ёПравила работы в микробиологической лаборатории
1. Пройти инструктаж по технике безопасности для работы в микробиологической лаборатории и расписаться в соответствующей ведомости.
2. В лабораторию микробиологии не допускается заходить в верхней одежде, вносить посторонние предметы.
3. Приступать к занятиям в хлопчатобумажном халате.
4. Перед выполнением лабораторного занятия следует ознакомиться с заданием. Обязательны записи наблюдений и зарисовки микроскопических объектов в тетради. При изображении разных объектов следует соблюдать масштаб и правильное соотношение размеров. Результаты лабораторных опытов оформляются в виде выводов.
5. Обязательно соблюдать правила безопасности с химическими реагентами и красителями. Легко воспламеняющиеся вещества, например, смесь эфира и спирта – не ставить на столы с источниками открытого огня.
6. Запрещается использовать для работы неисправные электроприборы и другое оборудование, в случае неполадок поставить в известность преподавателя.
7. Студенты ответственны за используемые на занятии микроскопическую технику и лабораторное оборудование.
8. Для исключения возможности распространения микроорганизмов запрещается оставлять открытыми чашки Петри, колбы и т.д. с культурами микроорганизмов, так как некоторые из них могут быть аллергенами.
9. Воздух в лаборатории необходимо периодически дезинфицировать проветриванием или облучением светомультрафиолетового спектра (λ 200400 нм). В лаборатории запрещается находиться при включенной бактерицидной лампе.
10. Все прижизненные препараты после просмотра и пипетки, бывшие в употреблении, должны опускаться в эксикатор с водным раствором дезинфицирующей смеси.
11. После завершения работы с микроскопом нужно протереть иммерсионный объектив сухой салфеткой, затем – смоченной в бензине или этиловом спирте и снова протереть сухой салфеткой.
12. В лаборатории микробиологии необходимо строгое соблюдение порядка и чистоты. Рабочее местоследует дезинфицировать перед началом занятия, а также после его окончания).
13. Рабочее место после окончания лабораторного занятия нужно привести в порядок, помыть руки.
1.2. Правила работы с культурами микроорганизмов
В лаборатории микроорганизмы можно выращивать на плотных и в жидких питательных средах, разливая их в пробирки, колбы и чашки Петри
Состав питательной среды определяется потребностями микроорганизмов в химических веществах, необходимых для синтеза компонентов клетки и обеспечения энергетических затрат.
Из-за разнообразия метаболических процессов микроорганизмов невозможно создать универсальную питательную среду, пригодную для роста всех культур
По составу выделяют:
натуральные – растительные и животные компоненты
синтетические- соединения извест. состава для опред. услов.
полусинтетические среды- содержат вещества извест. хим. состава, но в них всегда вносятся соед. неопределен. Состава
Известны два метода стерилизации: термическая и холодная
Выбор стерилизации определяется физико-химическими свойствами стерилизуемого материала.
1.3. Знакомство с иммерсионным объективом оптического микроскопа
Микроскоп состоит из двух частей: механической и оптической. К механическим частям относятся тубус, штатив с предметным столиком. Оптическая часть состоит из осветительного устройства, объектива и окуляра. Окуляр имеет 2 линзы – глазную (верхнюю) и собирательную (нижнюю), которые выполняют роль лупы. Окуляр служит для рассмотрения изображения предмета, даваемого объективом, и имеет увеличение в 5, 7, 10, 12, 15 и 20 раз что указано на его оправе.
Объектив дает действительное увеличение и обратное изображение изучаемого микроскопиче- 10 ского объекта; состоит из системы линз, заключённых в металлическую оправу, на которой обозначено увеличение объектива. В световой микроскопии объективы разделяются на сухие и иммерсионные. Сухие объективы имеют увеличение в 8, 10, 40 раз, а иммерсионные – в 90, 100 раз
Микроскоп характеризуется двумя основными функциями: увеличением и разрешающей способностью.
Между иммерсионным объективом и микропрепаратом с исследуемым объектом помещают каплю кедрового масла, показатель преломления которого близок к показателю преломления предметного стекла. Между стеклом и линзой устанавливается гомогенная среда и поэтому все лучи падающего света не преломляются, не изменяют своего
направления и, попадая в иммерсионный объектив, обеспечивают лучшее освещение объекта.
Ход работы
1) Настраивают освещённость поля на малом увеличении, добиваясь яркого и равномерного освещения всего поля зрения.
2) Микропрепарат устанавливают на предметный столик. На малом увеличении находят наиболее подходящее поле зрения для микроскопирования объекта. Препарат закрепляют.
3) Подняв тубус, наносят на препарат небольшую каплю масла.
4) Переводят на иммерсионный объектив.
5) Под контролем глаза (вид сбоку) движением макрометрического винта опускают тубус микроскопа до погружения объектива в иммерсионное масло.
6) Глядя в окуляр и одновременно вращая макровинт на себя, приподнимают объектив до тех пор, пока объект не станет видимым.
7) Микровинтом устанавливают резкость.
8) По окончании работы протирают объектив сухой салфеткой, затем – смоченной в бензине и снова протирают сухой салфеткой.
9) Отработанный препарат освобождают от масла кусочком фильтровальной бумаги, а затем салфеткой, смоченной бензином и помещают в дезраствор.
2. Методы микроскопического исследования микроорганизмов
2.1. Прижизненное изучение микроорганизмов
Цель работы: знакомство с морфологией разных микроорганизмов методом приготовления препарата «раздавленная капля».
Объекты исследования:
1) культура прокариот;
2) пекарские дрожжи Sacharomyces cerevisiae.
