Ферменты рестрикции параметры и условия работы

• Название: Ферменты рестрикции параметры и условия работы
• Дата: 27.03.2018
• Размер: 154 Kb.
• Имя файла: 4.doc
• Тип: Документы; #39616

Пример оформления протокола

ФИО	Соболевский Глеб Андреевич
Занятие №	4		Дата:	2013.11.16
Тема занятия	Ферменты рестрикции: параметры и условия работы
Вариант	2
№ PC	6

Задание 1

Исходные данные:

Концентрация ДНК pUC19 500 ng/µl, для рестрикции используем 1000 ng;

Рекомендуемый объем реакционной смеси 20 µl;

Размер фрагмента для клонирования - 1200 п.н., концентрации 80 ng/µl.
1) TatI + PaeI

Вырезаем фрагмент для клонирования рестриктазами TatI + PaeI. После порезки TaaI и PaeI образуются липкие концы.
Протокол удаление липких концов у клонируемого фрагмента с помощью фермента T4 ДНК полимеразы.

Наименование реагента	Исходная концентрация	Желаемое количество/концентрация в конечном растворе	Объем реактива (добавляемый в пробирку)
5Х reaction buffer	5 X	1X	5.0 µl
T4 DNA polymerase	5 u/µl	1,25 u	0.25 µl
H2O		до 25 µl	3.3 µl

