Зертханалық жұмыс -2. Зертханалы жмыс 2 Таырыбы
 Скачать 144.43 Kb.
|
|
Зертханалық жұмыс №2 Тақырыбы: Қоректік орталарды, ыдыстарды залалсыздандыру әдістері Жұмыстың мақсаты: Биотехнологиялық зерттеу жүргізуде ыдыстарды дайындау тәсілдерін меңгеру. Қоректік орталарды, ыдыстарды, құрал-саймандарды залалсыздандыру режимімен, автоклав қондырғысымен және оның жұмыс жасау ережелерімен таныстыру. Құралдар, материалдар:Бу залалсыздандырғышы, кептіргіш шкаф; ыдыстар: Петри табақшасы; 1 мл градуирленген пипеткалар, пробиркалар, әртүрлі көлемді жайпақ түпті немесе домалақ түпті колбалар. Теориялық бөлім Залалсыздандыру дегеніміз қоректік орталарда, ыдыстарда және басқа объектілерде микроорганизмдердің толық жойылуын айтады. Залалсыздандыру зерттелетін объектіге қатысты патогенді және патогенді емес барлық микрофлораның жойылуын қамтамасыз етеді. Ол материалдың бұзылуына немесе онық физикалық және химиялық күйін өзгертпеу қажет. Сондықтан залалсыздандырылатын объектілердің физикалық қасиеттеріне және залалсыздандыру мақсатына байланысты әртүрлі әдістер: ыстық (ылғалды, бөлшектеп, құрғақ залалсыздандыру) және салқын (механикалық, иондық, ультрадыбысты, ультракүлгін сәулелі залалсыздандыру)қолданылады. Қысым қатысында бумен залалсыздандыру – қоректік орталарды және ыдыстарды залалсыздандыру әдісі бактериологиялық практикада тиімді болып саналады, бұл әдістің көмегімен толық залалсыздандыру жүреді. Залалсыздандырудың бұл тәсілі қайнау кезінде түзілген бу сыртқа шықпайды, тұйық кеңістікте жинала отырып, қысымды жоғарылатады. Жиналған қысымнан судың және будың температурасы жоғарылайды. Қысым қатысында бумен залалсыздандыруды бу стерилизаторларында жүзеге асырады. Ағынды бумен залалсыздандыру бұл әдіс қоректік орталарды 100 °С жоғары температурада қыздыруға болмайтын қоректік орталарға пайдаланылады. Залалсыздандыру 100°С температурада 30...60 минуттан 3 тәулік аралығында жүргізіледі. Сондықтан бүл әдісті бөлшектепзалалсыздандыру деп те атайды. Дробная залалсыздандыру мынадай принципке негізделген: 100°Стемператураға дейін 30...60 минут аралығында қыздыру барысында барлық вегетативті клеткалар жойылады, ал споралары тіршілікке қабілетті болып қала береді. Залалсыздандыру арасында споралар вегетативті клеткаға айналады. Бір тәуліктен соң залалсыздандыруды қайталайды. Көбінесе үшінші залалсздандырудан кейін объектінің толық залалсыздандыруға қол жеткізеді. Тиндализация – бөлшектеп залалсыздандыру 56…58°С температурада жүзеге асырылады. Бұл әдіс 100°С температураға дейін залалсыздандыруға болмайтын қоректік орталарға қолданылады. Мұндай қоректік орталарды 5...6 тәулік аралығында күн сайын 1 сағаттан қыздырады. Қыздыру барысында залалсыздандыратын сұйықтықты термостатта сақтайды. Яғни қалып қойған тірі споралар вегетативті клеткаға айналғандықтан қыздыру кезінде тіршілігін жояды. Тиндализацияны арнайы термореттегіші бар құралдарда немесе су моншасында жүргізеді. Залалсыздандырудың құрғақ әдісі. Микробиологиялық зертханада жұмыс жүргізу барысында термиялық залалсыздандырудың құрғақ әдісінің келесі түрлері қолданылады: Жалында күйдіру (фламбирлеу)егу алдында бактериологиялық ілмек, инелерді залалсыздандырудың өте тез әрі тиімді тәсілі. Бұл әдіспен майда металдық заттарды (пинцет, скальпел) және жабынды шыныларды залалсыздандыруға болады. Күйдіруді жалын үстінде жүзеге асырады. Құрғақ ыстық ауада залалсыздандыру әдісі микробиологиялық ыдыстарды (пипеткалар, Петри табақшалары) залалсыздандыру үшін қолданылады. Залалсыздандыруды 150-170°С температурада 1...1,5 сағат аралығында Пастер пештерінде немесе кептіргіш шкафтарда жүргізеді. Суық залалсыздандыру әдістері Механикалық залалсыздандыру (сүзу). Бұл әдіс қыздыруға болмайтын қоректік орталарды залалсыздандыруға ғана қолданады. Механикалық залалсыздандыруда залалсыздандырылатын сұйықтықты ұйықтықта өлшенетін бөлшектерді және микроптарды ұстап қалатын бетінде өте майда саңлауы бар арнайы сүзгіш құралдар арқылы сүзеді. Микробиологиялық практикада сүзу процесінде әртүрлі сүзгіш құралдар (Зейтц құралы, Шамберлен, Мандлер, Беркефельд шамдары және т.