ГБОУ ВПО. Составление генетических карт хромосом животных и человека
 Скачать 76.5 Kb.
|
|
ГБОУ ВПО «Тверской государственный медицинский университет» Кафедра биологии Тема реферата «Составление генетических карт хромосом животных и человека» Выполнила студентка стоматологического факультета 106 группы Козлова Н.С. Преподаватель Павлова Н.В. Тверь, 2015 Содержание:
Введение. Генетическая карта — схема взаимного расположения структурных генов, регуляторных элементов и генетических маркеров, а также относительных расстояний между ними на хромосоме (группе сцепления). Метод построения генетических карт называется генетическим картированием. Генетические карты важны как в теоретических исследованиях, так и при проведении селекционной работы, т.к. позволяют сознательно подбирать пары признаков при скрещиваниях, а также предсказывать особенности наследования и проявления различных признаков у изучаемых объектов. Имея генетические карты хромосом, можно по наследованию «сигнального» гена, тесно сцепленного с изучаемым, контролировать передачу потомству генов, обусловливающих развитие трудно анализируемых признаков. Например, ген, определяющий эндосперм у кукурузы и находящийся в 9-й хромосоме, сцеплен с геном, определяющим пониженную жизнеспособность растения. История генетического картирования. Впервые на возможность построения генетических карт хромосом экспериментально показали в 1913-1915 гг. Т. Морган, А. Стёртевант и другие сотрудники Моргана, основываясь на явлениях сцепления генов и кроссинговера. С тех пор генетическое расстояние принято измерять в сантиморганах (или сантиморганидах, сокращённо – сМ), при этом 1 сМ соответствует частоте кроссинговера в 1%. Первым организмом, для которого была получена генетическая карта, стала чернобрюхая дрозофила (Drosophila melanogaster). В дальнейшем генетическое картирование стали осуществлять для других видов. Так, первой птицей и первым домашним животным, для которых была построена генетическая карта, стала курица. Приоритет в построении первой генетической карты курицы и её опубликовании в 1930 году принадлежит советским русским учёным А. С. Серебровскому и С. Г. Петрову. Общий принцип построения генетических карт хромосом. Генетические карты составляют для каждой пары гомологичных хромосом. Каждой паре присваивается номер (I, II, III, IV и т.д.), группы сцепления нумеруются в порядке их обнаружения. Кроме номера в каждой из групп сцепления указывают полное или сокращённое название генов в единицах перекрёста от одного из концов хромосомы, а также место расположения центромеры. Следует отметить, что длина хромосомы не обязательно является показателем её генетической активности. Для генетических карт применяется термин «локус» для обозначения места гена в хромосоме или на её карте. При составлении генетических карт человека было показано, что перекрёст между двумя генами происходит в 1% случаев, если расстояние между ними в молекуле ДНК составляет примерно миллион нуклеотидов. Методы генетического картирования. Если необходимо выяснить расположение определенного гена, вызывающего заболевание, которое выражается определенными фенотипическими признаками. Сначала обследуют несколько семей, представленных несколькими поколениями, члены которых страдают этим заболеванием, чтобы узнать, с какими другими генетическими признаками связана эта болезнь. Гены любых признаков, имеющих тенденцию наследоваться вместе с предрасположенностью к болезни, с большой долей вероятности могут быть локализованы на одной хромосоме рядом с генами, вызывающими болезнь. Их выбирают в качестве маркеров для искомого гена. Определив несколько маркеров с известным расположением на хромосоме, можно с большой точностью (до нескольких миллионов п.о.) установить расположение гена, вызывающего болезнь. Затем исследования фокусируются на части генома, несущей указанный ген, и поисках гена, который имеет различную последовательность оснований у здоровых и больных людей, или гена, функции которого могут быть связаны с болезнью. Именно так были идентифицированы гены, связанные с фиброзом мочевого пузыря и болезнью Гантингтона. Однако путь этот долог и трудоемок. Поэтому некоторая группа методов построения генетических карт хромосом основывается на изучении частоты рекомбинации между генами группы сцепления, что позволяет определить расстояние между ними. В группе выделяют два метода. Для эукариот, имеющих половой процесс, строят мейотические генетические карты хромосом, на которых указывается расстояние между локусами, определённое по частоте рекомбинации, происходящей в процессе обмена генетическим материалом (кроссинговера) в мейозе. Единицей этого расстояния служит сантиморган (сМ). При генетическом картировании исходят из того, что частота рекомбинации между сцепленными генами прямо пропорциональна физическому расстоянию между ними в