Ход работы
Препарат «раздавленная капля»
На предметное стекло наносят каплю дистиллированной H2O, помещая в неё небольшое количество клеток изучаемой культуры микроорганизма с помощью микробиологической петли, которую предварительно стерилизуют обжиганием в пламени горелки. Всё хорошо перемешивают и накрывают покровным стеклом. Культуры микроорганизмов, выращенных на плотной или жидкой питательной среде, переносят в каплю воды микробиологической петлей. Из жидкой питательной среды микроорганизмы можно наносить на предметное стекло стерильной пипеткой без добавления капли воды. Исследуемая капля должна быть маленькой, чтобы после прижатия её покровным стеклом не было избытка жидкости, выступающего из-под него. Избыточную жидкость удаляют фильтровальной бумагой, которую затем нужно опустить в дезинфицирующий раствор.
Препарат «висячая капля»
Каплю суспензии микроорганизмов наносят на покровное стекло, которое опрокидывают каплей вниз и помещают на специальное предметное стекло с углублением (лункой) в центре. При этом капля должна свободно висеть, не касаться дна и краев лунки. Для длительных наблюдений края покровных стёкол смазывают вазелином.
Препарат «отпечаток»
Из агаризованной питательной среды, на которой микроорганизмы растут сплошным газоном или в виде изолированных колоний, вырезают скальпелем небольшой участок, переносят его на предметное стекло таким образом, чтобы поверхность с культурой микроорганизма была обращена вверх. К газону или колонии прикладывают стерильное покровное стекло, слегка надавливают пинцетом, снимают и помещают на предметное стекло отпечатком вниз: в каплю воды или раствор метиленового синего (1:40). Также отпечаток можно получить и на предметном стекле при касании поверхности колонии или газона предметным стеклом. Данный препарат используют, в большинстве случаев, для исследования актиномицетов.
Препарат «микрокультура» («слайд-культура», «агаровая пленка»)
На стерильное и нагретое предметное стекло стерильной нагретой пипеткой наносят 0,1 мл горячей агаризованной питательной среды и распределяют ребром стерильного покровного стекла на участке величиной с покровное стекло. После застывания среды в центр «агаровой плёнки» микробиологической петлёй вносят 0,1 мл суспензии клеток микроорганизма. Предметное стекло с микропрепаратом помещают в стерильную влажную камеру (чашка Петри с 2 слоями фильтровальной бумаги, смоченной дистиллированной H2O). Перед микроскопированием на агаровую плёнку с выросшей микрокультурой наносят каплю красителя или воды (в случае подсыхания среды) и накрывают покровным стеклом. Метод, основанный на выращивании микроорганизмов непосредственно на предметном стекле, позволяет вести микроскопическое исследование роста и развития без нарушения естественного расположения клеток в растущей микроколонии.
Прижизненная окраска микроорганизмов
Для прижизненной окраски микроорганизмов используется малоконцентрированный раствор различных красителей, которые не оказывают губительного действия на их рост и развитие. К таким красителям относятся нейтральный красный, нейтральный синий (метиленовый синий), нейтральный фиолетовый, эозин, эритрозин и др. в разведениях 1: 10 000, 1: 100 000. Для приготовления прижизненного окрашенного препарата в каплю суспензии микроорганизмов вносят каплю красителя и накрывают покровным стеклом.
Данным методом также рекомендуется дифференцировать живые и мёртвые клетки микроорганизмов (например, при исследовании пекарских дрожжей). Мёртвые клетки обычно окрашиваются быстрее и насыщеннее вследствие посмертного повышения проницаемости клеточной оболочки.
Рис. 3. Основные формы бактерий и тип их группирования (схематическое изображение): 1 – кокки, 2 – диплококки, 3 – тетракокки, 4 – стрептококки, 5 – пакеты кокков (сарцины), 6 – палочковидные бактерии, 7 – цепочки
палочковидных бактерий, 8 – вибрионы, 9 – спириллы, 10 – спирохеты
Указать уровень клеточной организации исследованных микроорганизмов и увеличение объектов. Сравнить размеры эукариотных и прокариотных микроорганизмов. Отметить достоинства и недостатки методов прижизненного изучения микроорганизмов.
2.2. Приготовление фиксированных окрашенных препаратов микроорганизмов
Цель работы: знакомство с морфологией и цитологией разных микроорганизмов методом приготовления фиксированного окрашенного препарата.
Объекты исследования: культуры прокариотных и эукариотных микроорганизмов.
Подготовка препаратов фиксированных окрашенных клеток микроорганизмов (постоянного препарата) включает следующие этапы:
1 приготовление мазка;
2высушивание мазка;
3 фиксация мазка;
4 окраска мазка.
Практическая часть
2.1 Прижизненное изучение микроорганизмов
А Б
Рис 1 . Микроорганизмы под микроскопом
А- пекарские дрожжи Sacharomyces cerevisiae.
Б- Культура бактерий из воздуха
Методом приготовления прижизненного препарата «раздавленная капля» были рассмотрены под микроскопом пекарские дрожжи, клетки которых имеют форму эпилептическую и шаровидную , клетка эукариотическая
Увелеч микроскопа в 1000 раз
Таким же методом были изучены прокариотические бактерии из воздуха , имеющие форму «кокки» увелич. В 1000 раз
Размеры эукариотических клеток дрожжей значительно больше размеров прокариотических бактерий из воздуха
Достоинством метода прижизненного изучения организмов являются возможность наблюдения организма в естественном состоянии. Недостатком – подвижность клеток в слое воды , из-за чего нельзя достаточно ознакомится с цитоплазматич особенностями клеток
Часть 2.2. Фиксированные окрашенные препараты микроорганизмов
Для того, чтобы лучше изучить морфо и цитологич свой-ва и особенности микроорганизмов готовят фиксированные окрашенные препараты.
