напр дифф-ка МСК. Дифференцировка проявление различий между клетками (внешнее выражение детерминации) в виде формирования морфологических и функциональных признаков специализации клеток
 Скачать 19.07 Kb.
|
|
Дифференцировка — проявление различий между клетками (внешнее выражение детерминации) в виде формирования морфологических и функциональных признаков специализации клеток. [1] Дифференцировка как свойство стволовых клеток (СК) подразумевает собой многочисленные циклы деления, в результате чего образуется дочерняя популяция определенных видов специализированных клеток. Чаще всего используют классификацию стволовых клеток по способности к дифференцировке: тотипотентные, плюрипотентные, мультипотентные и унипотентные. Также стволовые клетки делятся на эмбриональные, фетальные и взрослые. Взрослые (соматические) СК — недифференцированные клетки, которые находятся (проживают) в дифференцированной (специализированной) ткани. Взрослые СК также способны к самоподдержанию и к производству более коммитированного потомства (клеток-предшественников), которые в свою очередь дифференцируются в зрелые специализированные клеточные линии. Источником взрослых СК клеток могут быть: костный мозг, периферическая кровь, пуповина новорожденных, кровеносные сосуды, кожа, головной мозг (желудочки мозга), печень, скелетные мышцы, роговица и сетчатка глаза, дентальная пульпа, поджелудочная железа, слизистая носа, слизистая ЖКТ. В костном мозге существуют 2 основных типа стволовых клеток: гемопоэтические СК (ГСК), дающие начало всем клеткам крови in vivo и клеткам-предшественникам для различных ростков кроветворения, а также различных уровней их дифференцировки в культуре in vitro, и мехенхимальные (стромальные) СК (МСК). Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) (стромальные) — мультипотентные стволовые клетки, способные дифференцироваться в остеобласты (клетки костной ткани), хондроциты (хрящевые клетки) и адипоциты (жировые клетки). Предшественниками ММСК в эмбриогенный период развития являются мезенхимальные стволовые клетки (МСК). Они могут быть обнаружены в местах распространения мезенхимы, то есть зародышевой соединительной ткани. Главными функциями МСК костного мозга в организме являются: 1. Формирование гемопоэзиндуцирующего микроокружения. 2. Формирование стромального микроокружения. 3. Участие в морфогенезе. 4. Самоподдержание и восстановление пула МСК. 5. Участие в гомеостатических реакциях организма и в процессах регенерации, репарации и адаптации системы мезенхимальных клеток в норме и патологии. 6. Способность (прямо и опосредованно) взаимодействовать с клетками иммунной системы посредством растворимых факторов и клеточно-контактным взаимодействием, и в значительной степени модулировать иммунный ответ организма. [4] Основным источником ММСК является костный мозг. Кроме того, они обнаружены в жировой ткани и ряде других тканей с хорошим кровоснабжением, в печени и легком плода, надкостнице. Существует ряд доказательств того, что естественная тканевая ниша ММСК расположена периваскулярно — вокруг кровеносных сосудов. Кроме того, ММСК были обнаружены в пульпе молочных зубов, амниотической (околоплодной) жидкости, пуповинной крови До последнего времени не было описано технологий прямого лабораторного получения мезенхимальных стволовых клеток из ЭСК. В смешанных плотных культурах, дифференцированных эмбриоидных телец наблюдали кавитацию в части агрегатов ЭСК. В этой части материала наблюдали образование фрагментов зародышевого цилиндра, эпибласта, примитивной ЭЭ-эндодермы и клеток примитивной полоски. МСК, как правило, получают путём болезненных, инвазивных процедур из взрослого костного мозга или жира, при этом выход очищенных МСК составляет всего лишь 0,001 % — 0,01 % от клеток костного мозга и 0,05 % от аспирата липосакции. На практике удобнее всего получать МСК из аспирата липосакции, при этом удаляют взрослые адипоциты, которые успели потерять способность к пролиферации. Между тем взрослые адипоциты легко можно выделить и подвергнуть дедифференцировке в так называемые дедифференцированные жировые клетки (ДДЖК), которые возвращают способность к пролиферации и мультипотентность. Мезенхимальные стволовые клетки применяют для трансплантологии, получая их из костного мозга и пуповинной крови. Мезенхимальные стволовые клетки так же используют для лечения многих заболеваний весьма успешно. Например, их применяют для лечения болезней сердца, например, ишемий и инфарктов миокарда. Так как костная ткань тоже является производной мезенхимальной стволовой клетки, то их можно применять для лечения болезней остеогенеза и