Садовая Конспект семинара по частной микробиологии. Номер семинарского занятия Тема семинарского занятия Методы лабораторной диагностики сибирской язвы
 Скачать 0.56 Mb.
|
|
План-конспект семинарского занятия по дисциплине “Частная микробиология” для студентов 3 курса 3 группы ВБФ по направлению подготовки 19.03.01 Биотехнология Номер семинарского занятия - 2. Тема семинарского занятия - Методы лабораторной диагностики сибирской язвы. Цель семинарского занятия - ознакомить студентов со схемой лабораторной диагностики сибирской язвы, биопрепаратами. Задачи семинарского занятия: 1)образовательная задача - обучить студентов методологии бактериологических исследований биоматериала при подозрении на сибирскую язву; 2)воспитательная задача - сформировать у студентов навыки правильного и бережного обращения с биологическим материалом; 3)развивающая задача - развить у студентов способность наблюдать за ходом бактериологического исследования и делать выводы на основании увиденного. Оборудование и материалы. Культура вакцинного штамма B.anthracis на МПА, в МПБ, сибиреязвенная преципитирующая сыворотка, стандартный антиген, пробирки Уленгута, штативы, пипетки Пастера, сибиреязвенные биопрепараты. Этапы семинарского занятия: 1.Организационный момент (1-2 минуты) 2.Подготовка к активному и сознательному усвоению материала (2-3 минуты) 3.Получение новых знаний (20-23 минуты) 4.Закрепление новых знаний. Самостоятельная работа студентов (60 минут) 5.Оценивание обучающихся. Итог занятия (1-2 минуты) Ход семинарского занятия. 1.Приветствие студентов. Перекличка 2.Ребята, на лекции вы познакомились с биологическими свойствами возбудителя сибирской язвы. На этом семинарском занятии мы поговорим о лабораторной диагностике сибирской язвы и о применяемых для профилактики, терапии и диагностики биопрепаратах. Начнем с систематики возбудителя сибирской язвы. 3.Систематическое положение возбудителя сибирской язвы Вопрос к студентам. Назовите, какой микроорганизм является возбудителем сибирской язвы. Ответ. Возбудителем сибирской язвы является микроорганизм Bacillus anthracis Царство Bacteria Тип Firmicutes Класс Bacili Порядок Bacillales Семейство Bacillaceae Род Bacillus Вид Bacillus anthracis Лабораторная диагностика сибирской язвы основана на результатах бактериологического исследования (рисунок 1-2).  Рисунок 1.Микробиологическое исследование при сибирской язве (I этап)  Рисунок 2.Микробиологическое исследование при сибирской язве (II-III этапы) Бактериологическое исследование включает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале( методом световой и люминесцентной микроскопии, а также биопробой), выделение чистой культуры и идентификацию возбудителя по культурально-морфологическим признакам. В лабораторию направляют ухо от трупа животного, перевязанное у основания (ухо отрезают с той стороны, на которой лежит труп), или кровь из надреза уха в виде толстого мазка на двух предметных стеклах ; от трупов свиней - заглоточные лимфатические узлы и участки отечной соединительной ткани. Если подозрение на сибирскую язву возникло в ходе вскрытия, его прекращают и на исследование направляют часть селезенки. Высушенные мазки кладут в чашки Петри, которые оборачивают плотной бумагой. На упаковке делают надпись "Мазок не фиксирован!". Посуду с материалом помещают во влагонепроницаемую тару, обвязывают, пломбируют или опечатывают, делают надпись "Верх. Осторожно!" и с сопроводительными документами направляют в лабораторию. 1.Микроскопия препаратов из исходного материала Из поступившего в лабораторию материала готовят мазки, окрашивают по Граму; одним из методов для выявления капсулы (методы Михина, Ольта). Вопрос к студентам. Расскажите, какая микроскопическая картина будет в окрашенных мазках из трупного материала. Ответ. В окрашенных мазках из трупного материала возбудитель обнаруживают в виде крупных грамположительных палочковидных бактерий, расположенных одиночно, парами, короткими цепочками. Концы палочек, обращенные друг к другу, резко обрублены(рисунок 3).  Рисунок 3.Возбудитель сибирской язвы в спинномозговой жидкости (микроскопическая картина). В отдельных случаях, особенно в мазках из материала, полученного от свиней, форма клеток может быть нетипичной: короткие, толстые, изогнутые, или зернистые палочки со вздутием в центре или на концевых частях бактерий. Предварительный ответ в хозяйство, откуда поступил материал, дают немедленно по результатам микроскопического исследования. 2.