А Б
Рис микроорганизмы под микроскопом в окрашенном фикс состоянии
А - пекарские дрожжи Sacharomyces cerevisiae.
Б Культура бактерий из воздуха
Методом приготов окрашен препаратов микроорганизмов были рассмотрены два вида микроорганизмов под увел в 1000 раз.
Первые микроорганизм -пекарские дрожжи, клетки кот-ых были легко окрашены в синий цвет под действием красителя и имели форму сферическую и эпилептическую. Данные организмы- эукариоты, они больше по размеру прокариотических бактерий из воздуха. Бактерии из воздуха были формой «кокки» , окрашенные красителем в синий цвет.
Данный метод приготов препаратов позволяет лучше изучить морфо и цитологич особенности клеток. Они имеют четкие границы за счет окраски красителя и хорошо видны под микроскопом и не переносятся током воды ,это позволяет четко сфокусировать внимание на микроорганизмах. Недостатком метода явл. Невозможность увидеть орг в естетсвен состоянии, а так же то, что в процессе изготов микроорганизмов их форма может искажаться.
Вывод : в ходе данной лаборат. Работы были изучены эукариотические клетки пекарских дрожжей и прокариотические клетки бактерий из воздуха формы «кокки» с помощью 2х методов. Первый метод – прижизненного изучения микроорганизмов « раздавленная капля» , позволяющий изуить организмы в прижизненном состоянии , но не дает возможности изучить морфо и цитоплазм микроорганизма. Второй метод- метод приготовления фиксированного окрашен. препарата, кот-ый дакет возможность более детального изучения цитологии и морфологию микроорганизма
Лабораторная работа №
Изучение микрофлоры молочнокислых бактерий
Теория:
Молочнокислые бактерии объединяют в отдельную группу микроорганизмов по их основному свойству – способности образовывать молочную кислоту как главного продукта брожения
Молочнокислое брожение, как способ получения энергии, характерно для бактерий, гетерогенных по морфологии, относящихся к родам Lactobacillus, Lactococcus (Streptococcus), Bifidobacterium, Leuconostoc, Pediococcus и др. Молочнокислые бактерии достаточно широко распространены в природе. Естественной средой их обитания являются молоко и молочные продукты, поверхность растений и ризосфера, желудочнокишечный тракт животных и человека, гниющий ил и др.
Молочнокислые бактерии – неподвижные микроорганизмы, не образующие спор, капсул; положительно окрашивающиеся по методу Грама.
Представители рода Lactobacillus характеризуются морфологическим разнообразием – имеют форму от коротких до нитевидных палочек, которые располагаются единично или собраны в цепочки.
Бактерии рода Lactococcus (Streptococcus) имеют клетки сферической формы и расположены единично, парами или цепочками.
Бактерии рода Pediococcus образуют так называемые тетрады.
Клетки бактерий рода Leuconostoc – сферические, могут быть чечевицеобразными, образуют пары или тетрады.
Бактерии рода Bifidobacterium представлены палочками, изогнутыми, булавовидными, разветвленными их формами и располагаются поодиночке, парами или цепочками, V-образно или розеткой.
Многие молочнокислые бактерии изначально присутствуют в молоке, вызывая его спонтанное сквашивание, при котором молочная кислота отщепляет от казеина кальций, превращая белок в параказеин. Параказеин, выпадающий в осадок, вызывает свертывание молока и образование молочного сгустка.
При изготовлении молочных продуктов (масло, сыр, йогурт и др.) широко используют молочнокислые бактерии. Вкусовые качества молочнокислых продуктов зависят от способности микроорганизмов, вхо- 46 дящих в состав закваски, синтезировать ароматические вещества (например, ацетоин, диацетил). Закваски представляют собой смешанные культуры микроорганизмов (ассоциации), используемые для получения молочнокислых продуктов.
Йогурт – молочнокислый продукт, получаемый путем засева пастеризованного молока смешанной культурой молочнокислых бактерий – Lactococcus (Streptococcus) thermophilus и Lactobacillus bulgaricus. Цель опыта – изучить микрофлору различных молочнокислых продуктов (кефира, йогурта, йогурта с бифидобактериями, сметаны и др.).
Ход опыта
Для изучения морфологии молочнокислых бактерий готовят фиксированные окрашенные препараты. Для приготовления мазка микробиологической петлёй отбирают пробу молочного сгустка исследуемых молочнокислых продуктов и распределяют его тонким слоем по поверхности предметного стекла. Мазок высушивают на воздухе, фиксируют его смесью Никифорова (раствор спирта с эфиром), нанося смесь на мазок (несколько раз). Обработка препарата эфиром приводит к
Практическая часть.
Объекты для исследования :
Кефир
Йогурт « Активиа» с бифидобактериями
Йогурт « Фруттис»
Фиксированный окрашенный препарат микроорганизмов кефира
А)-Lactococus lactis
( сферическая форма)
Б)-lactobacillus caucasicus
(палочковидная форма)
В)-Saccharomyces kefiri
(сферичная вытянутая форма) увел. в 1000
Фиксированный окрашенный препарат микроорганизмов йогурта «Активиа»
А)-Lactococcus thermophilus
( шаровидная форма)
Б)-Lactobacillus bulgaricus
(палочковидная форма)
В)-Bifidobacterium sp.
( изогнутые палочки) увел в 1000
Фиксированный окрашенный препарат микроорганизмов йогурта «Фруттис»
А)- Lactococcus lactis
( сферическая форма)
Б)-Lactobacillus bulgaricus
(палочковидная форма)
Увел. в 1000
Вывод : в ходе лабораторной работы были сделаны фиксированные окрашенные препараты трех кисломолочных продуктов: йогурта со стандартной закваской, йогурта с бифидобактериями и кефира
Во всех трех препаратах преобладали бактерии из рода Lactococcus, везде обнаружили так же бактерии Lactobacillus
В кефире нашли Saccharomyces kefiri
Лабораторная работа № 3
Изучение азотфиксирующих организмов.
