вав. Лекция 3 Перенос генов в растения. Перенос генов в растения Вопросы Векторный перенос генов
 Скачать 1.33 Mb.
|
|
Генетической инженерия(2 часть) Перенос генов в растения Вопросы 1.Векторный перенос генов 2.Плазмидные векторы 3.Вирусные векторы 4.Прямой перенос генов 1.Векторный перенос генов При векторном переносе используются специальные молекулы ДНК - векторы Свойства векторов Способность интегрироваться в растительный геном Наличие специфического сайта для внедрения чужеродного гена Способность переноса гена в клетку растения Совместимость с чужеродным геном Способность к репликации и экспрессии чужеродного гена в растительной клетке Наличие маркерных генов Совместимость с фенотипом нормального здорового растения Отсутствие негативного влияния на регенерационную способность растительной клетки Универсальность Классификация векторов 1.Векторы, полученные на основе Ti-плазмиды 2.Векторы на основе вирусов растений 2.Плазмидные векторы Особенности Ti-плазмиды Agrobacterium_tumefaciens__Кольцевая_двухцепочная_молекул_ДНК__Размер_200_т.п.н.'>Хозяином является агробактерия - Agrobacterium tumefaciens Кольцевая двухцепочная молекул ДНК Размер 200 т.п.н. Вызывает у растений образование опухоли (корончатый галл) Больные растения синтезируют для агробактерий необычные аминокислоты — опины (октопин, нопалин) Agrobacterium tumefaciens Корончатый галл Строение Ti-плазмиды R - участок Размер: 70% плазмиды Содержит гены 3 групп
VIR - участок Размер: 20% плазмиды Содержит 7 генов, контролирующие переход участка плазмиды в клетку растений и встраивание его в геном Т — участок (Т-ДНК) Размер: 10% плазмиды Содержит 7 генов, контролирущие синтез опинов и образование опухоли Переносится в клетку растений Пограничные последовательности Размер: 25 п.н. Выделяют правую и левую пограничные последовательности Отвечают непосредственно за переход Т-ДНК в клетку растений Недостатки Ti-плазмиды в качестве вектора Являются патогенными Имеют большой размер Не содержат уникальные сайты рестрикции Плазмида pMON200 Структура pMON200 1) левая часть Ti-плазмиды (1600пн) — служит для рекомбинации с Ti-плазмидой 2)часть плазмиды рВr (1600пн) — содержит точку ori и гены перехода плазмиды из кишечной палочки в агробактерии 3)правая пограничная последовательность(25 пн) — отвечает за внедрение чужеродного гена в клетку растений 4)правая часть Ti-плазмиды (2200 пн) — содержит ген нопалина 5)транспозон Tn7 (2700пн) — содержит гены устойчивости к антибиотикам спектиномицин и стрептомицин 6)фрагмент КМ (2000пн) — содержит ген устойчивости к антибиотику канамицину 7)синтетический полилинкер (60пн) — содержит 7 сайтов для разных рестриктаз Пернос генов при помощи pMON200 1.Выделяют ген и встраивают в плазмиду 2.Плазмиды добавляют в питательную среду, где культивируется кишечная палочка 3.Плазмиды проникают в бактерии 4.Кишечные палочки переносят в питательную среду, где культивируется агробактерия 5.Плазмида из кишечной палочки переходит в агробактерии 6.Плазмида pMON200 сливается с Ti-плазмидой (коинтегративный вектор) 7.Заражают агробактерией клетки растений 8.Т-ДНК, содержащая чужеродный ген переходит в клетку растений и встраивается в молекулу ДНК растения 3.Вирусные векторы В качестве вектора используются вирусы растений, содержащие ДНК (ДНК-вирусы) В основном применяют вирус мозаики цветной капусты (ВМЦК) ВМЦК содержит белковую капсулу, внутри которой находится кольцевая двухцепочечная ДНК (8тпн) ДНК содержит 8 генов, отвечающие за внедрения вируса в растения, репликацию, синтез и сборку белковой капсулы Для переноса генов созданы вирусные штаммы, не вызывающие болезнь Преимущества вирусных векторов 1)небольшой размер 2)вектор легко проникает во все клетки растений 3)большое количество копий в клетке ( до 50 тыс.) 4)содержит сильный промотор 35S-РНК 4.Прямой перенос генов Прямой перенос — непосредственный перенос генов без участия специальных молекул ДНК Способы прямого переноса 1)микроинъекция 2)химическая трансформация 3)электропорация 4)упаковка в липосомы 5)биобаллистическая трансформация Микроинъекция С помощью микропипетки вводят в клетку или в ядро раствор гена Химическая трансформация В культуру клеток растений добавляется полиэтиленгликоль ПЭГ увеличивает проницаемость клеточных мембран Гены сами по себе проникают в клетки Электропорация Через культуру клеток пропускают электрический ток Электрический ток увеличивает проницаемость клеточных мембран Гены сами по себе проникают в клетки Упаковка в липосомы Готовят водную эмульсию фосфолипидов Добавляют раствор гена Обрабатывают ультразвуком или встряхивают Образуются липосомы (внутри их находится ген) Липосомы добавляют в культуру клеток Липосомы сами проникают в клетки растений Биобаллистическая трансформация На металлические шарики (0,6-1,2 мкм) напыляется раствор гена Шарики помещают в вакуумные пушки Под пушки ставят чашки Петри с культурой клеток растений Выстреливают шариками клетки растений Вместе с шариками ген попадает в клетки растений |