хромосоме. Саму генетическую карту хромосом строят, обобщая совокупность данных, полученных для большого числа сцепленных генов на основании картирования их по трём точкам, используя при этом правило аддитивности расстояний. По мере «насыщения» карты одному из двух крайних локусов приписывают нулевое положение, а положение остальных локусов задаётся их расстоянием от этого локуса. Именно этот метод впервые применялся в начале ХХ в. в лаборатории Колумбийского университета, возглавляемой Томасом Г. Морганом (лауреат Нобелевской премии по физиологии и медицине, 1933г.). Объектом этих классических генетических исследований были избраны плодовые мушки Drosophila melanogaster, мелкие размеры и неприхотливость которых позволяли проводить эксперименты с сотнями мух. Кроме того, они быстро размножались и оказались чрезвычайно плодовитыми - новое поколение появлялось через каждые 12 суток, и самка откладывала до 1000 яичек. Плодовые мушки имеют 4 пары хромосом, включая пару половых. Морган заметил, что если самца с белыми глазами скрестить с красноглазой самкой, то у потомства глаза будут красными; но при скрещивании потомства друг с другом «белоглазость» проявляется вновь, но только у самцов. Морган сделал вывод, что этот признак и другие «ограниченные полом» признаки, например, дальтонизм у людей, который поражает только мужчин, должны располагаться на Х-хромосоме. Это была первая мутация, связанная с определенной хромосомой. В течение нескольких последующих лет были идентифицированы более 40 мутаций у плодовых мушек, часть из которых оказались сцепленными друг с другом. Сейчас различают четыре основных вида наследования: аутосомно-доминантный, аутосомно-рецессивный (относится к 22-м парам неполовых хромосом), а также Х-сцепленный доминантный и Х-сцепленный рецессивный. Схема эксперимента Моргана с белоглазыми мушками приведена на рис. Этот эксперимент демонстрирует случай Х-сцепленного рецессивного наследования. Итак, гены сцепленных признаков расположены на одной хромосоме. Для определения сцепления генов группа Моргана скрещивала мутантов с нормальными мушками и полученное потомство снова и снова, пока не получали достаточное количество мушек с сохранением мутации на определенной хромосоме. Поскольку их расположение было известно, такие мутации служили маркерами. Затем самцов с новой мутацией скрещивали с самками, несущими эти маркерные мутации. Как уже было отмечено, белые глаза были результатом мутации на Х-хромосоме. Если новая мутация постоянно проявлялась у белоглазых мух, это означало, что и она расположена на Х-хромосоме. Однако встречались признаки, которые передавались вместе, но не всегда, например, признаки белого глаза и рудиментарного крыла. Этот эффект объясняется происходящим во время мейоза кроссинговером (обменом между генными участками хромосом). Если интересующие нас гены находятся на одной и той же хромосоме, но располагаются далеко друг от друга, в результате кроссинговера при образовании половых клеток они с большой вероятностью попадут в разные клетки. Близко расположенные гены не будут разделяться при кроссинговере. Таким образом, можно установить не только нахождение гена на определенной хромосоме, но и приблизительно определить взаимное расположение генов на ней, если учесть, как часто они проявляются в потомстве в результате скрещиваний. Пользуясь полученными результатами, сотрудники лаборатории Моргана построили первую карту Х-хромосомы плодовой мушки. Позднее были построены первые генетические карты и других 3 хромосом. По сути, они являются прототипом современных генетических карт. Следующий метод характерен тоже для эукариот. У них возможно построение митотических генетических карт хромосом на основе рекомбинации между хромосомами в митозе. В этом случае регистрируется частота рекомбинации между геном и центромерой, которая и служит нулевым локусом по отношению к локусам генов, расположенных в разных плечах хромосомы. При этом расстояние между центромерой и самым удалённым от неё геном принимается за 100%. Сравнение мейотических и митотических генетических карт хромосом одного вида организмов выявляет одинаковое взаимное расположение одноимённых генов на обеих картах, хотя относительные расстояния между ними часто не совпадают из-за различий в механизмах рекомбинации и из-за разных правил построения карт. В последние годы разработан новый метод картирования генов человека. Он уже помог заполнить много белых пятен. У генетиков появилась возможность, которую они не принимали в расчет,— возможность экспериментировать. В 1960 году французские ученые Ж. Барски, С. Сорьель и Ф. Корнферт сумели слить две клетки из культуры тканей мыши. Гибридная клетка оказалась вдвое крупнее и имела число хромосом, равное сумме хромосомных наборов исходных клеток. С тех пор клеточные гибриды стали получать во многих лабораториях мира. В 1965 