Азотфиксация – это процесс усвоения микроорганизмами молекулярного азота воздуха с образованием соединений азота, которые они включают в белки своих клеток. Способность к фиксации атмосферного азота наблюдается только у прокариотических организмов. Азотфиксирующие микроорганизмы переводят инертный азот (N2) в органические соединения.
Азотфиксация происходит с участием мультифермента нитрогеназа (комплекс ферментов), который катализирует восстановление N2 до аммиака в присутствии АТФ (источника энергии) и восстановителя. Нитрогеназа катализирует также энергозависимую реакцию образования водорода. Эта способность к образованию Н2 присуща многим видам азотфиксирующих бактерий.
Прокариоты, осуществляющие азотфиксацию, в зависимости от их взаимоотношений с растением можно разделить на 3 группы (Теппер и др., 2004):
1) симбиотические азотфиксаторы – находящиеся в симбиозе с растением;
2) ассоциативные азотфиксаторы – корневые (ризосферные) и листовые (филлосферные) бактерии, образующие ассоциации с небобовыми видами растений;
3) свободноживущие почвенные азотфиксаторы – развиваются независимо от присутствия растения (в почве, вне ризосферы).
Представленные группы микроорганизмов являются диазотрофами – могут использовать для роста и развития и молекулярный, и минеральный азот.
Симбиотические азотфиксирующие бактерии вместе с растениями за вегетацию могут связывать 200-300 кг азна на 1 га почвы, а свободноживущие – 15-30 кг азота на эту же площадь.
Цель работы – изучить морфологию свободноживущих и симбиотических азотфиксаторов.
Задачи :
используя накопительную культуру свободноживущих азотфиксаторов, отметить особенности морфологии аэробных и анаэробных бактерий;
рассмотреть морфологические типы клубеньков разных растений (гороха, бобов, сои, облепихи и др.) и определить форму клубеньковых бактерий.
Свободноживущие азотфиксирующие бактерии.
В фиксации атмосферного азота принимает участие широкий круг аэробных и анаэробных бактерий.
Clostridium pasteurianum – первая свободноживущая бактерия была открыта в 1895 году С.Н. Виноградским. Clostridium pasteurianum является облигатным анаэробом. Энергию для всех процессов жизнедеятельности, включая и ассимиляцию молекулярного азота воздуха, эти бактерии получают в результате маслянокислого брожения.
Молодая культура C. рasteurianum – это клетки бактерии, имеющие форму палочек с перитрихальным жгутикованием. Позже клетки образуют споры, которые могут располагаться в середине клетки, реже – ближе к краю. Эндоспоры – это овальные структуры, окруженные капсулой. Клетки бактерий имеют клостридиальную форму.
C. рasteurianum накапливают гранулёзу – запасное питательное вещество (полисахарид, близкий к крахмалу). Гранулёза начинает постепенно исчезать в период эндоспоробразования.
Аэробные грамотрицательные бактерии рода Azotobacter были открыты в 1901 году М. Бейеринком. В своем развитии азотобактер проходит довольно сложный путь развития. В молодом состоянии – это подвижные палочки. При старении клетки приобретают овальную или шаровидную форму, теряют подвижность и покрываются более или менее толстой капсулой, которая иногда объединяет сразу по нескольку клеток. Энергию, необходимую для жизнедеятельности и азотфиксации, азотобактер получает, окисляя различные органические соединения в процессе дыхания.
Постановка опыта.
Для выявления азотфиксаторов в почве можно использовать элективную среду Виноградского для получения накопительной культуры, которая имеет следующий состав (г/л H2O дистиллированной):
глюкоза – 20,0;
K2HPO4 – 1,0;
MgSО4 · 7H2O – 0,5;
NаCl – 0,5;
CaCO3 – 20,0.
Колбу на 2/3 объёма заполняют жидкой средой и заражают почвой (1 г). Для нейтрализации масляной кислоты добавляют мел. Колбу помещают в термостат при температуре 28-300 С. После 4-5 сут инкубации культуру анализируют.
Ход опыта
Клетки азотобактера образуют капсулы. Для обнаружения капсул применяют способ «негативной» окраски (негативного контрастирования) с использованием жидкой туши.
Часто для выявления капсул используют метод Х. Гинса. Сначала на конец предметного стекла помещают каплю черной туши, вносят в нее культуру азотобактера с помощью микробиологической петли, тщательно перемешивают и ребром покровного стекла делают мазок. Мазок высушивают на воздухе, фиксируют смесью Никифорова (5 мин), затем окрашивают фуксином (в течение 2-3 мин). Препарат тщательно промывают H2O водопроводной, высушивают на воздухе и микроскопируют с иммерсионной системой объектива. На темном фоне препарата можно увидеть контрастно выделяющиеся малиново-розовые клетки бактерий рода Azotobacter, которые окружены бесцветными капсулами.
Анаэробный азотфиксатор C. рasteurianum находится в осадке почвы и мела. Для его обнаружения содержимое колбы перемешивают и дают время, чтобы осели крупные частицы. Затем пипеткой из середины субстрата отбирают немного суспензии и наносят каплю на предметное стекло. Затем к ней добавляют каплю раствора Люголя, накрывают покровным стеклом и микроскопируют с иммерсионной системой объектива. Клетки C. рasteurianum содержат гранулёзу, которая приобретает синий цвет от раствора Люголя. В микропрепарате можно обнаружить веретеновидные формы клеток с овальными спорами.
