Кольцепреципитация, иммунодиффузия в геле, иммуноэлектрофорез. Реакция нейтрализации токсина. Реакция радиальной иммунодиффузии
 Скачать 0.55 Mb.
|
|
Занятие 23 Реакция преципитации и ее варианты (кольцепреципитация, иммунодиффузия в геле, иммуноэлектрофорез). Реакция нейтрализации токсина. Реакция радиальной иммунодиффузии dos. V.Nərimanov prof. A.Qurbanov Реакция преципитации При связывании корпускулярных антигенов с антителами происходит агглютинация. При связывании растворимых антигенов (преципитиногенов) со специфическими антителами (преципитинами) наблюдается реакция преципитации Реакция преципитации – РП (от лат. praecipito – осаждать) – это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса • Реакции преципитации которые ставят в жидких средах проявляются в виде мути, в плотных средах в гелях, питательных средах) реакция проявляется в виде полос преципитации В соответствии с этим существуют разные варианты реакции Реакция преципитации • Реакцию проводят в узких преципитационных пробирках с иммунной сывороткой, на которую наслаивают растворимый антиген. При положительном результате на границе этих двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата • Для образования реакции преципитации главным условием является то, что антиген и иммунная сыворотка не должны смешиваться. В противном случае возникает диффузное помутнение В качестве примера кольцепреципитации проводят реакцию термопреципитации по Асколи (при сибирской язве). Реакция кольцепреципитации • При постановке реакции в пробирку с малым диаметром наливают 0,2 мл преципитирующей сыворотки, затем пастеровской пипеткой осторожно наслаивают на сыворотку 0,2 мл растворенного антигена так, чтобы он не смешивался с сывороткой К иммунной сыворотке в контрольной пробирке добавляют соответствующее количество физраствора. Пробирки аккуратно помещают в штатив в вертикальном положении, не смешивая при этом жидкости В зависимости от типов антигенов и антител, результаты реакции учитываются через 5-10 минут, 1-2 часа или 20-24 часа. При положительной реакции на границе сыворотки и исследуемого антигена в пробирке образуется белое кольцо преципитата. Постановка реакции кольцепреципитации Реакция кольцепреципитации Антиген Иммунная сыворотка Видимый преципитат Реакция преципитации в агаре (геле Реакцию проводят в твердой фазе, представляющей собой агар или гель Антиген и антитело диффундируют вплотную среду навстречу друг к другу, и на месте их встречи образуются полосы преципитата Широкое распространение получили разновидности реакции преципитации в геле агара или агарозе: двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и др Двойная иммунодиффузия по Оухтерлони • Реакцию ставят в геле на стеклах или чашках Петри • В слое геля вырезают лунки, в которые раздельно помещают антигены и иммунные сыворотки, которые диффундируют навстречу друг другу Вместе встречи компонентов реакции в эквивалентных соотношениях образуется преципитат в виде белой полосы. 1. Лунки с искомым антигеном. Линии преципитата. Слой агарозного геля. Лунка с иммунной сывороткой Двойная иммунодиффузия по Оухтерлони Двойная иммунодиффузия по Оухтерлони Определение токсигенности возбудителя дифтерии с помощью реакции преципитации в геле Токсигенность штаммов возбудителей дифтерии, выделенных от больных, определяют с помощью метода Элека. • Для этого полоску стерильной фильтровальной бумаги, пропитанную противодифтерийной антитоксической сывороткой, помещают на поверхность питательной среды в чашке Петри. Исследуемые культуры инокулируют на расстоянии 1 см от края бумажной полоски. Таким способом можно инокулировать от 3 до 10 культур водной чашке В качестве контроля используется нетоксигенная культура Чашки инкубируют в термостате при 37 ° Св течение 24- 48-72 часов. Если культура выделяет токсин, вокруг нее на некотором расстоянии от бумажной полоски образуются специфические линии преципитации Реакция радиальной иммунодиффузии • Иммунную сыворотку смешивают с расплавленными охлажденным до 40 ° С агаром • Агар наливают на стеклянную пластинку, и после затвердевания в нем вырезают лунки, в которые добавляют различные разведения антигена. • Во время инкубации антиген диффундирует в агар и связывается с антителами, что приводит к образованию зон преципитации в виде колец • Диаметр колец преципитации соответствует концентрации антигена • Эта реакция используется для определения концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови (метод Манчини). A B Иммуноэлектрофорез • Иммуноэлектрофорез – сочетание метода электрофореза и иммунопреципитации; смесь антигенов вносится в лунки геля и разделяется в геле с помощью электрофореза. • Затем в канавку параллельно зонам электрофореза вносят иммунную сыворотку, антитела которой, диффундируя в гель, образуют вместе встречи с антигеном линии преципитации Встречный иммуноэлектрофорез • Этот метод основан на образовании линий преципитации в результате встречной диффузии антигенов и антител под воздействием электрического поля в агаровом геле В слое агара на определенных расстояниях друг от друга вырезают лунки для антигена и сыворотки Исследуемый антиген помещают со стороны катода, а со стороны анода помещают сыворотку. Пластинку с агаром ставят в камеру для электрофореза Положительная реакция проявляется в образовании линий преципитации между лунками, в которые добавлены антиген и сыворотка Встречный иммуноэлектрофорез Реакция нейтрализации Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие микробов или их токсинов на чувствительные клетки и ткани, что связано с блокадой микробных антигенов антителами, те. их нейтрализацией. Реакцию нейтрализации (PH) проводят путем введения смеси антиген- антитело животным или в чувствительные тест-объекты культуру клеток, эмбрионы. Реакция нейтрализации вирусов Наличие антител, нейтрализующих вирусы выявляют смешиванием культуры возбудителя с сывороткой и последующим введением смеси лабораторному животному или заражением культуры клеток. На эффективность нейтрализации указывает выживание животного либо отсутствие гибели клеток в культурах. •Реакция нейтрализации токсина антитоксином основана на способности антитоксических антител связывать токсин и блокировать его действие. Для идентификации токсина и определения титра антитоксических антител их смесь вводят лабораторным животным. При соответствии типа токсина и антител в сыворотке животное не погибает Реакция нейтрализации токсина антитоксином in vivo Реакция флоккуляции • Реакция флоккуляции от лат. floccus — хлопья шерсти) — появление опалесценции или хлопьевидной массы (иммунопреципитации) в пробирке (in о) при реакции токсин–антитоксин или анатоксин– антитоксин. Реакция позволяет определить активность антитоксической сыворотки, анатоксина и токсина. • В пробирке, где анатоксин и антитоксическая сыворотка находятся в эквивиалентном соотношении, наблюдают помутнение. Таким образом, зная концентрацию антитоксической сыворотки, можно рассчитать концентрацию анатоксина |