Методические рекомендации Автор Профессор Мусина Л. Т
 Скачать 81.5 Kb.
|
|
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ Кафедра микробиологии Физиология бактерий (часть первая) Методические рекомендации Автор Профессор Мусина Л.Т. Физиология бактерий. Конструктивный обмен (анаболизм) Обмен веществ и энергии в клетке - называется метаболизмом. Он представляет собой совокупность двух противоположных, но взаимосвязанных процессов – катаболизма, или энергетического метаболизма, и анаболизма, или пластического метаболизма. Анаболизм – совокупность биохимических реакций, осуществляющих синтез компонентов клетки. Катаболизм – совокупность реакций, обеспечивающих клетку энергией, необходимой, в частности, для пластического обмена. Для прокариот характерно многообразие и пластичность метаболических процессов. Для осуществления нормальной жизнедеятельности бактериям необходимо постоянно и тщательно регулировать обмен различных веществ между клеткой и внешней средой. Цитоплазматическая мембрана бактерий проницаема для многих веществ, поток их идет в обоих направлениях. Мембрана обладает избирательной и неравномерной проницаемостью, определяющей механизмы питания бактерий. Питательные вещества поглощаются бактериальной клеткой в молекулярной форме и поступают в нее тремя основными путями: пассивной диффузией, облегченной диффузией и пассивным транспортом. Пассивная диффузия осуществляется за счет различного содержания питательных веществ в среде и в клетке и происходит в направлении от большей концентрации к меньшей (по градиенту концентрации). Пассивная диффузия не требует затрат энергии. Таким путем в клетку проникает и покидает её вода вместе с растворенными в ней различными мелкими молекулами, способными проходить через поры мембраны. Облегченная диффузия характеризуется выраженной субстратной специфичностью и протекает с участием специфичных белков – пермиаз, локализованных в мембране. Пермиазы распознают и связывают молекулу субстрата на внешней стороне мембраны и осуществляют ее перенос через мембрану. На внутренней стороне мембраны комплекс пермиаза-субстрат диссоциирует, освободившаяся молекула субстрата включается в общий метаболизм клетки, а пермиаза вновь готова повторить цикл переноса своего субстрата. Облегченная диффузия происходит только по градиенту концентрации, поэтому она не требует затраты энергии. Активный транспорт осуществляется специфическими пермиазами против градиента концентрации, поэтому он требует затраты энергии. Большинство веществ проникает в клетку именно этим путем. В процессе переноса может происходить химическая модификация веществ – например, фосфорилирование углеводов. Так при участии фосфотрансферазной системы транспортируются многие сахара и их производные, в процессе переноса они фосфорилируются и поступают в клетку в виде сахарофосфатов. В качестве питательных веществ бактерии используют различные органические и минеральные соединения. К числу важнейших химических элементов, необходимых для синтеза органических соединений, относят: углерод, азот, водород и кислород. Свою потребность в водороде и воде бактерии удовлетворяют через воду. По способу углеродного питания бактерии делят на две группы – автотрофы и гетеротрофы. Автотрофы (лат.auto –сам, trophe -питание) – организмы, которые полностью удовлетворяют свои потребности в углероде за счет СО2. Гетеротрофы (лат.heteros – другой, trophe -питание, т.