Лекции гистология. Специальные методы исследования в гистологии Методы исследования соединительной ткани
 Скачать 170.45 Kb.
|
|
Специальные методы исследования в гистологии Методы исследования соединительной ткани. К специальным методам исследования соединительной ткани относят: окраски коллагеновых и эластических волокон. Из большого числа методов, предложенных для окраски коллагеновых волокон, наиболее распространены: способ Ван-Гизон, оригинальный метод Маллори, азокарминовая модификация его по Гейденгайну и метод Массона. Для достижения наилучших результатов при работе по указанным методам более всего показана фиксация кусочков в хромо-сулемовых жидкостях (жидкость Ценкера и ценкер-формол по Хелли или Максимову). Можно пользоваться также формалином. Впрочем, формалин для оригинального метода Маллори по сравнению с другими фиксаторами менее удовлетворителен и потому после него желательно дополнительное хромирование срезов с последующим промыванием в водопроводной воде. Для окраски при всех вышеуказанных методах пригодны любые срезы, но лучше – парафиновые. Срезы чем тоньше, тем лучше. Оригинальный способ Маллори. 1. Срезы помещают в профильтрованный литиевый кармин на 5 – 10 мин. И переносят в 1% солянокислый спирт на 5 – 10 мин. 2. Промывают в дистиллированной воде. 3. Окрашивают в 0,1% водном растворе кислого фуксина 2 – 3 минуты. 4. Быстро споласкивают в воде. 5. Переносят в 1% водный раствор фосфорно-молибденовой кислоты на 2 – 5 минут. 6. Быстро споласкивают в воде. 7. Окрашивают в свежепрофильтрованном красящем растворе следующего состава: анилиновый синий – 0,5 г; оранж G – 2,0 г; щавелевая кислота – 2,0 г; дистиллированная вода – 100,0 мл. Эту смесь нагревают до кипения, охлаждают и фильтруют. Продолжительность окрашивания 1-2 минуты. 8. Промывают в воде 1 минуту. 9. Дифференцируют в 96% спирте в течение нескольких минут, контролируя под микроскопом, пока отчетливо выступят волокнистые структуры (коллагеновые волокна). 10. Проводят через абсолютный спирт, просветляют в ксилоле и заключают в полистирол. Результат окраски: коллагеновые волокна – темно-синие; ядра, эритроциты и эластические волокна – красные; амилоид, гиалин и слизь – синие; мышечная ткань – оранжевая; невроглия и ганглиозные клетки – красновато-фиолетовые. Азокарминовый метод Гейденгайна. Азокарминовый метод Гейденгайна является лучшей модификацией метода Маллори. Срезы окрашивают в азокармине, затем дифференцируют в анилиновом спирте (1 мл анилинового масла на 1 л 96% спирта), протравливают в 5% водном растворе фосфорно-вольфрамовой кислоты и окрашивают в смеси анилинового синего с оранжем. Результат окраски: коллагеновые и ретикулярные волокна – синие; мышечная ткань – оранжевая или красная; эритроциты и ядра клеток – красные; слизь – синяя; невроглия – красноватая. Способ Массона. При методе Массона срезы окрашивают железным гематоксилином Вейгерта, дифференцируют солянокислым спиртом и окрашивают в водном растворе фуксина с уксусной кислотой, обесцвечивают в 1% фосфорно-молибденовой кислоте и докрашивают раствором анилинового синего. Результат окраски: ядра клеток – черные или синие; цитоплазма – розовая или красная; коллагеновые и ретикулярные волокна – темно-синие; фибрин и эритроциты – красные; волокна глии – розовые. Окраску эластических волокон проводят: резорцин-фуксином Вейгерта; фукселином по Харту; орсеином по Унна – Тенцеру. Окраска эластических волокон удается на всех срезах (целлоидиновых, парафиновых и замороженных), причем лучше всего из объектов, фиксированных в абсолютном спирте. Хорошо получается и после формалиновой фиксации, но не слишком старой. Окраска резорцин-фуксином Вейгерта. 