Лекция Электрическая активность одиночных ионных каналов
 Скачать 1.24 Mb.
|
1 2 Корепанова Е.А. 2016 © 1 Дисциплина «Биофизика» Лекция № 5. Электрическая активность одиночных ионных каналов . 1. Методы обнаружения одиночных ионных каналов. 1.1.Метод БЛМ. 1.2.Пэтч-клэмп клеточных мембран. 2. Получаемая информация 2.1. Проводимость ионного канала. 2.2. Кинетика работы ионного канала. 2.3.В–а характеристика канала. 3. Типы структур ионных каналов. 4. Заключение. Для чего нужно изучать каналы. 4.1. Каналы и болезни 4.2. Каналы как антибиотики 4.3. Каналы и биотехнологии. 4.4. Каналы как необходимый механизм выживания 1. Методы обнаружения одиночных ионных каналов Корепанова Е.А. 2016 © 2 Ионные каналы позволяют клетке регулировать проницаемость мембран для тех или других ионов, а это лежит в основе возбудимости клеток и ионной регуляции внутриклеточных процессов Основной метод изучения работы ионных каналов – это измерение ионных токов через мембрану при определенном мембранном потенциале и известных концентрациях ионов по обе стороны мембраны. Методика регистрации ионных токов достаточно хорошо разработана и при наличии соответствующих измерительных приборов легко осуществима. Однако при изучении интегральных ионных токов через открытые в мембране калиевые или натриевые каналы, на фоне высокой интегральной проводимости мембраны, создаваемой многими открытыми каналами, дискретные, малые изменения, проводимости одиночного канала неразличимы. В этом случае обнаружить каналы в мембране удается только по косвенным признакам, например при переменном электрическом напряжении на мембране. Подобные эксперименты проводились на модельных фосфолипидных мембранах. Для того чтобы выяснить, каков механизм переноса электрического заряда через мембрану: с помощью подвижных переносчиков или через каналы изучалась зависимость мембранной электропроводности от концентрации электролита в окружающей среде. C g концентрация электролита эл ек тр оп ро во дн ость 1 2 C g концентрация электролита эл ек тр оп ро во дн ость 1 2 Рис.12. Проводимость мембраны, в которой присутствуют ионные каналы (2) или переносчики ионов (1), на постоянном токе. Рис.13. Проводимость мембраны, в которой присутствуют ионные каналы (2) или переносчики ионов (1), на переменном токе. При постоянном электрическом токе проводимость мембраны в зависимости от концентрации электролита, как в случае переносчиков, так и при наличии каналов, имеет вид немонотонный кривой с насыщением (рис.12). Насыщение обусловлено либо насыщением каналов переносимым ионом при высокой концентрации электролита, либо отсутствием свободной формы переносчика (насыщением переносчиков) в мембране (рис.12, кривые 1 и 2). Однако если электрическая проводимость мембраны появляется в результате одновременной работы многих каналов, то при использовании переменного электрического напряжения с ростом концентрации электролита наблюдается её снижение и даже блокирование рис.13. Это указывает на уменьшение или полную Корепанова Е.А. 2016 © 3 непроводимость каждого из многих открытых единичных каналов, Причина в том, что при высокой концентрации электролита выход иона из канала затруднен. В этих условиях при подаче на мембрану переменного напряжения ион просто не успевает покидать канал, что приводит к блокированию трансмембранного ионного тока (рис.13, кривая 2). В то время как заряженные комплексы, например К + –валиномицин, при высокой концентрации электролита и любой частоте переменного электрического напряжения могут двигаться внутрии мембраны в любом направлении, то есть зависимость тока от концентрации по-прежнему имеет вид кривой с насыщением. Прямое обнаружение функционирующих одиночных ионных каналов в мембране по их электрической активности стало возможным при разрешении следующих методических проблем. Во-первых, для непосредственного обнаружения ионных каналов необходим приборы, с помощью которых можно зарегистрировать малые токи, протекающие через одиночные ионные каналы, то есть токи порядка нескольких пикоА 12 (10 A) при частоте не менее 1 кГц. При этом подаваемый