е. «питающиеся за счет других») – организмы, которые не могут удовлетворять свои потребности в углероде только за счет СО2, а требуют для своего питания готовые органические соединения. В свою очередь гетеротрофы делят на сапрофиты и паразиты. Сапрофиты (лат. sapras –гнилой, phytos-растение) – гетеротрофы, источником питания которых служат мертвые органические субстраты. Паразиты (лат.para –при, sitas-пища) – гетеротрофы, живущие за счет живых организмов. Для синтеза органических соединений бактериям необходима энергия. В зависимости от источника энергии бактерии подразделяются на фототрофы и хемотрофы. Фототрофы – способны использовать энергию солнечного света, это исключительно сапрофитные микроорганизмы. К фотосинтезирующим бактериям – фототрофам – относятся цианобактерии (синезеленые водоросли), пурпурные и зеленые бактерии и архебактерии. Хемотрофы – организмы, получающие энергию за счет окислительно-восстановительных реакций. В зависимости от того какими донорами электронов пользуются бактерии, их разделяют на литотрофы и органотрофы. Литотрофы – организмы, использующие неорганические доноры электронов Н2, NH2, H2S, Fe и др. Органотрофы – организмы, в качестве доноров электронов использующие органические соединения. Таким образом, по способу углеводного питания все организмы можно подразделить на три основные группы: 1.Фотолитотрофы – организмы, источником энергии для которых служит солнечный свет, донорами электронов – неорганические соединения. 2. Хемолитотрофы – организмы, получающие энергию за счет окислительно-восстановительных реакций, донорами электронов которых служат неорганические соединения. К данной группе относятся сапрофитные бактерии. 3. Хемоорганотрофы – организмы, получающие энергию за счет окислительно-восстановительных реакций, донорами электронов которых служат органические соединения. Большинство патогенных бактерий относятся к данной группе. По способу азотного питания бактерии подразделяют на аминоавтотрофы и аминогетеротрофы. Аминоавтотрофы – организмы, способные полностью удовлетворять свои потребности в азоте, необходимым главным образом для синтеза белков и нуклеиновых кислот, с помощью атмосферного или минерального азота. К их числу относятся азотфиксирующие бактерии, свободно живущие в почве и нирофицирующие бактерии, которые в качестве основного источника азота используют соли аммиака, азотистой и азотной кислот. Аминогетеротрофы – организмы, для роста и размножения, нуждающиеся в различных органических азотистых соединениях. Для нормальной жизнедеятельности бактерии, кроме того, нуждаются в ионах Na+, K+, Cl+, Ca2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+, Cu2+, а также в фосфоре и сере, поступающих в клетку путем диффузии и активного транспорта. Энергетический обмен (катаболизм) Для синтеза структурных компонентов микробной клетки и поддержания процессов жизнедеятельности наряду с питательными веществами требуется достаточное количество энергии. Эта потребность удовлетворяется за счет биологического окисления и консервируется в форме АТФ. Молекулы АТФ синтезируют в результате переноса электрона от его первичного донора (органическое вещество) до конечного акцептора. В зависимости от того, что является конечным акцептором электронов, различают аэробное и анаэробное дыхание. При аэробном дыхании конечным акцептором электронов служит молекулярный кислород (О2), а при анаэробном – различные неорганические соединения: NO3-, SO42-, SO3 2-. По типу дыхания микроорганизмы подразделяются на 5 групп: 1.Строгие (облигатные) аэробы – размножаются только в присутствии кислорода (вибрионы, микобактерии). 2.Микроаэрофилы – растут при сниженном по сравнению с аэробами парциальном давлении кислорода, но не растут без кислорода (некоторые виды бруцелл). 3.Факультативные анаэробы – могут потреблять глюкозу и размножаются как в аэробных, так и в анаэробных условиях (большинство условно-патогенных и патогенных бактерий). 4.Строгие (облигатные) анаэробы – размножаются только в бескислородных условиях, т.е. не используют кислород в качестве конечного акцептора кислорода (клостридии, бактериоды и др.). 