Анаэробы. Анаэробы. Лабораторная диагностика
 Скачать 19.94 Kb.
|
|
Анаэробы. Лабораторная диагностика Лабораторную диагностику патогенных анаэробов проводят по схеме 1) бактериоскопия исходного материала; 2) посев для выделения возбудителя и его идентификации; 3) обнаружение токсина. В первую очередь при подозрении на ботулизм нужно обнаружить и идентифицировать токсин; выделение возбудителя — вторичный этап. Материалом для исследования при ботулизме служат: остатки пищевых продуктов, материал, полученный от больного (кровь, испражнения, моча, промывные воды желудка, рвотные массы), и секционный материал. Кровь берут из вены пациента в количестве 5—10 мл; промывные воды из желудка забирают в объёме 50-100 мл, кал — 50-60 г. На секции забирают кусочки печени (50-60 г), отрезки кишечника и желудка и их содержимое. До поступления в лабораторию образцы хранят на холоде. • Кровь исследуют только на наличие токсина ботулизма (для чего проводят биологическую пробу); испражнения — только на наличие возбудителя (проводят посев на питательные среды), весь остальной материал — на наличие возбудителя и его токсина. • Банки с консервами при ботулизме выдерживают в термостате 10-12 сут, стерильно отбирают 50-100 г, растирают и центрифугируют. В надосадочной жидкости определяют наличие токсина, в осадке — возбудителя. • Мясо и рыбу при ботулизме обрабатывают спиртом и забирают пробы из внутренних частей (пробы рыбы рекомендуют брать от хребта и внутренних органов). Пробы изучают аналогично исследованиям консервированных продуктов. При подозрении на столбняк: Раневой секрет, кусочки тканей, гной, кровь. При подозрении на газовую анаэробную инфекцию кусочки пораженных мышц, отечный экссудат, печень, селезенка, кровь, перевязочный материал. Бактериоскопический метод диагностики анаэробов: Окраска по Граму, Муромцеву. C.botulinum - Крупные палочки с закругленными концами, споры расположены субтерминально C.tetani ( столбняк) - Тонкие, стройные палочки до 6 мкм, спора округлая на конце микробной клетки.( барабанная палочка) C. perfringens - Толстые, короткие палочки, располагаются одиночно или попарно. Имеют центрально расположенную спору. Бактериологический метод диагностики. Методы культивирования. Методы культивирования анаэробов. Бактериологический метод диагностики. Физический метод . Вакуумные условия для выращивания анаэробов создают в анаэростате или эксикаторе. Анаэростат – прибор для выращивания микроорганизмов в анаэробных условиях – представляет собой толстостенный металлический цилиндр с герметически привинчивающейся крышкой, на которой имеются вакууметр и два крана для присоединения к вакуум-насосу. Коммерческие микроанаэростаты представляют собой пластиковые цилиндры различного объема с металлическими плотно закрывающимися крышками, на которых также имеются вакууметр и два крана. Химические методы выращивания анаэробов (Метод Аристовского) Материал, исследуемый на наличие анаэробов, засевают на среду в чашки Петри и помещают их в эксикатор, на дно которого кладут химический поглотитель кислорода: гидросульфат натрия или пирогаллол. В расширенную часть сосуда устанавливают на подставке чашки с посевами. Прибор помещают в термостат при температуре 370С на 24-48 часов. Биологический метод выращивания анаэробов (по Фортнеру) В чашку Петри наливают толстым слоем 5% кровяной агар с 1-2% глюкозы. Посередине чашки в питательной среде вырезают стерильным скальпелем канавку шириной 1-1,5 см, которая делит питательную среду на две половины. Одну из них засевают культурой анаэробов или исследуемым на их наличие биологическим материалом, другую половину – культурой аэробов: Serratia marcescens или E.coli. Перед посевом чашки подсушивают в термостате, чтобы анаэробы вместе с капельками влаги не могли попасть на другую сторону чашки. Засеянные чашки закрывают, а свободное пространство между дном и крышкой заклеивают лейкопластырем, чтобы предупредить поступление в чашку кислорода извне. В термостате чашки устанавливают вверх дном. Быстрорастущие аэробы, поглощая находящийся в чашке кислород, создают тем самым благоприятные условия для роста анаэробов. Для накопления анаэробов широко используют среду Китт-Тароцци. На ней С. perfringens растет с интенсивным помутнением и бурным газообразованием. Другие виды образуют помутнение без газа. При посеве на стерильное обезжиренное молоко С. perfringens уже через 4-5 ч вызывает его сбраживание с образованием кирпичного цвета губчатого сгустка, который газ поднимает на поверхность пептонизованои жидкости. Классическим средой для