на мембрану электрический потенциал, обеспечивающий ионный ток в канале, должен не искажаться в результате перераспределения подаваемого на мембрану напряжения между элементами электроизмерительной схемы, возникающего в результате шунтировании мембраны в момент открытия ионного канала. С этой целью используется прибор, называемый операционным усилителем с обратной связью. Это специальный управляющий потенциалом источник напряжения, который поддерживает на мембране постоянную заданную разность электрических потенциалов. ОУ м R оп V б V п V I R к регистрирующему прибору м C эт R Рис. 14. Принципиальная эквивалентная электрическая схема измерения ионных токов в режиме фиксации электрического потенциала на мембране на заданном уровне: Эт R – эталонное сопротивление; м R и М C – соответственно электрическое сопротивление и электрическая емкость мембраны; ОУ – дифференциальный усилитель с высоким коэффициентом усиления, на вход которого подается разность потенциалов, между измерительным электродом и электродом сравнения . ОП V – командный потенциал. Метод фиксации потенциала на клеточной мембране первоначально использовался в работе с мембранами электровозбудимых клеток (гигантский аксон кальмара, гигантский нейрон улитки, мембраны харовых водорослей и др.), а затем стал применяться и при Корепанова Е.А. 2016 © 4 изучении искусственных мембран, преимущественно плоских бислойных липидных мембран (БЛМ), в которые встраивались каналообразующие соединения и комплексы. 2.1. Метод БЛМ При изучении электрической активности ионных каналов очень удобно проводить опыты на модельных фосфолипидных мембранах. Как правило, в этих экспериментах используются так называемые плоские бислойные липидные мембраны (БЛМ). Используя методику фиксации электрического напряжения на БЛМ, можно регистрировать не только интегральный ионный ток, но и токи, проходящие через единичный канал. Дело в том, что в модельную мембрану можно встроить малое количество каналов, при котором, благодаря их асинхронному открыванию и закрытию, можно регистрировать токи, протекающие через единичные ионные каналы. На рис. 15 представлена схема формирования таких мембран. Рис. 15. Схема формирования БЛМ из липидной капли. В область отверстия (диаметром не более 1,3 мм) в стаканчике, изготовленном из гидрофобного материала (фторопласт, полиэтилен), впрыскивают каплю раствора фосфолипидов, как правило, в н-декане или гептане. Однако не исключено использование других растворителей. Формирование БЛМ начинается с истончения толстой липидной капли. Главными силами, определяющими поведение капли, являются межфазное (поверхностное) натяжение, σ , и ван-дер-ваальсовы силы притяжения водных фаз по обе стороны от капли, сжимающие ее в поперечном направлении (расклинивающее давление). За процессом формирования тонкой, бислойной, плёнки можно наблюдать визуально в отражённом свете. Пока пленка толстая она выглядит, как обычное макротело. При толщине пленки, соизмеримой с длиной волны падающего света, начинается интерференция лучей, отражаемых от её передней и задней поверхностей. На поверхности плёнки появляются цветные узоры, так называемые кольца Ньютона. Такие пленки, содержащие линзоподобные утолщения, получили название цветных плёнок. В отраженном свете бислойные липидные структуры выглядят черными на светлом фоне камеры, поэтому их называют «черными». Низкая отражающая способность черных пленок обусловлена тем, что отражаемые от передней и задней поверхностей пленки лучи находятся в противофазе и гасят друг друга. Корепанова Е.А. 2016 © 5 Формирование черной пленки не означает полного завершения всех процессов превращения липидной фазы в бислойную мембрану (БЛМ). Параллельно с почернением пленки идут более длительные процессы растекания растворителя по стенке в области По ряду физико-химических свойств бислойные липидные мембраны, приготовленные из природных фосфолипидов, близки к параметрам биологической мембраны (табл.1) . Таблица 1. Сравнение биомембран и БЛМ по их физическим свойствам Свойство Биомембраны БЛМ Вид на снимке поперечного среза, получаемый с помощью электронного микроскопа 3–х слойная структура 3–х слойная структура Толщина, нм 6,0÷10 2,5÷8,0 Межфазное натяжение, н.