году метод был усовершенствован и открылась возможность сливать мышиные клетки не только с мышиными, но и с клетками других млекопитающих. А ещё через два года американские исследователи показали, что можно таким способом гибридизировать клетки человека и мыши. Для этого используются обычно выращиваемые в питательной среде клетки удаленных злокачественных опухолей. Они быстро растут и менее капризны, чем здоровые. Сейчас получены гибриды клеток: «человек — мышь», «человек — крыса», «крыса — мышь» и «человек — человек». У таких межвидовых гибридных клеток обнаружилось интересное свойство, которое и позволило использовать их для генетического картирования. Когда они делятся (а затем делится и их потомство), хромосомы одного из родительских видов постепенно теряются — предсказать заранее, какого именно, нельзя. Например, гибриды «человек — мышь» всегда теряют человеческие хромосомы, а «человек — крыса» — крысиные. Эту постепенную потерю хромосом можно использовать для того, чтобы проследить, какие белки перестают синтезироваться в гибридных клетках при потере той или иной хромосомы. Современные тонкие методы анализа (например, хроматография, электрофорез) позволяют проанализировать клетки и сравнить, какие белки в них вырабатывались сначала и каких стало не хватать после первого деления, после второго и так далее. Одновременно изучаются хромосомные наборы поделившихся клеток, и ведется учет потерянных хромосом. Предположим, из клетки исчезает фермент тимидинкиназа. Анализ хромосом показал, что потерялась 17-я хромосома человека. Вывод: в ней и находится ген, управляющий синтезом тимидинкиназы. Так обнаружено местонахождение генов синтеза ферментов лактикодегидрогеназы (11-я хромосома), пептидазы С (1-я хромосома). Подтверждено и то, что было известно ранее,— что ген глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы находится в хромосоме X. Удается выводить культуры клеток с определенными транслокациями (напомним, что транслокация — перенос кусочка хромосомы в другую). Они интересны тем, что по ним можно установить не только в какой хромосоме находится тот или иной ген, но и в каком именно участке этой хромосомы он локализован. При потере хромосомы, присвоившей чужой кусочек с тем или иным геном, сразу становится ясно, какой именно ген она унесла с собой (разумеется, если собственные ее гены уже зарегистрированы). Искусственно получая клетки с разными транслокациями, можно «выбрасывать» поочередно отдельные кусочки хромосом и таким образом точно локализовать отдельные гены. Еще одним новым приемом генетического картирования стала молекулярная гибридизация. Так, одна из групп исследователей получила в чистом виде рибонуклеиновую кислоту, определяющую структуру гемоглобина в красных клетках крови. При обработке препарата хромосом человека раствором глобиновой РНК в определенных условиях образуются гибридные молекулы данной РНК с генами гемоглобина в хромосомах. Применяя меченую РНК, можно узнать, на какой именно хромосоме находятся гены, определяющие структуру глобина. Сегодня гораздо более сложные карты сцепления генов строятся на определении наследования специфических последовательностей ДНК. В частности, для этого используется метод, основанный на полиморфизме длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Для возникновения аллелей достаточно, чтобы два гомологичных гена отличались всего одним нуклеотидом. Если вероятность появления такой замены (мутации) больше 1 %, то говорят, что имеет место генетический полиморфизм. Замена всего одного нуклеотида может вызвать значительное изменение свойств кодируемого белка, по сравнению с нормальным. Однако множество однонуклеотидных замен не приводит к синтезу измененных генных продуктов. Более того, замены, происходящие в некодирующих областях (а в человеческом геноме они составляют около 90 %), не приводящие ни к каким изменениям, распределены по всей длине хромосомы и представляют собой полиморфные сайты, которые используются в качестве маркеров для генетического маркирования. Но сначала эти полиморфные сайты нужно обнаружить. Метод состоит в следующем. ДНК расщепляют с помощью определенной рестриктазы по специфическим местам. Если в сайте рестрикции находится однонуклеотидная замена, рестриктаза его не узнает и расщепления не происходит. В то же время она по-прежнему узнает и расщепляет интактный сайт в другой хромосоме. Таким образом, в результате обработки рестриктазой двух этих аллелей получается набор разных продуктов (фрагментов ДНК разной длины), которые затем опознаются с помощью гибридизации со специфичным зондом. Явление встречающегося в популяции измененного сайта рестрикции, приводящее к образованию специфического набора фрагментов ДНК, называется полиморфизмом длины рестрикционных фрагментов. Полиморфные сайты рестрикции образуют маркерные локусы на той хромосоме, где они