Результаты опыта.
На основании микроскопических исследований сделать вывод о возрастном состоянии бактерий рода Azotobacter, C. рasteurianum и оформить в виде рисунков.
Симбиотические азотфиксирующие бактерии.
Симбиотическая азотфиксация – это способность бактерий связывать молекулярный азот воздуха, находясь в симбиозе с высшими растениями. Известно, что более 1300 видов растений семейства бобовых и более 200 видов небобовых кустарниковых и древесных пород (облепиха, ольха, лох и др.) на корнях образуют клубеньки. Некоторые растения клубеньки образуют на стеблях и корнях (Тихонович, Проворов, 1988).
Клубеньковые бактерии были выделены в чистую культуру в 1888 году М. Бейеринком.
Клубеньковые бактерии относятся к родам Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium и др.
Клубеньковые бактерии – это бесспоровые, грамотрицательные подвижные палочки. Бактерии через корневые волоски проникают в корни растений и вызывают разрастание паренхимной ткани, в результате чего образуется клубенек
В зрелой клубеньковой ткани форма бактериальных клеток видоизменяется, и они превращаются в бактероиды – утолщенные, разветвленные, Т- и V-образные клетки. В клубеньках наиболее энергичный процесс усвоения азота отмечается, когда бактериальные клетки принимают форму бактероидов. После отмирания растений клубеньки разрушаются, клубеньковые бактерии попадают в почву и там сохраняются.
Размеры и форма клубеньков у разных видов растений семейства бобовых неодинаковы
Эффективные штаммы клубеньковых бактерий, способные в симбиозе с растениями ассимилировать молекулярный азот, образуют клубеньки розового цвета (активные), неэффективные – бесцветные (неактивные). В активных клубеньках имеется леггемоглобин, который выполняет функции: регулятора парциального давления О2 и транспорта электронов в азотфиксирующую систему.
Клубеньковые бактерии характеризуются строгой специфичностью в отношении определенных видов растений.
Ход опыта
Для приготовления микропрепаратов клубеньковых бактерий (род Rhizobium) клубенек разрезают пополам и отжимают каплю жидкости на предметное стекло (можно раздавить клубенек между двумя предметными стеклами). Если клубеньки мелкие, то на предметное стекло помещают 3-4 клубенька, добавляют каплю H2O водопроводной и другим предметным стеклом раздавливают и делают мазок по стеклу. Затем препарат просушивают, проводят термическую фиксацию, окрашивают метиленовым синим (в течение 3-5 мин), промывают, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой объектива.
Результаты опыта.
Практическая часть
1-Капсула
2-бактерия
Рис 1 Фиксированный окрашенный препарат бактерий рода azotbacter способом негативного окрашивания.
1 молодые клетки
2 стадия образования
эндоспор
Рис 2 Clostridium pasteurianum
Рис. 3 Бактерии из клубеньков сои- bradythizobium
Есть клетки , превратившиеся в клетки V образной формы
Вывод: изучены азотфиксирующие бактерии p. Azotobacter , Clostridiym pasterianum , клубеньковые бактерии. УВ перпарате с клубеньковыми бактериями p. Azotobacter преобладает палочковидные формы , это говорит о молодом возрасте бактерий .
В препарате с Clostridiym pasterianum есть как молодые палочковидные клетки , так и клетки которые начинают образовывать споры ( спора выглядит прозрачно на препарате)
В препарате с клубеньковыми бактериями увидели мелкие неспоровые палочки, а так же видоизмененные формы -бактероиды что говорит об активности клубенька.
Лабораторная работа № 4
Определение численности микроорганизмов в воздухе
Воздух не является средой обитания микроорганизмов. В этой среде микроорганизмы могут сохранять жизнеспособность лишь временно, т.к. в воздухе отсутствуют питательные вещества, отмечаются резкие колебания влажности и температуры, солнечные ультрафиолетовые и радиоактивные лучи действует на них губительно. Микрофлора воздуха, в основном, формируется за счёт микроорганизмов почвы, для большинства которых характерна высокая устойчивость к неблагоприятным факторам внешней среды. Микроорганизмы поступают в воздух также с поверхности воды, растений, животных и различных предметов. Качественный и количественный состав микроорганизмов атмосферного воздуха может существенно изменяться в зависимости от климатических условий, времени года, ветра, солнечной радиации, метеоосадков и других факторов. В атмосферном воздухе могут быть обнаружены сапрофитные микроорганизмы, представленные кокками (микрококки, сарцины и др.), споровые бактерии (Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus и др.), актиномицеты и мицелиальные грибы (родов Mucor, Penicillium, Aspergillus и др.).
Воздух закрытых помещений существенно отличается от атмосферного воздуха по видовому составу микроорганизмов и их количеству. В закрытых помещениях, особенно, при большом скоплении людей, воздух содержит, чаще всего, больше микроорганизмов, чем в атмосфере. В составе воздуха закрытых помещений, кроме сапрофитной микрофлоры, могут находиться микроорганизмы, выделяемые с десен, слизистых оболочек верхних дыхательных путей человека (при кашле, чихании, разговоре), с кожных покровов, с пылью загрязненного постельного белья, бытовых принадлежностей и др. источников. В воздухе обычно обнаруживаются микрококки, сарцины, споры бактерий и грибов, дрожжи, могут находиться и патогенные микроорганизмы (гемолитические стрептококки, микобактерии туберкулеза, бактерии дифтерии и др.).
Микробиологический анализ воздуха на патогенную флору проводят только по эпидемическим показателям.
Пробы воздуха для бактериологического исследования в плановом порядке отбираются в отделениях реанимации, операционных блоках, послеоперационных палатах интенсивной терапии и других помещениях, где требуются асептические условия. По эпидемическим показаниям бактериологическому исследованию подвергают воздух детских садов, школ, кинотеатров, производственных помещений и т.д.