получения изолированных колоний являются кровяной сахарный агар Цейслера (к МПА добавляют 1,5% дефибринированной крови и 2% глюкозы). Чашки с посевами выращивают в анаеростати. На этом агаре колонии основных возбудителей имеют гладкую дискообразной форму серого цвета с ровными или бахромчатые краями и открытым центром, окруженные зоной гемолиза. При посеве материала уколом в столбик агара Вильсон-Блер уже через 3-4 часа в участках роста С. perfringens среду чернеет. Характерные особенности роста на молоке и среде Вильсон-Блер используют для экспресс-диагностики газовой гангрены, вызванной С. perfringens. На желточном агаре рост колоний С. perfringens сопровождается образованием венчика помутнения. Колонии, выросшие на дифференциально-диагностических средах, микроскопируют, пересевают на среду Китт-Тароцци, получают чистую культуру и идентифицируют ее по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам. Палочки ботулизма ферментируют глюкозу, галактозу, глицерин, мальтозу, сахарозу, фруктозу до кислоты и газа, разжижают желатин, выделяют H2S, не образуют индол. Для дифференциации С botulinum от других анаэробов используют и другие тесты. Определение сероваров возбудителя ботулизма осуществляют с помощью реакции нейтрализации токсина in vivo (на мышах), методом ИФА или в РНГА. Возбудитель ботулизма - Clostridium botulinum вырабатывает токсины семи сероваров (А, B, C, D, E, F, G), однако чаще других встречаются серовары А, В, Е. Все токсины отличаются по антигенным свойствам и могут быть дифференцированы в реакциях типоспецифическими сыворотками. Для этой цели можно поставить реакцию пассивной (непрямой) гемагглютинации с сывороткой больного, в которой предполагается наличие токсина, и эритроцитами, нагруженными антителами антитоксических противоботулинических сывороток типов А, В, Е. Контролем служит нормальная сыворотка. Аналогичные реакции ставят для обнаружения токсина газовой анаэробной инфекции. Учет результатов РНГА, поставленной с целью обнаружения ботулотоксина. Положительный – зонтик, отрицательный – пуговка. Для обнаружения столбнячного токсина проводят РОПГА. В ряде развитых стран оранизовани специальные лаборатории, в которых используются современные аппараты и тест-системы для культивирования и идентификации анаэробов, а также боксы, где все посевы, пересев и другие манипуляции проводят при полном отсутствии кислорода воздуха. Однако в рутинных бактериологических лабораториях выделения и полную идентификацию чистых культур проводят редко, поскольку весь процесс занимает много времени, требует сложных и дорогостоящих питательных сред и специальных приборов. В связи с этим для более быстрой диагностики анаэробной газовой инфекции и выбора соответствующих лечебных антитоксических сывороток проводят определение типов экзотоксинов с помощью реакции нейтрализации in vivo. Биологические исследования Для постановки теста нейтрализации используют видовые диагностические антитоксические сыворотки, центрифугат (фильтраты) бульонных культур и белых мышей массой 16-18 г. В 6 пробирок вносят по 0,9 мл центрифугату, затем в 5 из них добавляют по 0,6 мл антитоксических сывороток к основным видам возбудителей. В 6-в пробирку вносят 0,6 мл изотонического раствора хлорида натрия (контроль). Смеси выдерживают в термостате в течение 40 мин и каждую из них в объеме 0,5 мл вводят двум мышам. Видовую принадлежность культуры (токсина) определяют за мышами, выживших при гибели животных контрольной и других исследовательских групп. В лабораториях, где есть возможности работать с культурами тканей, реакцию нейтрализации ставят на трипсинизованих клетках 10-12 дневных куриных эмбрионов. Токсигенность можно определить еще на этапе роста изолированных колоний. Для этого колонию эмульгируют на стекле в капле акридинового оранжевого, накрывают покровным стеклом и исследуют под люминесцентным микроскопом. Наличие только зеленых палочек свидетельствует об их токсигенности. Красные или зеленые с красными фрагментами бактерии проявляют при слабой продукции токсинов или при полном их отсутствии. Можно установить вид и тип токсина в реакции преципитации на стекле в агаровом геле с фильтратом и соответствующие антисыворотки в реакции торможения in vitro специфическими антителами лецитиназной или лейкотоксичнои активности фильтратов или раневых экссудатов. Еще быстрее и точнее устанавливают виды возбудителей газовой гангрены с помощью газовой хроматографии, которая позволяет определять их по качественным и количественным содержанием насыщенных и ненасыщенных жирных кислот. |