см (0,03÷3,9) 10 –5 0,2÷6,0 Электрическое сопротивление, Ом/см 2 10 2 ÷10 5 10 6 ÷10 9 Электрическая ёмкость, мкФ/см 2 0,5÷1,3 0,2÷1,0 Напряжение электрического пробоя, мВ 100 150÷300 Показатель преломления 1,6 1,56÷1,66 Проницаемость для воды, мкм/с 0,5÷400 31,7 Энергия активации водной проницаемости, кДж/моль 40,3 53,3 Ионная избирательность , K Na P P 1÷25 5,4÷9,0 В то же время искусственные липидные пл ё нки отличаются от биологической мембраны низкой электрической проводимостью, лишены метаболической активности и не обладают столь высокой ионной селективностью, как биологические мембраны. Многие из этих свойств могут быть приданы искусственным мембранам путем введения в их состав разнообразных мембраноактивных соединений и отдельных функционально важных элементов биологических мембран. В присутствии таких модификаторов электрическая проводимость мембран обычно возрастает. Все это свидетельствует о том, что бислойная липидная структура играет роль естественной матрицы для многих молекулярных компонентов биологической мембраны и что липидный бислой в той или иной степени свойственен природным мембранам. Широкий спектр применения различных электроизмерительных методов для изучения БЛМ, возможность изменять липидного состава БЛМ и состав внешней среды, наличие методики формирования БЛМ из отличающихся монослоев фосфолипидов с целью придания мембране ассиметричности, присущей биомембранам, обеспечило этим модельным мембранным системам одно из центральных мест в изучение функциональной активности ионных каналов. Данный метод формирования мембран относительно прост в исполнении и позволяет встраивать в мембрану необходимое для хорошего разрешения количество каналов. Вклад, который внёс данный метод в современную науку о функционировании каналов, невозможно переоценить. Корепанова Е.А. 2016 © 6 2.2. Пэтч–клэмп клеточных мембран При фиксации потенциала на мембране можно зарегистрировать ток, проходящий через единичный канал, только в том случае, когда электропроводность канала соизмерима с электропроводностью мембраны. Однако в биологической мембране одновременно работает много каналов. Поэтому наблюдать за работой единичного канала не удавалось вплоть до появления методики выделения участка нативной мембраны с малым числом каналов в нём. В решение этой методической проблемы неоценимый вклад внесли западногерманские ученые Нейер и Сакман, которые в 1976 году предложили метод регистрации электрической активности каналов в биомембранах, получивший название «пэтч–клямп». Идея метода состояла в создании методики, позволяющей максимально уменьшить площадь изучаемого участка мембраны (рис.16). Это существенно увеличивало отношение «полезный сигнал–шум» и позволяло регистрировать ток, протекающий через один ионный канал. Окончательную завершенность метод получил в 1981 году, когда были решены проблема создания плотного контакта между небольшим участком клеточной мембраны и поверхностью регистрирующего сигнал электрода (в противном случае сигнал шунтируется на землю) и проблема анализа большого массива данных с помощью пакета программ ЭВМ. Рис. 16. Различные конфигурации методики фиксации участка биологической мембраны, используемые при изучении электрической активности ионных каналов в клеточной мембране.. В конфигурации 1(“cell attach”) к поверхности клетки подводится стеклянная пипетка с оплавленными краями, диаметром 0,5-1 ммк. Пипетка заполняется концентрированным раствором хлорида калия и соединена с усилителем тока. К внутренней части пипетки прикладывается отрицательное давление. Между поверхностью клетки и краями кончика пипетки образуется плотный контакт, с сопротивлением утечки 9 1 10 10 Ом , или (1 10) гигаОм. Конфигурация 1 позволяет исследовать нативную клетку, не разрушая её, однако она недостаточно информативна, так как не позволяет варьировать вещества, подаваемые к клеточной мембране. После разрушения участка мембраны под пипеткой можно регистрировать токи от всей клетки, как с микроэлектродами (конфигурация 2 “whole cell recording”). В этом случае можно регистрировать токи от клеток очень малых размеров (5-10 ммк). При плавном отведении пипетки от клетки в конфигурации 2 образуется перетяжка, а затем маленькая везикула, содержащая всего несколько каналов (конфигурация 3). В данной конфигурации можно изучать работу одиночных каналов при смене Корепанова Е.