Для санитарно-гигиенической оценки состояния воздуха закрытых помещений определяют:
1) общее микробное число (ОМЧ) – общее количество микроорганизмов в 1 м3 воздуха;
2) количество санитарно-показательных микроорганизмов в 1 м3 воздуха – гемолитических стафилококков, α- и β-гемолитических стрептококков. По концентрации этих микроорганизмов оценивают степень загрязнения воздушной среды.
Показателем эпидемического неблагополучия какого-либо объекта является обнаружение в воздухе закрытых помещений β-гемолитического стрептококка группы А и стафилококка, обладающего признаками патогенности.
Определение патогенных или условно-патогенных микроорганизмов проводят на специализированных дифференциально-диагностических средах.
При исследовании воздуха большое значение имеет способ выделения микроорганизмов. К настоящему времени разработано много методов и устройств для отбора проб воздуха, позволяющих определять численность микроорганизмов.
В основе методов изучения микрофлоры воздуха положены два принципа: засасывание (аспирация) и оседание (седиментация).
При прохождении воздуха, микроорганизмы остаются в физиологическом растворе или других наполнителях. Затем их численность определяют путём приготовления соответствующих разведений и высева на плотные питательные среды. Зная объём воздуха, прошедшего через наполнители и предельное разведение, делают пересчёт численности микроорганизмов на 1 м3 воздуха. На мембранах после их окраски можно подсчитывать микроорганизмы под микроскопом.
Аспирационным методом определяют численность микроорганизмов, используя специальные приборы для отбора проб воздуха. Например, в устройстве автоматического отбора проб воздуха ПУ-1Б струя воздуха, проходя через решетку, с большой скоростью ударяется о поверхность питательной среды в чашке Петри.
Метод оседания (по Коху) – самый простой метод определения численности микроорганизмов в воздухе. Он основан на седиментации под действием силы тяжести пылинок, аэрозолей, содержащих микроорганизмы, на поверхность плотной питательной среды открытой чашки Петри. Данный метод не пригоден для изучения атмосферного воздуха, где могут иметь место значительные колебания скорости его движения.
Цель работы – провести санитарно-бактериологическую оценку воздуха по результатам определения численности микроорганизмов в 1 м3 воздуха с использованием седиментационного метода.
Постановка опыта
Для определения количества микроорганизмов в воздухе по методу Р. Коха в помещение, где анализируется воздух, вносят 3 чашки Петри со стерильной питательной средой (МПА), ставят их в разных местах и открывают на 5 мин. При открывании крышки чашки Петри, во время анализа воздуха необходимо следить за тем, чтобы не было движения воздуха. Чашки закрывают, переворачивают крышкой вниз и инкубируют в термостате при температуре 36-37 °С в течение 48 ч.
Результаты опыта
Через 2 суток проводят подсчет общего количества выросших колоний бактерий и грибов .
Установлено, что за 5 мин (при отсутствии движения воздуха) на площадь 100 см2 оседает столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 л воздуха. Количество микроорганизмов в 1 м3 воздуха можно определить, зная площадь чашки Петри.
Для этого:1) определяют площадь питательной среды чашки Петри по формуле: πr2 ;
вычисляют количество колоний микроорганизмов на площади 100 см2 ;
3) пересчитывают количество микроорганизмов на 1 м3 воздуха.
Примерный расчет. В чашке Петри диаметром 10 см выросло 35 колоний.
1) Определяют площадь питательной среды в чашке Петри по формуле 3,14 × 25 = 78,5 см2 .
2) Вычисляют количество колоний на площади 100 см2 .
35 – 78,5
Х – 100
В нашем примере на площади 100 см2 выросло бы 44.6 колонии.
Определяют количество микроорганизмов в 1 м3 (1000 л) воздуха.
Так как известно, что на площадь 100 см2 осаждается за 5 минут столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 л, то для определения численности микроорганизмов в 1
.
1 чашка =0 2 чашка=3 среднее =1,5
S чашки =78,5 x=(1,5 100) :78,5= 1,91 колоний на 100см2
1,91 100=191 кол-во на 1м3
№
|
Помещение
|
Кол-во в 1 м3 воздуха
|
Допустимость показателя
|
Примечание
|
1
|
Туалет 3 этажа
|
2739
|
+
(до 4500)
|
|
2
|
Холл
2 этаж
|
191
|
+
|
Малое кол-во микроорганизмов
|
3
|
302 кб
|
960
|
+
|
|
4
|
Оранжерея
|
4301
|
+
|
Высокая влажность воздуха(много грибов)
|
5
|
Холл 1 эт
|
2356
|
+
|
|
6
|
Спортзал
|
2611
|
+
|
|
7
|
Спортзал (ремонт)
|
14210
|
-
|
Превышает в 3,2 раза ( строительная пыль)
|
8
|
Гербарий
|
11020
|
-
|
Превышает допустимые значение в 2,5 раза
|
9
|
Гардероб
|
6240
|
-
|
Превышает в 1,3 раза
|
Обсеменённость воздуха закрытых помещений зависит от их объёма, частоты проветривания, качества уборки, степени освещённости, нахождения в них людей и др. Воздух закрытых помещений отражает, в основном, микрофлору организмов людей и животных, находящихся в этих помещениях. Микроорганизмы попадают в воздух с поверхности тела (с чешуйками кожи) и через верхние дыхательные пути при разговоре, кашле, чихании.
Меры которые нужны для снижения микроорганизмов в воздухе: влажная уборка, применение дезинфекторов , своевременное очищение урн, проветривания.