5. Аэротолерантные бактерии – анаэробные бактерии, не использующие кислород для получения энергии, но способные к выживанию в присутствии кислорода. Питательные среды и их характеристика Бактерии (за исключением облигатных внутриклеточных паразитов – риккетсий и хламидий) культивируются, как правило, на искусственных питательных средах. Питательной средой называют среды, содержащие различные соединения сложного или простого состава, применяемые для размножения микробов в бактериологических лабораториях. Для получения хорошего и быстрого роста они должны отвечать следующим требованиям: Содержать в достаточном количестве все необходимые питательные вещества. Иметь оптимальную рН среды для роста данного вида бактерий. Большинство патогенных для человека микроорганизмов растут при нейтральной рН среды (7,2-7,8). Должны быть изотоничными, для этого к ним добавляют 0,9% по концентрации хлорида натрия. (NaCl). Иметь достаточную влажность, т.к. при усыхании повышается концентрация солей, тормозящих рост бактерий. Быть стерильными, не содержать посторонней микрофлоры. Питательные среды различают по консистенции, происхождению и назначению. По консистенции питательные среды бывают жидкие, полужидкие и твердые. Жидкие среды готовят на основе водных растворов каких-либо веществ, как правило, мясной воды. Для получении плотных сред к жидким добавляют уплотнители, чаще всего агар-агар. Он представляет собой полисахарид сложного состава, имеющий волокнистую структуру, получаемый из морских водорослей. Агар-агар плавится при температуре около 90 0С и затвердевает при температуре около 40 0С. Полужидкие среды имеют вязкую консистенцию благодаря добавлению к ним небольшого количества агар-агара (0,3-0,7%). В плотных средах концентрация агар-агара составляет 1,5-3,0%. По происхождению питательные среды делят на естественные и искусственные. Естественные среды готовят из молока, мяса, яиц, картофеля, сыворотки крови человека, животных и др. продуктов. В практической бактериологии чаще используют искусственные питательные среды, представляющие собой сбалансированные смеси питательных веществ в концентрациях и сочетаниях, необходимых для роста и размножения микроорганизмов. В них в качестве универсального источника азота и углерода используют пептоны – продукты неполного расщепления белков с помощью пепсина или различные гидролизаты (рыбный, казеиновый, дрожжевой и др.). По назначению питательные среды делятся на следующие категории. Основные (универсальные) – среды, на которых хорошо растут многие виды бактерий. К ним относятся мясо-пептонный бульон (МПБ) и мясо-пептонный агар (МПА). МПБ готовят на основе мясной воды с добавлением 1% пептона и 0,5% NaCl. Для получения МПА к мясо-пептонному бульону добавляют 2-3% агар-агара. Специальные среды используют для получения роста прихотливых бактерий, не растущих или очень плохо растущих на основных питательных средах. Специальные питательные среды (кровяные, сывороточные, асцитические, сахарные и т.д.) приготавливают путем добавления к МПБ или МПА крови (5-10%), сыворотки (10-20%), асцитической жидкости (25-30%), углеводов (0,5-1,0%), глицерина (2-5%). Кровяной агар используют для выделения стрептококков, сывороточный – для получения роста менингококков и гонококков. На среде КУА (казеиново-угольный агар) выделяют бордетеллы, а на среде Левенштейна-Иенсена – микобактерии. К специальным тканевым средам относят среды Кита-Тароцци и среду Аристовского-Гельтцера. Первая содержит – содержит мясо-пептонный бульон, 0,5% глюкозы и кусочки печени или мясного фарша. Вторая – кроличью сыворотку и кусочки мозга кролика. Эти среды применяются для культивирования анаэробных бактерий. Перед посевом среды прогревают в водяной бане в течение 10-15 минут для удаления воздуха. После посева среды заливают слоем вазелинового масла или парафина с целью изоляции от атмосферного воздуха. Элективные среды предназначены для избирательного выделения и накопления микробов определенного вида из материалов, содержащих разнообразную микрофлору. Принципы действия элективных сред основываются на: Опережении роста определенного вида микроба по сравнению с сопутствующей микрофлорой. Например: на среде Ру (свернутая лошадиная сыворотка) и среде Леффлера (1 часть лошадиной сыворотки и 3 части сахарного бульона) возбудитель дифтерии образует видимый рост через 4-6 часов, остальные бактерии через 18-24 часа. Добавлении веществ, ингибирующих рост сопутствующей микрофлоры. Например: на среде ЖСА (желточно-солевой агар), содержащий до 9% NaCl, культивируют стафилококки, рост же других бактерий столь высокое содержание соли подавляет. Пептонная вода (рН- 8,4) используется для выращивания холерного вибриона, т.