Условия реакции: 11 °C 20 минут Для инактивации фермента выдерживаем смесь 10 минут при 75 °С. Так как в векторе отсутствуют сайты рестрикции для имеющихся у нас рестриктаз используем SmaI. Протокол рестрикции вектора pUC19 SmaI. Наименование реагента Исходная концентрация Желаемое количество/концентрация в конечном растворе Объем реактива (добавляемый в пробирку) ДНК pUC19 500 ng/µl 1000 ng 2.0 µl Буфер Yellow ТangoTM 10 X 1X 2.0 µl Рестриктаза SmaI 10 u/µl 1 u 0.1 µl H2O до 20 µl 15.9 µl Условия реакции: 30°C 1 час Для инактивации фермента выдерживаем смесь 20 минут при 65 °С. Затем проводим лигирование по тупым концам 2)BseXI+EcoRI Проводоим рестрикцию ферментом BseXI. После рестрикции получается липкий 3’ конец. Удаляем липкий конец с помощью фрагмента Кленова. Протокол удаление липких концов с помощью фрагмента Клёнова. Наименование реагента Исходная концентрация Желаемое количество/концентрация в конечном растворе Объем реактива (добавляемый в пробирку) Klenow fragment 10 u/µl 5 u 0.5 µl dNTP Mix 2mM 0.05 mM 0,6 µl H2O до 20 µl 1.3 µl Условия реакции: 37°C 10 минут Для инактивации фермента выдерживаем смесь 10 минут при 75 °С. Проводим рестрикцию EcoRI. Образуется липкий 3’ конец(есть сайт рестрикции в Puc19. Т.к. уникального сайта рестрикции для BseXI в puc19 нет - используем SmaI Протокол рестрикции вектора pUC19 ферментом EcoRI и SmaI. Наименование реагента Исходная концентрация Желаемое количество/концентрация в конечном растворе Объем реактива (добавляемый в пробирку) ДНК pUC19 500 ng/µl 1000 ng 2.0 µl Буфер 10x Red Buffer 10 X 1X 2.0 µl Рестриктаза SmaI 10 u/µl 1 u 0.1 µl Рестриктаза EcorI 10 u/µl 1 0.1 µl H2O до 20 µl 13.8 µl Условия реакции: 30°C 1 час, после нагреть до 37°C 1 час. Для инактивации фермента выдерживаем смесь 20 минут при 65 °С. Проводим лигирование. 3) PasI + SmaI Проводим рестрикцию PasI. Образуется липкий 5’ конец. Тупим с помощью фрагмента Кленова. Протокол удаление липких концов с помощью фрагмента Клёнова. Наименование реагента Исходная концентрация Желаемое количество/концентрация в конечном растворе Объем реактива (добавляемый в пробирку) Klenow fragment 10 u/µl 5 u 0.5 µl dNTP Mix 2mM 0.05 mM 0,6 µl H2O до 20 µl 1.3 µl Условия реакции: 37°C 10 минут Для инактивации фермента выдерживаем смесь 10 минут при 75 °С. Проводим рестрикцию SmaI. Получаем тупой конец. Сайт рестрикции имеется в Puc 19. Производим рестрикцию Puc19 с помощью SmaI Наименование реагента Исходная концентрация Желаемое количество/концентрация в конечном растворе Объем реактива (добавляемый в пробирку) ДНК pUC19 500 ng/µl 1000 ng 2.0 µl Буфер 10x Red Buffer 10 X 1X 2.0 µl Рестриктаза SmaI 10 u/µl 1 u 0.1 µl H2O до 20 µl 15.9 µl Условия реакции: 30°C 1 час Для инактивации фермента выдерживаем смесь 20 минут при 65 ° Проводим лигирование. 4) SmoI + SmaI Вырезаем фрагмент для клонирования рестриктазой SmoI. Получаем липеци 5’ конец. Тупим с помощью фрагмента Кленова. Протокол удаление липких концов у клонируемого фрагмента с помощью фрагмента Клёнова. Наименование реагента Исходная концентрация Желаемое количество/концентрация в конечном растворе Объем реактива (добавляемый в пробирку) Klenow fragment 10 u/µl 5 u 0.5 µl dNTP Mix 2mM 0.05 mM 0,6 µl H2O до 20 µl 1.3 µl Условия реакции: 37°C 10 минут Для инактивации фермента выдерживаем смесь 10 минут при 75 °С. Так как в векторе отсутствует сайт рестрикции для SmoI используем только SmaI. Производим рестрикцию на векторе с помощью SmaI Наименование реагента Исходная концентрация Желаемое количество/концентрация в конечном растворе Объем реактива (добавляемый в пробирку) ДНК pUC19 500 ng/µl 1000 ng 2.0 µl Буфер 10x Red Buffer 10 X 1X 2.0 µl Рестриктаза SmaI 10 u/µl 1 u 0.1 µl H2O до 20 µl 15.9 µl Условия реакции: 30°C 1 час Для инактивации фермента выдерживаем смесь 20 минут при 65 ° Проводим лигирование . Задание 2 1)Csp6I + HindIII Вырезаем фрагмент для клонирования рестриктазой Csp6I. Образуется 5’ липкий конец. Проводим удаление липких концов. Протокол удаление липких концов c помощью фрагмента Кленова. Наименование реагента Исходная концентрация Желаемое количество/концентрация в конечном растворе Объем реактива (добавляемый в пробирку) Klenow fragment 10 u/µl 5 u 0.5 µl dNTP Mix 2mM 0.05 mM 0,6 µl H2O до 20 µl 1.3 µl Условия реакции: 37°C 10 минут Для инактивации фермента выдерживаем смесь 10 минут при 75 °С. HindIII - для этого фермента имеется сайт в puc19. Т.к. для фермента Csp6I нет уникального сайта, проводим рестрикцию с помощью ферментов SmaI и HindIII. Проводим рестрикцию Puc19 c помощью ферметов SmaI и HindIII. Наименование реагента Исходная концентрация Желаемое количество/концентрация в конечном растворе Объем реактива (добавляемый в пробирку) ДНК pUC19 500 ng/µl 1000 ng 2.0 µl Буфер 10x Red Buffer 10 X 1X 2.0 µl Рестриктаза SmaI 10 u/µl 1 u 0.1 µl Рестриктаза HindIII 10 u/µl 1 0.1 µl H2O до 20 µl 13.8 µl Условия реакции: 30°C 1 час, после нагреть до 37°C 1 час. Для инактивации фермента выдерживаем смесь 20 минут при 65 °С. Проводим лигирование. 