Возбудители инфекционных болезней, которые могут передаваться воздушно-капельным путем:
COVID-19- коронавирусная инфекция
Varicella Zoster Virus - Вирус ве́тряной оспы,
Shigella dysenteriae -дизентерия
Streptococcus pneumoniae Пневмококковая инфекция
parotitis epidemica, Эпидемический паротит
Streptococcus pyogenes - ангина
Вывод: нами было проведено определение кол-ва МО в воздухе по методу Р. Коха в нескольких помещениях института биологии. Превышение показателей нормы было выявлено в 3 помещениях ( гардероб, спортзал при ремонте, гербарий ). Это вызвано скопление людей , оседанием пыли от ремонта или растений принесенных в гербарий в данных зонах. Также повышенное количество грибов было замечено в оранжереи института биологии , что вызвано высокой влажностью воздуха. Холл 2 этажа и 302 кабинет – зоны, с наименьшим кол-вои микроорганизмов на 1 м3. Это связано с регулярными тщательными уборками данных помещений
Лабораторная работа №5
Культуральные свойства микроорганизмов
Культуральными (макроморфологическими) свойствами называют характерные особенности роста микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах.
Рост микроорганизмов на плотных питательных средах
На поверхности агаризованных питательных сред микроорганизмы, в зависимости от способа посева, могут расти в виде колонии, сплошного газона или штриха. Колонией называют изолированное скопление клеток одного вида, выросшее из одной клетки. От локализации роста микроорганизмов (поверхность, толща или дно сосуда плотной питательной среды), выделяют донные, глубинные и поверхностные колонии.
Цель работы – изучить культурально-морфологические признаки колоний бактерий из воздуха.
Задачи:
1) описать культуральные свойства колоний бактерий, растущих на плотной питательной среде (МПА, РПА) и зарисовать форму, профиль, структуру и край колоний;
2) определить морфологию бактерий исследованных колоний методом приготовления фиксированных окрашенных препаратов при использовании в качестве красителя метиленового синего.
Поверхностные колонии достаточно разнообразны и могут характеризоваться наиболее существенными особенностями роста микроорганизмов на плотном питательном субстрате.
При описании поверхностных колоний учитывают признаки, указанные ниже.
Форма колонии может быть круглой, концентрической, амебовидной, ризоидной, неправильной, сложной и т.д. (рис. 6).
Рис. 6. Форма колоний:
1 – круглая; 2 – круглая с фестончатым краем; 3 – круглая с валиком по краю; 4, 5 – ризоидные; 6 – с ризоидным краем; 7 – амёбовидная; 8 – нитевидная; 9 – складчатая; 10 – неправильная; 11 – концентрическая; 12 – сложная
Размер (диаметр) колонии измеряют в миллиметрах; точечными называют колоний, если их диаметр не превышает 1 мм.
Поверхность колонии бывает гладкой, шероховатой, складчатой, с концентрическими кругами или радиально исчерченной, бороздчатой, морщинистой и т.д.
Профиль колонии может быть изогнутым, выпуклым, плоским, кратерообразным, каплевидным, конусовидным, врастающим в субстрат и т.д. (рис. 7).
Структура колонии возможна: струйчатая, мелко- или крупнозернистая, однородная, волокнистая и т.д. (рис. 8).
Край колонии – волнистый, ровный, зубчатый, бахромчатый и т.д. (рис. 9).
Рис. 7. Профиль колонии:
1 – изогнутый, 2 – кратерообразный, 3 – бугристый, 4 – врастающий в субстрат, 5 – плоский, 6 – выпуклый, 7 – каплевидный, 8 – конусовидный
Рис. 8. Структура колонии:
1 – однородная, 2 – мелкозернистая, 3 – крупнозернистая, 4 – струйчатая, 5 – волокнистая
Рис. 9. Край колонии:
1 – гладкий, 2 – волнистый, 3 – зубчатый, 4 – лопастной, 5 – неправильный, 6 – реснитчатый, 7 – нитчатый, 8 – ворсинчатый, 9 – ветвистый.
Структуру и край колонии можно определить с помощью бинокулярной лупы, помещая чашку Петри крышкой вниз на столик лупы.
Цвет колонии: пигментированная (черная, белая, желтая, оранжевая, золотистая, красная, и т.д.) или бесцветная (грязно-белые относят к бесцветным). Также фиксируется выделение пигмента в субстрат.
Блеск и прозрачность колонии: прозрачная, блестящая, матовая, мучнистая, тусклая.
Консистенцию колонии определяют, прикасаясь микробиологической петлей к ее поверхности. Колония может быть мягкой, плотной или врастающей в субстрат, тягучей, слизистой (прилипает к петле), пленчатой (снимается целиком), хрупкой (легко ломается при прикосновении петлей), легко снимающейся с агаризованной питательной среды.
Глубинные колонии – однообразны, часто по виду похожи на сплющенные чечевички. Рост глубинных колоний нередко сопровождается разрывом плотной среды при выделении микроорганизмами СО2 или других газов.
Донные колонии различных микроорганизмов, как правило, имеют вид тонких прозрачных пленок, выстилающих дно сосуда.
В зависимости от состава питательной среды, возраста – размеры и другие особенности колонии могут изменяться. Соответственно, при описании колонии, кроме состава среды, необходимо указать, температуру культивирования и возраст культуры.
Рост микроорганизмов в жидких питательных средах. Рост культур микроорганизмов в жидких питательных средах гораздо более однообразен, чем на плотных субстратах и может сопровождаться образованием пленки, осадка, помутнением среды. Для характеристики роста микроорганизмов в жидкой среде, отмечают степень помутнения среды (сильная, умеренная слабая), особенности пленки (гладкая или складчатая; рыхлая тонкая, или плотная), а при образовании осадка указывают его тип (рыхлый, слизистый, плотный или хлопьевидный; скудный или обильный).