к. сдвиг рН среды в щелочную сторону не влияет на рост данного вида микроба. Добавление желчи в среду Рапопорт ингибирует рост большинства бактерий, но не влияет на выделение сальмонелл. Дифференциально-диагностические - среды, позволяющие отличать одни виды бактерий от других по их ферментативной активности или культуральным проявлениям. В состав данных сред входит: 1.Основная питательная среда (МПБ или МПА). 2.Определенный химический субстрат (например, углевод), различное отношение к которому является диагностическим признаком для данного микроба. 3.Индикатор, изменение цвета которого свидетельствует о биохимической реакции. К дифференциально-диагностическим средам относятся среды Эндо, Плоскирева, Левина, Гиса и многие другие. Среда Эндо состоит из МПА с добавление 1% лактозы и индикатора (основного фуксина, обесцвеченного сульфитом натрия). Свежеприготовленная среда имеет бледно-розовую окраску. При росте лактозоположительных бактерий (эшерихий) их колонии окрашиваются в темно-красный цвет с металлическим блеском. Лактозоотрицательные колонии образуют бесцветные колонии. Среда Плоскирева (содержащая МПА, лактозу и индикатор нейтральный красный) является не только дифференциально-диагностической, но и селективной, так как подавляет рост сопутствующих микробов за счет содержания бриллиантовой зелени, солей желчных кислот и способствует лучшему росту некоторых болезнетворных бактерий (сальмонелл, шигелл). Среды Гиса состоят из 1% пептонной воды, 0,5% определенного углевода (глюкоза, лактоза, манит и др.) и индикатора Андреде (кислый фуксин в 1н. растворе NaOH). В пробирку со средой опускают поплавок (стеклянная трубочка, один конец которой запаян) для улавливания газообразных продуктов, образующихся при разложении углеводов. Свежеприготовленная среда имеет слегка желтый оттенок. При разложении углеводов она приобретает красный цвет. Синтетические – среды строго определенного состава, представляющие собой растворы неорганических и органических соединений, обеспечивающих азотистое, углеродное и минеральное питание микроорганизмов. Например, среда Сотона для культивирования туберкулезных микобактерий. Среда 199, среда Игл для культуры клеток. В настоящее время в бактериологических лабораториях широко используют сухие питательные среды, выпускаемые промышленностью. Они представляют собой гигроскопические порошки, растворяющиеся в воде. Данные среды имеют постоянный состав, их просто готовить и удобно транспортировать. Культуральные свойства бактерий Культуральные свойства бактерий характеризуют их питательные потребности, условия и характер роста на твердых и жидких питательных средах. В зависимости от пищевых потребностей того или другого вида микроба питательные среды должны содержать соответствующие питательные вещества (об этом было подробно сказано выше). Для роста и размножения микроорганизмов важную роль играют также температурные условия. По отношению к температурному оптимуму все бактерии делят на 3 группы: психрофилы, мезофиллы и термофилы. Подавляющее большинство патогенных микроорганизмов относится к мезофиллам, их температурный оптимум составляет 34-370С. Для выращивания микробов используют специальный прибор – термостат. Это железный шкаф с двойными стенками, в котором поддерживается постоянная температура при помощи терморегулятора. Посевы в большинстве случаев помещают в термостат на 18-24 часа. Некоторые микроорганизмы растут 4-6-8 часов (холерный вибрион, коринебактерии дифтерии на соответствующих элективных питательных средах), другие вырастают через несколько дней (бордетеллы, лептоспиры и др.) и даже через 1-3 месяца (микобактерии туберкулеза). Появление видимого роста на питательных средах определяется временем генерации, т.