2) EcoRII + EcoRI Вырезаем фрагмент для клонирования рестриктазой EcoRII. После порезки EcoRII – 5’ липкий конец Протокол удаление липких концов у клонируемого фрагмента с помощью фермента T4 ДНК полимеразы. Наименование реагента Исходная концентрация Желаемое количество/концентрация в конечном растворе Объем реактива (добавляемый в пробирку) 10Х reaction buffer O 10 X 1X 5.0 µl T4 DNA polymerase 5 u/µl 1,25 u 0.25 µl H2O до 25 µl 3.3 µl Условия реакции: 37 °C 60 минут Для инактивации фермента выдерживаем смесь 20 минут при 85 °С. Т.к. для EcoRII нет уникального сайт рестрикции, проводим рестрикцию с помощью SmaI + EcoRI Наименование реагента Исходная концентрация Желаемое количество/концентрация в конечном растворе Объем реактива (добавляемый в пробирку) ДНК pUC19 500 ng/µl 1000 ng 2.0 µl Буфер 10x Red Buffer 10 X 1X 2.0 µl Рестриктаза SmaI 10 u/µl 1 u 0.1 µl Рестриктаза EcorI 10 u/µl 1 0.1 µl H2O до 20 µl 13.8 µl Условия реакции: 30°C 1 час, после нагреть до 37°C 1 час. Для инактивации фермента выдерживаем смесь 20 минут при 65 °С. Производим лигирование. 3) MspI + PstI Вырезаем фрагмент для клонирования рестриктазой MspI Протокол удаление липких концов у клонируемого фрагмента с помощью фермента T4 ДНК полимеразы. Наименование реагента Исходная концентрация Желаемое количество/концентрация в конечном растворе Объем реактива (добавляемый в пробирку) 10Х reaction buffer R 10X 1X 5.0 µl T4 DNA polymerase 5 u/µl 1,25 u 0.25 µl H2O до 25 µl 3.3 µl Условия реакции: 37 °C 60 минут Для инактивации фермента выдерживаем смесь 10 минут при 75 °С. Осуществляем вырезку с помощью фермента PstI – имеется сайт на векторе. Проводим рестрикцию вектора помощью SmaI и PstI Наименование реагента Исходная концентрация Желаемое количество/концентрация в конечном растворе Объем реактива (добавляемый в пробирку) ДНК pUC19 500 ng/µl 1000 ng 2.0 µl Буфер 10x Red Buffer 10 X 1X 2.0 µl Рестриктаза SmaI 10 u/µl 1 u 0.1 µl Рестриктаза PstI 10 u/µl 1 0.1 µl H2O до 20 µl 13.8 µl Условия реакции: 30°C 1 час, после нагреть до 37°C 1 час. Для инактивации фермента переосождаем смесь Проводим лигирование. 4) KpnI +BglII Вырезаем фрагмент для клонирования рестриктазой BglII После BgIII – 3’ липкие концы. Протокол удаление 3' липкого конца у клонируемого фрагмента с помощью фрагмента Кленова Наименование реагента Исходная концентрация Желаемое количество/концентрация в конечном растворе Объем реактива (добавляемый в пробирку) Наименование реагента Исходная концентрация Желаемое количество/концентрация в конечном растворе Объем реактива (добавляемый в пробирку) Klenow fragment 10 u/µl 5 u 0.5 µl 5Х reaction buffer 5 X 1X 5.0 µl dNTP Mix 2mM 0.05 mM 0,6 µl T4 DNA polymerase 5 u/µl 1,25 u 0.25 µl H2O до 20 µl 1.3 µl H2O до 25 µl 3.3 µl Условия реакции: 37°C 10 минут Для инактивации фермента выдерживаем смесь 10 минут при 75 °С. Проводим рестрикцию фрагмента с помощью KpnI . Имеется уникальный сайт на векторе, соотвевтсвтенно проводим рестрикцию с помощью SmaI и KpnI на векторе. Условия реакции: 11 °C 20 минут Для инактивации фермента выдерживаем смесь 10 минут при 75 °С. Вектор обрабатываем KpnI(дает липкий конец) и SmaI(дает тупой конец).Т.о.проводим лигирование с одной стороны по липкому,с другой по тупому концу. Протокол рестрикции вектора pUC19 ферментом KpnI и SmaI. Наименование реагента Исходная концентрация Желаемое количество/концентрация в конечном растворе Объем реактива (добавляемый в пробирку) ДНК pUC19 500 ng/µl 1000 ng 2.0 µl Буфер Yellow ТangoTM 10 X 1X 2.0 µl Рестриктаза SmaI 10 u/µl 1 u 0.1 µl Рестриктаза Kpn1 10 u/µl 1 u 0.1 µl H2O до 20 µl 13.8 µl Условия реакции: 30°C 1 час, после нагреть до 37°C 1 час. Для инактивации фермента 1 выдерживаем 65 градусов 20 минут, выдерживаем смесь 20 минут при 80 °С. Проводим лигирование Лигирование Протокол лигирование вектора со вставкой по липким концам Суммарное количество ДНК в лигазной смеси – 200 ng Отношение вектор/вставка = 1/3 Пусть x – масса вектора в ng, у – масса вставки в ng. x+y=200 (y/1200)/(x/2686)=3 x=200-y y/1200=3*(200-y)/2686 y=114.5 нг x=85.5 ng Наименование реагента Исходная концентрация Желаемое количество/концентрация в конечном растворе Объем реактива (добавляемый в пробирку) ДНК вставки 50 ng/µl 114.5 ng 2.3 µl ДНК вектора 50 ng/µl 85.5 ng 1.7 ng 5x Ligation Buffer 5X 1X 4.0 µl T4 ligase 5 u/µl 0,1 u 0.02 µl (0,1) H2O до 20 µl 13.5 µl Условия реакции: 23-26 °C 1 час. Для инактивации фермента выдерживаем смесь 10 минут при 65°С.