А. 2016 © 7 фармакологических веществ у наружной части мембраны. Кроме того, в данной конфигурации система имеет хорошую устойчивость к вибрациям. Наконец, если в конфигурации 1 резко отвести пипетку от клетки, то на кончике пипетки образуется маленький фрагмент мембраны с её внутренней частью, обращенной наружу (Конфигурация 4 “inside out”). Оторванный от клетки фрагмент мембраны может содержать всего один или несколько ионных каналов. Конфигурация 4 позволяет подавать вещества к внутренней части мембраны и регистрировать работу отдельных каналов, её характеризует высокая устойчивость к вибрациям. Таким образом, метод «рэтч-клямп» позволяет исследовать 1) электрическую активность отдельной клетки малых размеров, 2) регистрировать работу отдельных каналов, 3) исследовать действие фармакологических веществ при их добавлении в окружающую среду, как с внутренней, так и с наружной стороны мембраны. 3. Получаемая информация 3.1. Электропроводность одиночного ионного канала Функционирование каналов проявляется в виде дискретных флуктуаций тока, характерной прямоугольной формы (рис.17,18) . Рис. 17. Одиночные ионные каналы, формируемые в искусственных липидных мембранах (БЛМ) пептидными антибиотиками. Схематическое изображение записи тока при фиксированном напряжении. На рис. 18 приводится пример типичных записей флуктуаций токов, возникающих в отрицательно заряженных БЛМ в присутствии поликатионного пептидного антибиотика полимиксина В. Корепанова Е.А. 2016 © 8 0 10 20 30 40 50 60 70 4 5 6 7 23 24 25 26 27 28 30 31 32 33 Проводимость, пСм Ч ис ло ре ализа ций 10 сек 1 пА Рис. 18. Типичные флуктуации тока, индуцируемые пептидным антибиотиком полимиксином В в отрицательно заряженных липидных мембранах и гистограмма их проводимостей. Напряжение 70 мВ. Пропускная способность (проводимость) каналов оценивается в пико Сименс (пико = 12 10 ). Сименс – величина обратная Ом. Проводимость одиночных каналов составляет, как правило, десятки пико См , редко – единицы или сотни пико См . Проводимость канала легко рассчитать, разделив ток канала на величину приложенного напряжения. Для одного сорта каналов проводимость – величина постоянная. Однако, построив гистограмму проводимостей среди них, как правило, можно выделить минимальный импульс и импульсы, кратные минимальному импульсу. Появление импульсов тока, кратных минимальному импульсу, по-видимому, связано с одновременной работой нескольких каналов. Возможна также ситуация, когда один тип каналов имеет несколько уровней проводимости, что обусловлено изменением конформационной структуры канала при вхождении в него ионов. Примером такого канала является пептидный антибиотик аламецитин (рис.17). Уникальным свойством каналов является их селективностьь, то есть способность отличать определенный вид ионов, к транспорту которого они приспособлены, от всех других ионов и веществ. При этом в мембране может существовать несколько типов каналов, обладающих одинаковой селективностью, но имеющих разную проводимость. Например, в сердечной мышце есть калиевые каналы, имеющие проводимость около 10, 30, 60 и 110 пСм. Каждый из этих каналов выполняет различную физиологическую функцию в работе сердца. 3.2. Размер эффективного сечения канала Используя гистограмму проводимостей можно рассчитать значение средней величины проводимости канала и, допуская, что канал имеет цилиндрическую форму, с помощью нехитрых вычислений оценить диаметр канала. Полагая, что между проницаемостью мембраны и ее проводимостью в симметричном ионном окружении существует такая же зависимость как в мембране, можно написать: Корепанова Е.