турбидиметрия – этометод, предназначенный для измерения концентрации белков по изменению интенсивности светорассеивания мутных растворов при прохождении через них светового потока. В лабораторной диагностике ИТ применяется в основном для определения концентрации индивидуальных белков при образовании комплекса антиген- антитело (Ag/Ab). Именно образование такого комплекса и приводит к повышению мутности раствора, которая и измеряется прибором. Для ИТ необходимо построение калибровочного графика с использованием нескольких (обычно, от трех до пяти) концентраций калибратора, так как калибровочный график имеет нелинейный характер. Существенным требованием к автоматическим фотометрам и биохимическим анализаторам, используемым для ИТ, является наличие в их программе возможности определять концентрацию веществ по нелинейной калибровочной зависимости Как построить калибровочный график для ИТ? Кривая доза-эффект. Отношение между концентрацией антигена и преципитировавшим антителом описывается кривой Heidelberger-Kendall, которую следующим образом делят на три разные зоны (Рис.1): 1. Избыток антитела – Первая зона - область соотношения концентраций антитегнов и антил, в которой существует низкое отношение молекул антигенов и антител (Ag/Ab) из- за избытка антител. При этом образуется небольшое количество преципитата, но поскольку концентрация антигена все увеличивается, осаждение происходит. 2. Зона эквивалентности – Вторая зона - область, в которой складывается оптимальное отношение концентраций антигена и антитела. Поскольку больше молекул антигена связывается с антителами, точка максимума образования преципитата достигнута. В растворе мало или совсем нет молекул свободного антигена или свободных антител. 3. Избыток антигена – Третья зона, в которой отношение антигенов и антител увеличивается. Из-за высокой концентрации антигенов образование мелких, растворимых иммунных комплексов с полным составом Ag2Ab преобладает над большими преципитатами. Мелкие комплексы имеют недостаточно большой размер, чтобы преципитировать из раствора, и не могут быть обнаружены обычным рассеиванием света. Принципиальная структура этой кривой, имеющей максимум - характерная особенность всех иммунохимических методов исследования. Важным следствием такого отличительного поведения кривой является наличие двух возможных концентраций антигена, которые произведут одинаковый сигнал: одна, когда исследование находится в зоне избытка антитела и другая, когда в избытке антиген. Поэтому концентрация антитела в образце должна быть установлена на уровне, который гарантирует избыток антитела для всех ожидаемых концентраций антигена (Зона 1). Зона 1. Избыток Зона 2 - Зона 3. Избыток Антител эквивалентности антигенов Рис. 1. Кривая доза – эффект при ИТ. Подробности в тексте. Для иммунотурбидиметрических измерений необходимо, чтобы они проводились в Зоне 1 - избытка антител. Только этот восходящий участок кривой доза – эффект используется в качестве калибровочного графика. Иное будет неправильным ! Калибровочная кривая строится: • для каждого индивидуального белка, • для каждого прибора, • при любом изменении условий регистрации и • периодически по мере проведения исследований Рис. 5. Типичный калибровочный график для ИТ определения концентрации специфических белков. Для построения графика обычно требуется 3-5 стандартных растворов антигена (с разными концентрациями определяемого белка). В настоящее время используются калибраторы (стандарты) с разным уровнем концентрации аналита, определенного точным (лучше референтным) методом. На оси абсцисс откладывается концентрация с, а на оси ординат – плотность D. На оси D откладывают все полученные значения D i , соответствующие концентрациям c i . Через скопление точек наилучшим образом проводят линию - калибровочный график. При серийных исследованиях в стандартных условиях допускается корректировка графика на основании измерения одного из стандартов. Это основано на том, что характерный вид стандартной кривой не меняется из-за влияния систематических факторов, а происходит параллельный сдвиг всего графика. В этих случаях производят пересчет графика, так, чтобы он шел параллельно первичной кривой, но проходил бы через новую точку. Для построения калибровочного графика используются стандарты из соответствующих наборов калибраторов, которые DiaSys предоставляет пользователям или их необходимо выписывать отдельно. Как избежать неправильных измерений в прозоне Обычно состав реакционной смеси подбирается производителями так, чтобы измерения проводилась в зоне избытка антител. Однако при очень высокой концентрации белка в образце антител для образования иммунного комплекса может не хватать (избыток антигенов). В этом случае частицы преципитата становятся мелкими, определение попадает в нисходящую часть кривой доза-эффект (Зона 3, избыток антигена). В Зоне 3 при увеличении концентрации белка сигнал прибора уменьшается, называется она также прозоной. В итоге, при измерении в прозоне будет получен неправильный результат (вместо высокой концентрации - низкая концентрация белка). Чтобы этого избежать необходимо развести образец. Если при этом сигнал прибора увеличивается, это свидетельствует о том, что предыдущее определение проводилось в прозоне и полученный результат был не правильным. Разведение образца проводят до такой концентрации белка, чтобы она располагалась в зоне избытка антител (Зона 1). Полученный при конечном разведении результат умножают на степень разведения. Обычно, в инструкции по применению наборов указывается, до какой максимальной концентрации антигена в образце эффект прозоны отсутствует. Компания DiaSys использует в своих тестах такой избыток антител, что эффект прозоны практически отсутствует, это позволяет проводить уверенные измерения даже с высокими концентрациями анализируемого белка.. Рекомендуемая литература: Долгов В.В., Шевченко О.П., Шарышев А.А., Бондарь В.А., «Турбидиметрия в лабораторной практике». - М. Реафарм, 2007, 176 стр. |