е. периодом, в течение которого осуществляется деление клетки. Продолжительность генерации зависит от вида бактерии, состава питательной среды, рН, температуры, аэрации и других факторов. В оптимальных условиях время генерации у разных бактерий колеблется в довольно широких пределах: от 20 минут у кишечной палочки до 14 часов у микобактерии туберкулеза, в связи с чем видимый рост образуется через 18-20 часов, либо через 3-5 недель соответственно. На жидких питательных средах бактерии могут образовывать следующие формы роста: равномерное помутнение и осадок на дне – большинство патогенных бактерий; пленку на поверхности среды – холерный вибрион, коринебактерии дифтерии, микобактерии туберкулеза и др.; пленку с отходящими в глубь среды нитями (сталактиты) – возбудитель чумы; «придонно-пристеночный» рост – стрептококки; рост в виде «комочков ваты» - сибиреязвенная палочка. На плотных питательных средах бактериальные клетки, фиксированные на поверхности среды, образуют макроскопические скопления (колонии) бактерий одного вида, выросших в результате размножения одной или нескольких бактериальных клеток. Колонии разных видов бактерий отличаются по размерам, форме, поверхности, консистенции, окраске и др. Все эти признаки, как правило, видоспецифичны, поэтому они имеют важное диагностическое значение, т.е. их изучение используется для определения видовой принадлежности исследуемой культуры. Размеры колоний варьируют от десятых долей – до 5-6 мм. Различают точечные (колонии с диаметром не более 1 мм), средние (размером 2-4 мм), крупные (более 5 мм). Форма колоний может быть круглая, розетковидная, звездчатая, древовидная и др. Колонии бывают плоскими, выпуклыми, куполообразными, вдавленными. Края у колоний могут быть ровными, волнистыми, фестончатыми, расплывчатыми, изрезанными и др. Поверхность колонии может быть гладкая или шероховатая, влажная или сухая. По консистенции различают однородные или зернистые колонии, по прозрачности матовые, непрозрачные или прозрачные. Колонии могут быть бесцветными или окрашенными (пигментированными). Белые, золотистые, лимонно-желтые колонии у стафилококков, рубиново-красные – у серрации, сине-зеленые – у синегнойной палочки, кремовые – у микобактерий туберкулеза. Различают колонии S и R типа. S-типа колонии – круглые, гладкие, блестящие, выпуклые, с ровными краями, влажные. R- типа колонии более крупные, плоские, шероховатые, матовые, неправильной формы, с исчерченными краями. Подавляющее большинство патогенных бактерий образует колонии S – типа. R – типа колонии образуют: 1.Возбудитель сибирской язвы – матовые, плоские с локонообразной периферией колонии (колонии в виде «львиной гривы»). 2.Возбудитель чумы – периферийная кружевная зона, вокруг приподнятой центральной части колонии (колонии в виде «кружевного платочка»). 3.Возбудитель туберкулеза – морщинистые колонии светло-кремового цвета (колонии в виде «тутовой ягоды»). 4.Возбудитель дифтерии – плоские колонии с радиальной исчерченностью (колонии в виде «цветка маргаритки»). 5.Микоплазмы – колонии состоят из центра, врастающего в глубь среды и периферийной ажурной части (колонии в виде «яичницы-глазуньи»). Однако форма колоний подвержена изменчивости. R-формы колоний могут переходить в S- формы и наоборот. Выделение чистой культуры аэробных бактерий Выделение микроорганизмов из различных материалов и получение их культур широко используется в лабораторной практике для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний. Чистой культурой называется популяция бактерий одного вида, выращенная на питательной среде. Выделение чистой культуры аэробных бактерий достигается механическим разобщением исследуемого материала при посеве на питательные среды в присутствии кислорода. Л.Пастер предложил для этой цели последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде, однако выделить чистую культуру этим методом очень сложно, т.к. при этом требуется очень большое количество разведений. Проблему выделения чистых культур решил Р.