б.) қолданылады. Химиялық залалсыздандыру. Практикада залалсыздандырудың бұл түрін қоректік орталарды дайындауда шектеулі түрде қолданады. Зертханалық практикада кейбір химиялық қосылыстарды, атап айтқанда толуол, хлороформ, эфир және т.б. қоректік орталардың бактериальді ластануын алдын алу үшін пайдаланады. Қоректік ортаны консерванттан босатуүшін су моншасында 56°С температурада қыздырады. Химиялық залалсыздандыруды сонымен қатар құралдарды, бөлмелерді,қолданған ыдыстарды және өнделген микробиологиялық материалды дезинфекциялауда қолданады. Дезинфекциялаушы қосылыстар ретінде құрамында белсенді хлор бар химиялық қосылыстар (хлорамин, хлорлы әк тас) кеңінен қолданады. Ультракүлгін сәулелермен залалсыздандыру. Залалсыздандырудың бұл тәсілі микробиологиялық зерттеулер жүргізу алдында микробиологиялық бокстың және зертхананың ауасын залалсыздандыру үшін қолданады. Ультракүлгін сәулелермен залалсыздандыруда бактерицидті лампалар көмегімен жүргізеді. Қоректік орталарды қысым астында қаныққан бумен заласыздандыру (автоклавтау). Бұл қоректік орталарды заласыздандыруда қолданылатын маңызды әрі жиі қолданылатын әдіс болып саналады. Ол материалды атмосфералық қысымнан жоғары қысымда қаныққан су буымен қыздыруға негізделген. Будың температурасы қысым жоғарылаған сайын өседі (2-кесте). Кесте 2 - Әр түрлі қысымдағы қаныққан будың температурасы
Қысым астында бумен заласыздандыруды арнайы герметикалық жабылған қалың қабырғалы аппарат - автоклавтарда жүргізеді. Автоклав - жоғары қысымды ұстап тұруға қабілетті қос қабырғалы металл резервуар (8-сурет). Оның ішкі бөлігі-стерилизациялайтын камера (1). Оған залалсыздандырылатын материал орналастырылады. Заласыздандыратын камера ауа шығаратын құбырмен (2), бу қысымын анықтайтын манометрмен (3), қысым жоғарылағанда буды шығаратын және автоклавтың жарылуын болдырмайтын сақтандырғыш қақпақшалармен (4) жабдықталған. Субулы камера деп аталатын қабырғалар арасындағы кеңістік (5) құйғыш (6) арқылы автоклавтың арнайы су өлшейтін құбырында (7) көрсетілген деңгейге дейін сумен (көбік түзілмес үшін дистилденген су) толтырылады. Бұл деңгейден суды асыруға болмайды, себебі су қатты қайнағанда манометрге жалғанған құбырға түсіп, оның көрсеткішін өзгертіп жіберуі мүмкін. Су булы камераның ішкі қабырғасының жоғарғы бөлігінде бу залалсыздандыратын камераға түсетін тесік (8) болады. Булы котел жоғары жағынан қорғаныштық қаптамамен (9) қапталған. Ол котелді механикалық зақымданудан, ал автоклав айналасында жұмыс жасаушыларды күйіп қалудан сақтайды. Автоклав герметикалылығын түзу үшін резиналы массивті қақпақпен (10) тығыз жабылады.  Сурет 8. Автоклавтың сызбанұсқасы: 1 - залалсыздандырушы камера; 2 - ауаны шығаратын кран; 3 - манометр; 4 - сақтандырғыш қақпақша; 5 - субулы камера; 6 - автоклавты сумен толтыруға арналған құйғыш; 7 - су өлшегіш түтік; 8 - залалсыздандырушы камераға будың түсуін жүзеге асыратын тесік; 9 - қорғаныштық қаптама; 10 - автоклавтың қақпағы; 11 - залалсыздандыратын затты орналастыратын тіреуіш Қоректік ортаны залалсыздандыруға дайындау. Автоклавтауда буланудың нәтижесінде 3-5% сұйықтық жоғалады, сондықтан дайындалатын ортаға көлемінен жоғары шамамен 5% дистилденген су қосады. Әдетте қоректік орталарды пробиркаларда, колбаларда, бөтелкелерде залалсыздандырады. Қоректік орталарды залалсыздандыруда арнайы тығындар қолданылады. Тығындарды дайындау үшін талшықтарды бойлай алынған мақтаның жіңішке бөлігін тегістеп орайды. Тығынға мықтылық беру үшін оны үстелде жатқан таза шыны мен алақанның арасында орайды. Кәдімгі пробирка үшін тығынның ұзындығы шамамен 4см болу керек. Тығын пробиркаға 1,5-2,0 см шамасында кіріп тұруы керек(9-сурет). Тығынның формасын сақтау үшін оны пробирканың аузынан жайлап айналдырып