Выделение и идентификация культуры возбудителя. С целью выделения культуры возбудителя исследуемый материал засевают в МПБ, на МПА или в бульон и агар Хоттингера и инкубируют в аэробных условиях 18-24 часа. На МПА Bacillus anthracis формирует плоские, матово-серые, шероховатые, с отростками на краях колонии (R-форма), может образовывать и атипичные колонии без отростков. Края колоний R-формы под малым увеличением микроскопа имеют вид локонов, получивших название “львиная грива” (рисунок 4). В МПБ рост возбудителя характеризуется образованием на дне пробирки рыхлого осадка при прозрачной питательной среде, после встряхивания осадок разбивается на хлопья.  Рисунок 4.Характер роста Bacillus anthracis на МПА и в МПБ Если возбудитель выращивать на питательных средах, содержащих сыворотку крови, и в атмосфере с повышенным содержанием оксида углерода (IV), то на МПА образуются гладкие колонии S-формы, а в МПБ отмечают рост в виде диффузного помутнения среды. В выросших культурах исследуют морфологические и тинкториальные свойства клеток. На бессывороточных средах бактерии капсулу не образуют, на сывороточных средах возбудитель формирует капсулу, причем клетки в препарате в последнем случае часто располагаются одиночно или парами (рисунок 5).  Рисунок 5.Клетки Bacillus anthracis в селезенке крупного рогатого скота. Окраска по Граму. Видна прозрачная капсула 3.Биопроба. Заражение лабораторных животных исходным материалом - обязательный этап, проводимый сразу после поступления материала в лабораторию. Тканевой суспензией заражают подкожно двух белых мышей по 0,2-0,5 мл или морских свинок по 0,5-2 мл. Наблюдение ведут в течение 10 суток. При наличии возбудителя животные погибают обычно через 1-3 суток. Павших животных исследуют с выделением культуры возбудителя. Если в ходе указанных исследований выделена бактерия,типичная для B.anthracis по морфологическим, тинкториальным и культуральным свойствам, патогенная для лабораторных животных, то дальнейшие исследования не проводят и диагноз считают установленным. Bacillus anthracis ферментирует с образованием кислоты без газа глюкозу, мальтозу, медленно сахарозу, трегалозу, фруктозу и декстрин. На средах с глицерином и салицином возможно слабое кислотообразование. Арабинозу, рамнозу, галактозу, маннозу, рафинозу, инулин, маннит, дульцит, сорбит, инозит не сбраживает. В случае получения нечетких результатов при вышеизложенных исследованиях проводят дополнительные с целью дифференциации выделенной культуры от сходных сапрофитных бацилл, и в первую очередь от B.cereus. При этом определяют способность микроорганизма к капсулообразованию путем посева на сывороточные среды, патогенность для лабораторных животных в биопробе, чувствительность к пенициллину, сибиреязвенному бактериофагу, специфичность к сибиреязвенным люминесцирующим сывороткам, гемолитическую активность, наличие жгутиков (таблица 1). Таблица 1. Дифференциация B.anthracis от сапрофитных бацилл
Тест “жемчужного ожерелья” разработан для определения чувствительности выделенного микроорганизма к пенициллину. Сибиреязвенные микробы на МПА с пенициллином приобретают шаровидную форму, а цепочки - вид “жемчужного ожерелья”. Спорообразующие сапрофитные аэробы в аналогичных условиях растут в обычной форме.  Рисунок 6.Тест “жемчужного ожерелья” Для определения чувствительности к сибиреязвенному бактериофагу культуру или материал засевают на скошенный МПА, затем на поверхность среды наносят каплю бактериофага и посевы выдерживают при 37-38 градусах 24 часа. В случае принадлежности культуры к B.anthracis на поверхности МПА в зоне нанесения бактериофага остается стерильная зона при наличии роста микроорганизма на остальных участках среды. Серологический метод. Если для исследования поступил загнивший материал, который нельзя подвергать обычному бактериологическому исследованию, то диагноз ставят на основании обнаружения антигенов возбудителя в материале при помощи реакции кольцевой преципитации. Материал экстрагируют физиологическим раствором (соотношение 1:10) путем кипячения в течение 30-40 минут (горячий способ). Экстракцию смеси тканевой суспензии и карболизированного физиологического раствора (соотношение 1:10) можно проводить в течение 16-18 ч при комнатной температуре (холодный способ). Экстракт фильтруют через асбестовую вату и исследуют в РП. Реакцию ставят методом “наслаивания” или “подслаивания”. При “наслаивании” в преципитационную пробирку вносят 0,2-0,3 мл преципитирующей сыворотки и осторожно наливают (наслаивают) исследуемый экстракт таким образом, чтобы компоненты не перемешивались. При “подслаивании” в пробирку вначале вносят 0,2-0,3 мл экстракта, затем под него пастеровской пипеткой - равное количество сибиреязвенной преципитирующей сыворотки. Одновременно ставят контроли: преципитирующая сыворотка плюс коммерческий стандартный сибиреязвенный антиген; преципитирующая сыворотка плюс экстрагирующая жидкость; нормальная лошадиная сыворотка плюс коммерческий стандартный сибиреязвенный антиген. Реакцию считают положительной, если через 1-2 минуты и не позже чем через 15 минут на границе между компонентами появился тонкий беловатый диск преципитации (рисунок 7).  