описание методики конфокал. Из замороженных образцов в условиях криотома (Zeiss, Германия) при 28
 Скачать 32.5 Kb.
|
|
Сосудистый графт, изготовленный из ПГБВ/PCL c включением VEGF (500 нг/мл) и без ростового фактора был имплантирован в брюшную аорту крысы. Через […] месяц животных выводили из эксперимента, фрагмент аорты с имплантированным графтом извлекали, подвергали быстрой заморозке и в дальнейшем хранили в условиях низкой температуры (-140оС). Для изучения миграции клеток в стенку графта выполняли срезы аорты, области анастомоза и центральной области графта. Из замороженных образцов в условиях криотома (Zeiss, Германия) при -28оС изготавливали серийные срезы толщиной 8 мкм с отступом приблизительно 100 мкм. Срезы монтировали на стекла, покрытые L-полилизином (Menzel, Германия). Окрашивание срезов выполнялось методами прямой (на фактор Виллебрандта) и непрямой (на CD31 и CD34) иммунофлуоресценции. Для блокировки неспецифического связывания срезы инкубировали в 1% растворе бычьего сывороточного альбумина (BSA) (Sigma-aldrich, США) в фосфатно-солевом буфере (PBS) (pH7,4; Invitrogen, США) в течение 1 часа. Далее на срезы наносили смесь первичных антител (антитела мыши к CD31 крысы, Millipore в разведении 1:10; антитела кролика к CD34 крысы, Abcam, разведение 1:50) или овечьи антитела к фактору фон Виллебранда, конъюгированные с FITC (Abcam, разведение 1:50). Антитела разводили 1% раствором BSA-PBS согласно инструкции производителя. Образцы инкубировали во влажной камере при температуре +4оС в течение ночи. Затем на срезы с первичными антителами наносили смесь вторичных антител (антитела овцы к Ig мыши, конъюгированные с родамином, Millipore, разведение 1:10; антитела козы к Ig кролика, конъюгированные с FITC, Millipore, разведение 1:10) с последующей инкубацией 1 час при комнатной температуре. Отмывку препаратов между промежуточными этапами и после окончания окрашивания проводили 3х-кратно по 5 минут раствором PBS. С целью удаления автофлуоресценции срезы дополнительно обрабатывали реагентом Autofluorescence Eliminator Reagent (Millipore, США) согласно инструкции производителя. Далее образцы докрашивали ядерным красителем DAPI 10мкг/мл в течение 30 мин. при комнатной температуре. Готовые срезы заключали в ProLong под покровное стекло. В качестве положительного контроля на CD31 и vWF использовали образцы нативной аорты крысы, на CD34 - срезы эмбриона крысы. Для отрицательных контролей окрашивание выполняли с заменой первичных антител на раствор BSA в PBS и сохранением дальнейшего протокола окрашивания. Микроскопию проводили на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе LSM 700 (Zeiss). Короткая версия Из замороженных образцов в условиях криотома (Zeiss, Германия) изготавливали серийные срезы толщиной 8 мкм и монтировали на стекла с L-полилизином (Menzel, Германия). Срезы окрашивали методами прямой (фактор Виллебрандта) и непрямой (CD31 и CD34) иммунофлуоресценции согласно инструкции производителя. На образцы наносили первичные антитела (Abcam) (Anti-CD31 antibody (ab119339) и Anti-CD34 antibody (ab185732) или Anti-Von Willebrand Factor antibody (FITC) (ab8822) и инкубировали при температуре +4оС в течение ночи. Для срезов с неконъюгированными первичными антителами дополнительно проводили обработку вторичными антителами конъюгированными с флуоресцентными красителями (Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) FITC (12-507), Sheep anti-Mouse IgG Rhodamine (AP300R) Millipore) с последующей инкубацией 1 час при комнатной температуре. Между промежуточными этапами и после окончания окрашивания выполняли 3х-кратную отмывку препарата фосфатно-солевым буфером (PBS) (pH7,4; Invitrogen, США). Для удаления автофлуоресценции срезы обрабатывали реагентом Autofluorescence Eliminator Reagent (Millipore, США) согласно инструкции производителя. Ядра клеток докрашивали DAPI 10мкг/мл. Готовые срезы заключали в ProLong под покровное стекло. В качестве положительного контроля на CD31 и vWF использовали образцы нативной аорты крысы, на CD34 - срезы эмбриона крысы. Для отрицательных контролей окрашивание выполняли с заменой первичных антител на раствор BSA в PBS и сохранением дальнейшего протокола окрашивания. Микроскопию проводили на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе LSM 700 (Zeiss). |