присутствуют. В настоящее время идентифицированы тысячи ПДРФ-локусов, благодаря чему значительно увеличилось число аллелей, которые можно использовать для генетических исследований. Определение аллелей ПДРФ-локуса, присутствующих на хромосомах данного индивидуума, называется генотипированием (ДНК-типированием). Наследование ПДРФ-локусов происходит в соответствии с законами Менделя и можно проследить их передачу в пределах родословной. Используя сцепление гена того или иного заболевания с маркерным локусом, можно определить хромосомную локализацию этого гена. С их помощью были изолированы гены таких наследственных заболеваний, как миодистрофия Дюшена и муковисцидоз. Другим типом полиморфных локусов являются так называемые короткие тандемные повторы (STR, от англ. short tandem repeats). Дело в том, что по геному человека равномерно распределены примерно 100 000 блоков динуклеотидных повторов, содержащих до 40 CA/GT-элементов. Любой такой блок, локализованный в определенном участке хромосомы, передается из поколения в поколение с сохранением числа повторяющихся элементов. В геноме встречаются также повторы (AT)n, (ATG)n, (ATCG)n. Чтобы идентифицировать полиморфные STR-локусы, проводят скрининг геномной библиотеки человека, содержащий вставки небольшого размера, используя подходящий олигонуклеотидый зонд. Для (СА)n-повторов обычно используют зонд (CA)15. Каждую позитивную вставку секвенируют, чтобы установить длину повтора и нуклеотидные последовательности фланкирующих его участков. Чтобы определить, являются ли фланкирующие последовательности однокопийными, проводят гибридизацию с комплементарными им зондами, и если обнаруживается, что эти последовательности встречаются в геноме один раз, то синтезируют пару комплементарных им праймеров и осуществляют амлификацию СА-повторов. Далее, используя эту пару праймеров, проводят ПЦР-тестирование ДНК, полученных от большого числа индивидуумов. Длина ПЦР-продуктов определяется с помощью полиакриламидного гель-электрофореза. Если длина амплифицированного таким образом сегмента одинакова для всех исследуемых образцов ДНК, значит повтор не полиморфен и наоборот, если образуются ПЦР-продукты разной длины, это указывает на полиморфизм по данному STR. Различающиеся по длине повторы данного локуса представляют собой аллели, которые встречаются с частотой 20 % и более. Использование STRP-локусов для картирования геномов, по сравнению с ПДРФ-локусами, имеет ряд преимуществ: 1) для их идентификации нужна информация о нуклеотидной последовательности только пары праймеров, которая может храниться в компьютерной базе данных; 2) эти локусы равномерно распределены в геноме; 3) их частоты очень высоки, что обеспечивает высокую гетерозиготность; 4) они без труда идентифицируются после ПЦР-амплификации. Физическая карта целой хромосомы или ее области дает непосредственное представление о расположении генов в ДНК, что облегчает их идентификацию и характеристику. Существующие в настоящее время, после завершения секвенирования генома человека, геномные карты совмещают черты обоих типов карт. Созданы электронные сайты, где специалисты могут получить информацию о содержании различных хромосомных карт, включая их полное графическое изображение, о методах исследования генома и программном обеспечении. Сравнение последовательностей клинического штамма CDC1551 и лабораторного H37Rv позволило выявить мутации, ответственные за патогенность клинического образца, что в свою очередь позволяет улучшить метод диагностирования, понять механизм возникновения заболевания и предложить соответствующую эффективную терапию. Заключение. Генетическое картирование позволяет выявить неслучайное распределение генов по разным хромосомам и в пределах отдельных хромосом. Сравнение генетических карт хромосом разных видов указывает на степень генетического родства организмов и пути эволюционных преобразований генетического материала. Сведения о сцеплении разных генов, представляющих интерес для селекционной работы, дают возможность планировать работу по получению организмов с определёнными сочетаниями признаков. У человека генетические карты хромосом имеют особую ценность при медико-генетическом консультировании. Составление подробной карты наследственности поможет вначале предсказывать наследственные болезни еще до рождения ребенка, а позже и проводить операции на генетическом аппарате, заменять его дефектную деталь новой, взятой из нормальной клетки или синтезированной в лаборатории (работы по синтезу генов успешно ведутся). Список используемой литературы: Захаров И. А. Генетические карты высших организмов. http://medbe.ru/materials/problemy-i-metody biotekhnologii/postroenie-geneticheskikh-kart-khromosom/ http://clinicall.ru/istoriya-mediciny/xromosom http://medic-dok.ru/article/heredity/44-mapping-of-chromosomes.html http://studopedia.org/5-105334.html |