Рисунок 7.Отрицательный и положительный результат реакции Асколи Аллергический метод.Для выявления свежих случаев и ретроспективной диагностики предложен аллерген ВНИИВВиМ (антраксин). Он применяется для диагностики сибирской язвы у свиней. Аллерген вводят строго внутрикожно в объеме 0,2 мл в среднюю часть наружной поверхности уха. Кожно-аллергическую реакцию учитывают через 6 или 24 часа, измеряя зону инфильтрата и увеличение толщины кожной складки в месте введения аллергена по сравнению с нормой. Окончательные результаты специфической индикации - через 48 часов на основании результатов: -ПЦР с материалом из типичных колоний; -МФА (РИФ) при окраске люминесцирующей соматической сибиреязвенной сывороткой культуры из типичных колоний. Окончательные результаты полного лабораторного анализа - через 2-10 суток на основании: -морфологии колоний на питательных средах и характера роста в МПБ -морфологии в мазках из выросших подозрительных колоний, МПБ -патологоанатомической картины у убитых на 2-3 сутки и павших белых мышей, обнаружения капсулы в мазках-отпечатках из органов биопробных животных и морфологии колоний при посеве органов на питательном агаре -характера роста колоний на 1% бикарбонатно-сывороточном агаре -результатов теста с сибиреязвенным бактериофагом -результатов теста на щелочную фосфатазу -результатов теста на гемолиз на агаре с дефибринированной кровью барана -результатов теста на лецитиназу -результатов теста на подвижность -результатов теста “жемчужного ожерелья” -результатов аллергической реакции с антраксином (через 24 и 48 ч) -результатов РИФ с сывороткой больного. Биопрепараты. Вакцина СТИ - живая вакцина из эталонного штамма, полученного Н.Н.Гинсбургом (1944), представляет собой споровую (95-100%) агаровую культуру в виде суспензии в 30% стерильном растворе глицерина. Вакцина ГНКИ - сухая живая вакцина из эталонного штамма ГНКИ. Вакцина против сибирской язвы из штамма № 55. Ассоциированная живая вакцина против сибирской язвы и эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота. Лечебно-профилактическая сибиреязвенная сыворотка. Получают гипериммунизацией лошадей инактивированной сибиреязвенной культурой. Также выпускают противосибиреязвенный глобулин. Сибиреязвенная преципитирующая сыворотка. Получают гипериммунизацией лошадей. Сибиреязвенный стандартный антиген для реакции преципитации.Представляет собой экстракт из инактивированной бактериальной массы B.anthracis. Сибиреязвенные люминесцирующие сыворотки готовят из сибиреязвенной преципитирующей сыворотки, предназначены для ускоренного обнаружения некапсулированных клеток возбудителя. Сибиреязвенные диагностические бактериофаги представляют собой освобожденную от бактерий путем фильтрования жидкость бульонной культуры возбудителя, зараженную бактериофагом. 4.Закрепление новых знаний.Самостоятельная работа студентов 1.Изучить культуральные свойства вакцинных штаммов СТИ, Ценковского на МПА, МПБ и кровяном агаре. 2.Приготовить препараты-мазки из суточной агаровой культуры вакцинного штамма СТИ, окрасить их по Граму и микроскопировать. 3.Провести постановку реакции преципитации методом наслаивания и оценить ее результаты. Культуральные свойства оценивать по следующему плану: 1.Форма колонии 2.Размеры колонии: крупные больше 5 мм, средние 2-5 мм, мелкие 1-2 мм, мельчайшие менее 1 мм 3.Рельеф колонии 4.Блеск колонии 5.Характер поверхности 6.Прозрачность 7.Структура колонии 8.Цвет колонии 5.Подведение итогов занятия. Рефлексия. 6.Литература 6.1.Госманов Р.Г., Колычев Н.М., Барсков А.А.Практикум по ветеринарной микробиологии и микологии:Учебное пособие.-СПб.:Издательство “Лань”, 2014.-384 с.-(Учебники для вузов. Специальная литература). -ISBN 978-5-8114-1625-7.-Текст: непосредственный 6.2.Колычев Н.М., Госманов Р.Г. Ветеринарная микробиология и микология: Учебник.-СПб.:Лань, 2014.-624 с.-(Учебники для вузов. Cпециальная литература).-ISBN 978-5-8114-1540-3.-Текст:непосредственный 6.3.Костенко Т.С., Родионова В.Б., Скородумов Д.И. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии.-М.:Колос, 2001.-344 с. -(Учебники и учеб. пособия для студентов высш. учеб. заведений).-ISBN 5-10-003507-2.-Текст: непосредственный 6.4.Методические указания “Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы” (МУК 4.2.2413-08).-Текст:непосредственный | |||||||||||||||||||||||||||||||||||