1. Срезы окрашивают в литиевом кармине 10 – 15 минут. 2. Минуя воду, переносят в 1% солянокислый спирт (70%) на 5 – 15 минут. 3. Споласкивают срезы в 70% спирте. 4. Помещают в профильтрованный раствор фукселина на 20 – 30 минут. 5. Промывают в 70% спирте 1 – 2 мин. 6. Дифференцируют в 1% солянокислом спирте под контролем микроскопа, пока выступит отчетливо эластическая сеть, на что требуется около 3 – 5 минут. 7. Спирты, ксилол, полистирол. Результат окрашивания: ядра клеток – красные; эластические волокна – темно-синие. Окраска фукселином по Харту. При окраске по Харту используют не чистый фукселин, а 5% раствор его на 1% солянокислом спирте 70% – жидкость Харта. Срезы окрашивают в ней 18 – 24 часа. Результат окрашивания тот же, что и при окраске резорцин-фуксином Вейгерта. Окраска орсеином по Унна-Тенцеру. При окраске орсеином по Унна-Тенцеру используют красящую смесь следующего состава: орсеин – 1 г; крепкая соляная кислота – 1 мл; спирт 96% – 100 мл. Сначала срезы окрашивают литиевым кармином Орта 3 – 15 мин., а затем переносят в красящий раствор орсеина. Результат окрашивания: ядра клеток – красные; эластические волокна – буро-красного цвета. Изготовление препаратов для выявления аргирофильного каркаса. Фиксация материала в 15—20% растворе формалина. После фиксации — промывание кусочков в проточной воде 24—48 часов, а затем несколько часов в дистиллированной. В дальнейшем — заключение в какую-либо среду (парафин, целлоидин, желатину) или резание на замораживающем микротоме. Лучшие результаты дают срезы замороженные, в том числе и желатиновые. Срезы собирают в дистиллированную воду. Серебрение ретикулярных волокон можно производить двояко: по способу Бильшовского и Фута. Второй способ представляет собой модификацию первого и отличается от него лишь тем, что в нем импрегнации серебром предшествует обработка срезов марганцевокислым калием и щавелевой кислотой; в остальном оба способа почти одинаковы. В результате импрегнации по одному и другому способу ретикулярные (аргирофильные) волокна окрашиваются в черный цвет; коллагеновые волокна соединительной ткани – фиолетовые, коричневые или серовато-черные. Общие замечания при импреганции серебром. 1. Исходные реактивы должны быть химически чистыми (кристаллическое азотнокислое серебро – совершенно белое). 2. Вся стеклянная посуда, которая используется при импрегнации – безукоризненно чистой. 3. Для приготовления растворов серебра следует пользоваться свежей дистиллированной водой. 4. Работают только со стеклянными иголками. 5. При перекладывании срезов в растворы, содержащие формалин или соединения серебра, стеклянные иголки надо менять с таким расчетом, чтобы иголка использовалась только для однократного переноса срезов из одной среды в другую и не более. 6. Одновременно допускается серебрить небольшое количество срезов. 7. Работу с ненаклеенными срезами ведут в чашечках емкостью около 30 – 50 мл, а с наклеенными в стаканчиках. Способ Фута. Методика импрегнации. 1. Срезы собирают в дистиллированную воду и отсюда переносят в 0,25% водный раствор марганцевокислого калия на 5 – 10 минут. 2. Споласкивают в водопроводной воде. 3. Помещают в 5% раствор щавелевой кислоты на 15 – 30 минут, до побеления срезов. 4. Основательно промывают в большом количестве дистиллированной воды 20 – 30 минут. 5. Перекладывают в 2% раствор азотнокислого серебра на 48 часов (держат в темноте или заворачивают посуду с раствором в черную бумагу). 