А. 2016 © 9 2 2 n p z F g P C R T , где n g – проводимость поры в расчете на единицу площади ее просвета, а p p связана с коэффициентом диффузии иона в поре p D , коэффициентом распределения p K иона в системе: просвет поры – вода и длиной поры обычным соотношением p p p D K p Используя дополнительные преобразования исходного уравнения, можно рассчитать диаметр канала. В эксперименте измеряют либо проводимость мембраны в целом m G , либо проводимость одиночного канала chan g . Соотношение между этими величинами очевидно: m chan G n g , где n – число пор на единицу площади мембраны. Соотношение между chan g и n g тоже достаточно ясное: 2 chan n g g πr , где 2 πr –площадь поры, а r – ее радиус. Окончательно выражение для проводимости ионного канала можно представить в виде: 2 2 p p 2 chan D K z F g C π r R T chan chan chan 2 2 p p p p g R T g R T 1 r z F π D K C π D K C z F При длине канала 6нм , коэффициенте диффузии в воде 9 2 1 D 210 м с (эта цифра относится к ионам K , Cl ) и температуре o 25 C : 2 5 2 chan p Кл м g 3948 10 K C r См моль Дж сек Оценить диаметр канала можно и несколько другим способом, если рассматривать канал как шунтирующее сопротивление, заполненное электролитом с удельной электропроводностью, равной удельной электропроводности электролита окружающей среды. Тогда электропроводность канала будет равна: chan κ S g См , где - удельная электропроводность электролита, которую можно рассчитать по формуле κ λ C , используя табличное значение λ – электропроводность раствора одного грамм-эквивалента электролита, находящегося между двумя параллельными электродами площадью 2 S 1см с расстоянием между ними в 1 см. Корепанова Е.А. 2016 © 10 Таким образом, 2 chan κ π r g Cм , следовательно chan chan g r κ π , где r – искомый радиус канала. Очевидно, что оба способа оценки радиуса канала допустимы только к каналам, которым соответствуют большие амплитуды флуктуаций тока, позволяющие предположить, что канал заполнен электролитом. Диаметр подобных больших ионных каналов по оценкам разных исследований составляет 0,5 - 0,7 нм. 3.3. Кинетика работы ионного канала Другой важный параметр канала – кинетика его работы. Каналы открываются на времена порядка 1 – 100 мсек, иногда и на более длительное время (это зависит от природы изучаемого канала), измеряемое секундами, пропуская 7 8 10 10 ионов в секунду. Канал открывается не всегда на одно и то же время. Закон распределения времён открытого состояния канала – экспонента, то есть канал открывается чаще на короткое время и реже – на длинное (рис. 19). Рис.19. Гистограмма времени нахождения каналов в открытом состоянии. Количественным параметром является среднее время открытого (или закрытого) состояния. Для его определения строятся временные гистограммы, в которых анализируется несколько сот срабатываний канала. «Постоянная» спада получаемой экспоненты, , характеризует среднее время открытого состояния ионного канала. При прочих равных условиях является постоянной (характеристической) величиной для данного типа каналов. 3.4 .Вольт-амперная характеристика канала Зависимость амплитуды ступенек тока от мембранного потенциала m (вольт–амперная характеристика) позволяет делать некоторые заключения о механизме проводимости каналов. В широких каналах эта характеристика линейна , что позволяет предположить, что канале находится электролит и поэтому ток в таком канале описывается уравнением: 2 2 2 m z F I p c z Fψ p c R T . В растворах разных ионов линейность вольт амперной Корепанова Е.А. 2016 © 11 характеристики такого канала сохраняется, но имеет различную крутизну (т.е. каналы имеют разную проводимость), что позволяет выявить ион, для которого канал избирательно проницаем (Рис. 20). Рис.20. Вольт-амперные характеристики широкого канала, получаемые в различных электролитах. В узких каналах вольт–амперная характеристика может быть нелинейной (эти случаи подробно рассматривались в части «Теория»). С учетом такого рода данных можно сделать ряд заключений о том, как устройство поры влияет на её ионную проводимость, а, следовательно, и на ионную проницаемость мембраны в целом. 1 2 |