Кох. Он предложил исследуемый материал разводить в пробирках с расплавленным и остуженным до температуры 45-50 0С МПА (количество разведений зависит от исходной обсемененности материала.). Затем содержимое каждой пробирки выливают в стерильную чашку Петри, которые помещают в термостат. На следующий день посевы изучают. Отбирают подозрительные колонии, изучают их макроскопически и микроскопически в окрашенных препаратах. Далее производят пересев колонии в пробирку со скошенным МПА. На следующий день проверяют чистоту выделенной культуры визуально и микроскопически. В настоящее время метод Коха применяется, в основном, для подсчета количества микробов в исследуемом материале. В практических лабораториях обычно для выделения чистых культур используется метод Дригальского – поверхностный последовательный рассев исследуемого материала петлей или шпателем на три чашки (три сектора) с МПА. Процесс выделения чистой культуры можно разделить на несколько этапов. Первый этап. Из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают по Грамму или другим методом и микроскопируют. В случае необходимости исследуемый материал для посева разводят стерильным раствором 0,9% NaCl. Материал захватывают петлей и наносят на поверхность питательной среды. Движения петли должны производиться последовательно по всей поверхности среды, при этом крышку чашки Петри приоткрывают левой рукой ограниченно так, чтобы могла пройти только петля. После посева петлю прожигают в пламени спиртовки. Чашки подписывают на донышке и ставят вверх дном в термостат при температуре 37 0С на 18-24 часа. Второй этап. На следующий день посевы просматривают и изучают изолированные колонии, описывая характер роста. Изучают морфологию бактерий исследуемых колоний путем приготовления мазка, окрашенного по методу Грамма. Далее для выделения и накопления чистой культуры производят пересев колонии в пробирку со скошенным МПА. Пробирки подписывают и помещают в термостат при температуре 370С на 18-24 часа. Третий этап. На следующий день отмечают характер роста выделенной чистой культуры. Визуально чистая культура характеризуется однородным ростом. При микроскопическом исследовании мазка, приготовленного из чистой культуры, в нем обнаруживаются морфологически и тинкториально однородные клетки. Кроме упомянутых методов, в бактериологической практике иногда применяют и другие, например, для выделения протея, обладающего «ползучим» ростом, используют метод Шукевича. Исследуемый материал засевают в конденсационную воду скошенного МПА. Бактерии, обладающие ползучим ростом, из конденсационной воды вползают на поверхность агара. На следующий день проверяют чистоту выделенной культуры. Из верхнего края налета делают мазок, окрашивают по Грамму и микроскопируют. Для выделения чистой культуры микробов с трудом культивируемых на питательных средах (например, пневмококков), используют биологический метод – заражение наиболее восприимчивых к данному виду возбудителя животных. После гибели или появления признаков заболевания животных забивают и производят посев крови и органов на питательные среды и микроскопическое исследование мазков-отпечатков из органов. Далее исследование проводят как в методе Дригальского. Чистую культуру аэробных бактерий можно также получить, если на исследуемый материал воздействовать каким-либо физическим или химическим фактором, оказывающим избирательное антибактериальное действие. Например: для выделения чистых культур спорообразующих бактерий, исследуемый материал прогревают при температуре 800С в течение 20 минут или кратковременно кипятят для уничтожения вегетативных форм. Споры при этом сохраняются и при посеве материала на питательную среду прорастают. Далее чистую культуру получают обычным путем. Для выделения чистой культуры возбудителя чумы посевы инкубируют при температуре 50С. Данный температурный режим подавляет пост сопутствующей микрофлоры. Для получения чистой культуры кислотоупорных бактерий (микобактерии туберкулеза) исследуемый материал обрабатывают 2% серной кислотой, уничтожающей сопутствующую флору. |