Лекция. Лекция №6 Культивирование клеток растений 08.10.22 (1). Особенности культивирования клеток растений. Использование протопластов растительных клеток для биологического конструирования
 Скачать 2.26 Mb.
|
|
Лекция №6 Тема « Особенности культивирования клеток растений. Использование протопластов растительных клеток для биологического конструирования» • ПЛАН • 1. Получение БАВ при культивирование клеток растений • 2. Методы культивирования клеток растений • 3. Технологическая последовательность твердофазного культивирования клеток растений • 4. Особенности культивирования протопластов с целью получения гетерокариоцида Средства растительного происхождения • Алкалоиды барвинка розового • Алколоиды тисового дерева • Алкалоиды безвременника великолепного • Барвинок розовый Безвременник великолепный Тисовое дерево Культура клеток, тканей и органов растений представляет собой части растений, выращиваемых в асептических условиях на искусственных питательных средах и включает: • Каллусные культуры на гелеобразной (твердой) питательной среде • Суспензионные культуры клеток в жидкой питательной среде • Культуры протопластов • Изолированные органы растений Культура клеток, тканей и органов растений Преимущества использования клеточных культур заключается в слеследующем: 1.Решается проблема дефицита исходного сырья 2.Возможность получение фитомассы, полностью свободной от гербецидов, пестицидов, тяжелых металлов 3.Имеется возможность получения новых веществ, не синтезируемых соответствующим родительским растением 4.Возможно управление биосинтезом целевых продуктов за счет условий культивирования, состава питательной среды и др. способами. 5.Имеется возможность индустриализации и удешевления производства некоторых БАВ Недостатки промышленного культивирования клеток растений • Некоторые культуры изолированных клеток и тканей не синтезируют БАВ, характерных для соответствующего родительского растения • Медленный рост растительной клетки • В суспензионной культуре клетки не идентичны • Вторичные метаболиты многих растительных культур не выделяются в питательную среду • Клетки в связи с большим размером очень чувствительны к перемешиванию и снабжению кислородом. Варианты использования культур клеток Особенности культивирования изолированных клеток и тканей растений: • Изолированные ткани и клетки растений могут успешно расти только при отсутствии конкуренции с микроорганизмами • Культивирование проводят на многокомпонентных питательных средах • Обязательными компонентами питательной среды должны быть фитогормоны (ауксин- регулирует рост и дифференцировку клеток; цитокинин – индуцирует клеточное деление) • Температура 18-27С • Влажность 60-70% • Интенсивность светового потока 1000- 1500люкс Требования к персоналу • гладкий (без складок), не отделяющий ворса, комбинезон, стянутый на поясе, с манжетами, плотно облегающими щиколотки ног; • на голову необходимо надевать шлем- капюшон, полностью закрывающий волосы, нос и подбородок; • на лицо – маску, не отделяющую ворса; • на руки резиновые (или из эластичных полимеров) перчатки, • на ноги – стерильную или продизенфицированную обувь, поверх которой рекомендуется надевать бахилы, полностью закрывающие ступню. Нижняя часть брюк должна заправляться бахилы, а рукава комбинезона – в перчатки. Этапы твердофазного способа культивирования 1) Получение экспланта В качестве экспланта можно использовать • кончики корней, • меристемы побегов, • листовые примордии, • листовые пластины • части молодых цветков и плодов Компоненты среды для выращивания растительных объектов in vitro условно можно разделить на 5 групп: • макроэлементы; • микроэлементы; • источники углерода; • витамины; • регуляторы роста. Источником углерода является сахароза и глюкоза , обычно в концентрациях 20–40 г/л. Регуляторы роста (фитогормоны). Иногда в питательных сред входят органические добавки (гидролизат казеина, кокосовое молоко, дрожжевой экстракт, эндосперм кукурузы). • Для приготовления твердых питательных сред в качестве уплотняющего вещества используют агар-агар в конечной концентрации 6– 10 г/л. 2) Получение каллуса Каллус – длительно растущая недифферинцированная масса Процессы, происходящие при каллусогенезе • Клетки эксплантов теряют вещества запаса – липиды, крахмал, белки. • Фотосинтезирующие клетки теряют хлорофилл и липиды хлоропластов, но при этом возрастает количество амилопластов. • Клетка синтезирует РНК и ДНК, и начинается экспрессия генов, присущих каллусным клеткам. • Исчезают тканеспецифичные белки-антигены и появляются белки, специфичные для делящихся клеток. Добавление к среде экзогенных гормонов приводит к началу каллусогенеза. Обязательным условием дедифференцировки клетки и ее превращения в каллусную клетку является присутствие в питательной среде представителей двух групп регуляторов роста: ауксинов и цитокининов. В случае получения первичного каллуса при оптимально подобранной среде часть эксплантов обычно за 3–8 недель образует каллусы в количестве достаточном для пересадки. Для того, чтобы не произошло старения, утраты способности к делению и отмирания каллусных клеток, полученный каллус переносят на свежую питательную среду. Эту операцию называют пассированием. Суспензионные культуры Под суспензионными культурами понимают культуры, выращиваемые в жидкой питательной среде во взвешенном состоянии и состоящие из отдельных клеток и их агрегатов. Для поддержания клеток во взвешенном состоянии при глубинном культивировании их перемешивают с помощью различных аппаратов. Аэрация обеспечивается либо путем непрерывного вращения или качания среды, либо путем ее продувания стерильным воздухом. Наиболее простым и распространенным является накопительное или периодическое культивирование. В этом случае размножение популяции клеток осуществляется в закрытой системе в постоянном объеме питательной среды Создание достаточной аэрации является условием хорошего размножения клеток и их активной деятельности. В лабораторных условиях обычно используют сосуды объемом 100–250 мл, с небольшим объемом питательной среды – 20–70 мл. Крупномасштабное культивирование осуществляется в сосудах объемом до нескольких десятков литров – ферментерах. В хемостатном режиме непрерывное культивирование зависит от лимитирующего фактора, роль которого выполняет один из компонентов питательной среды. Скорость роста и плотность клеточной популяции определяются скоростью поступления среды (скоростью разбавления), т.е. подачей лимитирующего фактора и других компонентов среды. В турбидостате рост клеток популяции поддерживается на определенном уровне благодаря регулированию оптической плотности культуры. Для этого подходят суспензии с низкой плотностью клеток и высокой удельной скоростью роста. Турбидостат снабжен фотоэлектрическим элементом, чувствительным к мутности культуры 3) Формирование полноценного растения под действием фитогормонов Соматические клетки растений являются тотипотентными, т.е. от клеток, изолированных из разных тканей растений, можно регенерировать целое растение. Если к питательной среде добавить гормоны в определенных соотношениях, можно индуцировать рост побегов и корневой системы Ауксины стимулируют рост корней, цитокинины – образование конуса роста и побегов. Выделение и очистка БАВ. Одной из особенностей стадии выделения и очистки является то, что при выделении БАВ приходится работать с весьма невысокими концентрациями выделяемого вещества (не превышающих 2%). • В качестве основных методов используют: - экстракцию с системах жидкость – жидкость, -экстракцию осадка, -сорбцию на различных сорбционных материалах, - мембранные методы очистки, -кристаллизацию, -упаривание, сушку Для получения высокоочищенных препаратов используют: -хроматографическое разделение, -препаративный электрофорез, -изоэлектрическое фокусирование, -фракционное осаждение (органическими растворителями, солями и т.п.) Эти методы используются в различных комбинациях и среди них наиболее широкое применение находит хроматография. Спасибо за внимание! |