У многих микроорганизмов рост сопровождается выделением газа, появлением запаха, пигментацией среды.
Колония 1
Форма : с ризаидным краем
Цвет: молочный
Поверхность: гладкая
Край волнистый
Блеск и проз матовая, прозрачная
Колония 2 форма концентрическая
Цвет желтый
Профиль- плоский
Поверхность концентр. круги
Край крупноволнистый
Блеск по краям , прозрачная
Колония 3 форма круглая с волнистым краем
Цвет оранжевый с белыми крапинками
Поверхность шероховатая
Край крупноволнистый
Блеск и прозр: матовая непрозрачн
Колония 4 форма неправильная
Цвет оранжевый
Поверхность шероховатая
Край зубчатый , Профиль- бугристый
Блеск и прозр : матовая и прозрачн
Колония 5 форма круглая
Цвет желтый
Поверхность гладкая
Край зубчатый
Блеск и прозр матовая непрозрачн
Профиль выпуклый
Колония 6 форма круглая с фасеточным краем
Цвет белый
Поверхность с небольшими бороздами
Край гладкий
Блеск и прозрачн матовая непрозрачн
Профиль плоский
Колония 7 форма складчатая
Цвет бежевый
Поверхность борозды складок
Край гладкий
Блеск и прозрн блестит непрозрачн
Профиль борозды
Колония 8 форма ризоидная
Цвет бежевая в центре
Поверхность шероховатая
Край волнистый
Блеск и прозрачн матовая, скраю прозрачн
Профиль нитчатый
Колония 9 форма складчатая
Цвет желтоватый
Поверхность складчатая
Край гладкий
Блеск непрозрч блестит непрозрачн
Профиль складчатый
Колония 10 форма круглая
Цвет оранжевый
Поверхность гладкая
Край гладкий
Блеск и прозрчн блестит и непрозрчн
Профиль плоский
Колония 11 форма круглая
Цвет бежевый
Поверхность гладкая
Край гладкий блестит непрозрчн
Профиль гладкий
Колония 12 форма круглая
Цвет оранжевый
Поверхность гладкая
Край гладкий
Блеск и прозр блестит, непрозрачн
Профиль гладкий
Лабораторная работа №6
Влияние антибиотиков на рост микроорганизмов.
Определение чувствительности бактерий и антибиотикам .
Явление антагонизма микроорганизмов нашло широкое применение в практике производства антибиотиков.
Антибиотики – природные соединения, образуемые преимущественно микроорганизмами. Высокая избирательная биологическая активность в отношении патогенных микроорганизмов позволила использовать их для уничтожения возбудителей болезней или заметного подавления их жизнедеятельности. Для каждого антибиотика характерен свой спектр антимикробного действия. Наряду с антибиотиками узкого спектра (пенициллин, цефалоспорин) применяются антибиотики широкого спектра действия (тетрациклин, левомицетин и др.).
В процессе антибиотикотерапии или в экспериментальных условиях при действии на микробов недостаточных доз препарата (суббактериостатические концентрации), микроорганизмы могут приобретать устойчивость к ним. Определение чувствительности патогенных микроорганизмов к антибиотическим веществам имеет большое значение при выборе антибиотика в качестве лечебного препарата. Для выявления чувствительности данного возбудителя к антибиотикам применяется ряд методов, среди которых наиболее быстрым и простым является метод бумажных дисков. Пропитанные антибиотиками бумажные диски изготовляются промышленностью.
Цель опыта – определить чувствительность бактериальных культур к антибиотикам методом бумажных дисков.
Постановка опыта
Для испытания чувствительности микроорганизма, в стерильныечашки Петри разливают МПА и оставляют для застывания среды. Затем, соблюдая правила стерильности, при помощи микробиологической петли вносят исследуемый материал (предварительно выращенные на плотной питательной среде бактерии) на поверхность МПА и проводят зигзагообразную черту. Стерильным шпателем Дригальского касаются внутренней стороны крышки, смачивая его, а затем осторожно распределяют внесенный петлей посевной материал по поверхности агаризованной среды.
Стерильным пинцетом на поверхность питательной среды раскладывают диски, пропитанные антибиотиками (5-6 дисков на расстоянии 25 мм). Чашки переворачивают крышкой вниз и помещают в термостат, выращивая при температуре 25-30 °С.
Результаты опыта
Если исследуемые микроорганизмы чувствительны к взятым для эксперимента антибиотикам, то вокруг дисков образуются зоны ингибирования роста. Отсутствие зоны задержки роста указывает на то, что испытуемая культура устойчива к данному антибиотику. Через 24 ч учитывают результаты опыта, проводя измерения зон задержки роста микроорганизмов вокруг дисков, включая диаметр самого диска
Размер зон ингибирования роста зависит от степени чувствительности микроорганизма к конкретному антибиотику. Оценку результатов определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам проводят, используя данные, приведенные в таблице 2 (цит. по: Л.Ф. Косолаповой, 2000).
Более точные результаты по чувствительности бактерий к антибиотикам можно получить, используя метод серийных разведений в жидкой среде.
Аналогично можно поставить опыты по влиянию химических веществ или влиянию антибиотиков растительного происхождения, т.е. фитонцидов. Для этого стерильные диски пропитывают химическими веществами или фитонцидами и проводят опыт как описано выше.
Результаты по действию антибиотиков на рост бактерий обобщают в таблице, которую дополняют следующими характеристиками каждого из испытанных антибиотиков (по данным литературы): продуцент, спектр действия, класс химического соединения, механизм действия, способ получения. |
Скачать 59.02 Kb.