восстановления повреждений костей. Наиболее широко мезенхимальные стволовые клетки нашли свое применение в лечении ожогов и дефектов кожи. Судьбу мезенхимальной стволовой клетки в культуре можно решить путем введения в матрицу малых доз определенных факторов или изменений в нише СК. Эти факторы приводят к изменениям (ацетилирование/деацетилирование) определенных эпигенетических генов. Они также могут инициировать каскады различных сигнальных путей через регулирование экспрессии определенных транскрипционных факторов, таких как Oct3/4, c-Myc, NANOG и др., перепрограммируя развитие клеток в остео-, хондро-, адипогенное и др. направления дифференцировки. К таким факторам можно отнести «ключевые» реагенты (дексаметазон , -глицерофосфат и аскорбиновая кислота — для остеогенеза; дексаметазон, изобутил-метаксантин и индометацин — для адипогенеза; трансформирующий фактор роста, TGF- для хондрогенеза и так далее. За последние годы интерес к изучению гетерогенных МСК, наделенных высокой пластичностью к адаптивной дифференцировке и репрограммированию, нарастал из-за более очевидных возможностей их практического применения. Любые проекты с ЭСК в клинике сопряжены с комплексом трудно решаемых технических, моральных, социальных последствий в области репродуктивного и терапевтического клонирования. Главные проблемы в идентификации линий МСК в культуре связаны с принципом «неопределенности», начинающим работать в популяции изолированных МСК. Их генетическая «избыточность», обсловленная гигантской базой мРНК. У МСК есть резервы в up-stream репрограммировании генома: часть клеток, пересаженных в бластоцисту, встраивались в зародышевые листки и давали клеточные линии – производные экто-, мезо- и эндодермы. Большинство недифференцированных МСК в культуре не имеют генов плюрипотентности. Однако до 30% клеток содержат СD133 (белок плюрипотентности, наделенный способностью находиться в ядре в комплексе с тумор-супрессором р53). МСК с экспрессированным CD133 активнее ре-эпителизуются in vitro. Важная особенность МСК постнатального – это потеря способности генерировать зародышевые листки и экстра-эмбриональные провизорные линии клеток. По этой причине, большинство лабораторных путей дифференцировки МСК в кардиомиоциты, эндотелий, остеобласты, гепатоциты, эндокринные клетки поджелудочной железы работают по «укороченной» программе, минуя промежуточные стадии эмбриональной индукции между зародышевыми листками и экстраэмбриональными тканями. В настоящее время описано несколько довольно простых путей дифференцировки МСК в эндотелиальные клетки в культуре. (СЛАЙД)
Были опубликованы статьи, в которых представлен иммунофенотип ММСК и направления ортодоксальной дифференцировки. К ним относится дифференцировка в клетки костной, жировой и хрящевой тканей. Был проведён ряд экспериментов по дифференцировке ММСК в нейроноподобные клетки, но исследователи по-прежнему сомневаются, что полученные нейроны являются функциональными. Эксперименты также проводятся в области дифференцировки ММСК в миоциты — клетки мышечной ткани. Касательно направленной дифференцировки стволовой мезенхимной клетки по нейрональному пути разработан следующий метод: выделение стромальных клеток из костного мозга человека (ребро или подвздошная кость) → культивирование стромальных стволовых клеток → добавление ретиноевой кислоты в культуру стволовых клеток → нейральные элементы. ММСК, в частности, можно выделить из пульпы зуба человека. Пульпу зуба извлекают в асептических условиях, разрезают на мелкие кусочки стерильным скальпелем и посещают в культуральную среду аMEM c добавлением 10% эмбриональной сыворотки коров, пенициллина-стрептомицина. После десяти суток инкубации при температуре 37⁰С во влажной атмосфере с содержанием 5% СО2 клетки образовывают монослой. Культуральную среду меняют каждые двое суток. По эксперименту, проделанному на базе КФУ в Департаменте генетики и биоинженерии университета Едитепе, г. Стамбул, Турция, клетки направили на остеогенную дифференцировку. Клетки высевали на 6-луночные плашки в концентрации 3000 клетки/см2. На следующий день к клеткам добавляли Плуроник Р85 (Basf) в конечной концентрации 0,01% (по весу). После инкубации в течение суток культуральную среду заменили на дифференцировочную среду. Через семь суток дифференцировки выделяли общую РНК из клеток, синтезировали ДНК и проводили количественный анализ экспрессии мРНК гена остеонектина с помощью метода ПЦР в реальном времени. В результате выяснилось, что обработка ММСК Плуроником Р85 значительно повысила экспрессию гена остеонектина. Полученные данные могут быть применимы в тканевой инженерии |