алады. Тығынды таза дәке сулықпен орау ыңғайлы болып табылады. Тығындарды залалсыздандырудың алдында оны пергамент қағаз қалпақшамен жабуға болады. Автоклавта залалсыздандыратын түтіктердің тығынын бу өткізбейтін целлофанмен, фольга немесе басқа да материалдармен орауға болмайды, себебі атмосфералық бу міндетті түрде тығын арқылы түтікке өту керек, әйтпесе қоректік орта қажет температураға дейін қыздырылмайды және залалсызданбайды. Шыны, резина және басқа да тығындарды қолданғанда оларды орағыш қағаздың екі қабатымен орайды және мақталы тығынмен жабылған кішкентай шыны сауытпен байланысқан күйде залалсыздандырады. Түтіктегі тығынды оттың жалынында стерильді түрде ауыстырады.  Сурет 9. Мақта тығындар: А- дұрыс дайындалған, Б және В – дұрыс емес дайындалған Автоклавтау режимін таңдау. Микробиологиялық тәжірибеде автоклавтағы залалсыздандыру 111-138°С температура аралығында және 0,5-2,5 атмосфералық қысымда жүргізіледі. 111°С-тан төмен және138°С-тан жоғары температураны дұрыс көрсеткіш деп санауға болмайды, себебі будың қысымы жоғары болған сайын автоклав эксплуатациясының шарттары қиындайды. Вакуумды насосы жоқ автоклавтарды қолданған кезде залалсыздандырудың мына режимдерін қолданған дұрыс көрсеткіш болып саналады: 121°С температурада (1атм.) 15-45 мин. және 126°С (1,5 атм.) температурада 10-30 мин құрайды. Ыдыстардың көлеміне қарай залалсыздандыру режимдері 3-кестеде көрсетілген. Қоректік орталарды автоклавтау температурасы мен ұзақтығы олардың құрамымен, термотұрақтылығымен немесе термотұрақсыздығымен анықталады. Сүт немесе желатинді орталар сияқты тез бұзылатын субстраттарды, сонымен қатар құрамында қант, витаминдері бар субстраттарды (сыра суслосы, ашытқы автолизаты және басқалар) әдетте 0,5 атм. қысымда 15-30 мин. аралығында залалсыздандырады. Ет-пептонды орталарды 1,0 атм. қысымда 20 мин залалсыздандыруға болады. Агар қосылған орталарды залалсыздандыру қиындау, себебі залалсыздандыру агар ерігеннен кейін бірақ басталады. Бірақ еріген агарды да залалсыздандыруға көп уақыт жұмсалады. Әр түрлі ұнтақтар (мысалы, тальк) мен жабысқақ сұйықтарды автоклавта залалсыздандыру оңайға соқпайды, себебі олар жылуды нашар өткізеді және өте жай қызады. Оларды 170°С температурада 2 немесе 1 сағат аралығында кептіргіш шкафтарда стерилдеген дұрыс. Бұл жағдайда майдың немесе ұнтақтың қабаты 1,5 см-ден аспауы керек. Ерекше термотұрақтылығымен ерекшеленетін, споралы субстраттар болады. Оларға топырақ жатады, себебі олар жай жылдамдықпен қыздырылады. Оны әдетте 1 атм. қысымда 2 сағатта 1 рет немесе екі тәулік қатарынан 1 сағаттан, кейде 2 атм.қысымда 2 сағат залалсыздандырады. Кесте 3 – Ыдыстардың көлеміне байланысты сұйықтарды залалсыздандыру ұзақтығына тәуелділігі
Залалсыздандыру режимін таңдағанда қоректік ортаның рН-ын ескерген жөн. Көптеген заттар қышқылды реакциялар кезінде гидролизге ұшырайды. рН мәні төмен, температура жоғары және залалсыздандыру уақыты ұзақ болған сайын, гидролиз қарқынды жүреді. Кейбір жағдайларда залалсыздандыру процесінде ортаның рН-ы өзгеріп кетеді. Егер көмірсулары бар ортаның рН-ы 7,0-ден жоғары болса, онда оны рН мәні 6,0-ге жеткенше қышқылдандыру керек. Негізінен бұл көп жағдайда ксизолоза қатысында бақыланады. Мұндай құбылысты болдырмау үшін көмірсуларды, фосфаттарды, темір тұздарын дистилденген суда концентрленген ерітінділерде бөлек автоклавтау ұсынылады. Залалсыздандырудан кейін ерітінділер стерильді түрде қажет қатынаста біріктіріледі. Сыйымдылықтың формасы мен қабырғасының қалыңдығы да маңызды рөл атқарады. Мұны тәжірибелік жұмыс барысында ескерген жөн. Мысалы, термосезімтал субстратты бір мезетте пробиркада және үлкен бөтелкелерде залалсыздандыруға болмайды. Автоклавтаудан кейін қоректік ортанын тазалығын тексеру үшін 30°С температурада 2-3 тәулікке термостатқа қояды. Егер қоректік ортада микроорганизмдердің өсуі байқалса, онда жаңадан қоректік орта дайындайды. | ||||||||||||||||||