6. Быстро (около 3 – 5 секунд) прополаскивают (по одному срезу) в дистиллированной воде. 7. Переносят в свежеприготовленный и профильтрованный раствор аммиачного серебра на 15 – 30 минут. Срезы в этом растворе принимают коричневатый тон. 8. Споласкивают срезы (по одному) в дистиллированной воде, примерно, 5 – 15 секунд. 9. Помещают в 5% раствор формалина на 15 – 30 минут. 10. Основательно промывают в водопроводной воде. 11. Перекладывают в 0,5 – 1% раствор хлорного золота на 5 – 10 минут. 12. Промывают в водопроводной воде (10 – 15 минут). 13. Обрабатывают в 5% водном растворе гипосульфита 2 – 3 минуты. Контролируют под микроскопом (споласкивая каждый раз в воде). 14. Тщательно промывают в водопроводной воде (от нескольких часов и до суток). 15. Ядра клеток докрашивают (по желанию) квасцовым кармином или гематоксилином, в последнем случае можно дифференцировать 1% солянокислым спиртом с подсиниванием в подщелоченной (нашатырным спиртом) воде. 16. Проводят через спирты, карбол-ксилол, ксилол и заключают в полистирол. Методы исследования нервной ткани. Для исследования нервной ткани используется окраска по Нисслю, импрегнация серебром (существует много модификаций). Окраска по Нисслю Окраска по Нисслю предложена для хроматофильного вещества и ядер нервных клеток. Для исследования берут небольшие кусочки, не толще 0,3—0,4 см. Фиксируют в 96% спирте. Соотношение объема фиксируемых кусочков к количеству спирта должно быть не менее, чем 1: 10. Помимо чистого 96% спирта очень хорошие результаты даёт фиксация в смеси спирта с формалином (10% раствор формалина на 96% спирте). Допускается фиксация и в 10— 15% формалине (1—2 дня). В дальнейшем промывание в проточной воде (до 24 часов) и обезжиривание и обезвоживание в 96° спирте несколько недель. Для окраски пригодны целлоидиновые и парафиновые срезы, и чем тоньше, тем лучше. Наиболее употребительные красители: толуидиновый синий, тионин и крезиловый фиолетовый (крезилвиолет) в водных растворах (на дистиллированной воде). Методика окраски. 1. Окрашивают при нагревании над пламенем спиртовки. 2. Споласкивают в водопроводной воде 1—2 минуты. 3. Дифференцируют чистым 96% или специальной дифференцирующей смесью (анилиновый спирт). Срезы в это время обесцвечиваются и становятся бледно-синими. Дифференцируют под контролем микроскопа, пока отчетливо не выступят детали клеток (ядра, зернистость). 4. Заканчивая обработку спиртом, срез отжимают фильтровальной бумагой, сложенной в 3—4 слоя, и просветляют в кайепутовом масле, а при отсутствии такового в эвкалиптовом масле или простом скипидаре. 5. После обработки срез просушивают фильтровальной бумагой и просветляют ксилолом, заключают в полистирол. Препараты, окрашенные по Нисслю, постепенно выцветают, поэтому их лучше хранить в темноте. Значительно перекрашенные готовые препараты можно обесцвечивать на лампах дневного света. Результат окрашивания: тигроидная зернистость – интенсивно синяя, лиловая или фиолетовая; ядра ганглиозных клеток – светлые или слегка синеватые, ядрышки их темно-синие. Импрегнация по методу Бильшовского – Грос – Лаврентьева. Используется для окраски периферических нервов и нервных окончаний. Методика окраски. 1. Объекты толщиной до 0,3 см фиксируют в смеси АФА в течение 1 часа. Состав жидкости АФА: неразведенпый нейтральный формалин, спирт 96% и 1% раствор мышьяковистой кислоты. Всех составных частей смеси берут поровну. Смесь готовят по мере надобности. 2. Без промывки после АФА кусочки дополнительно фиксируют в 20% растворе нейтрального формалина — от нескольких дней и до 3 —4 недель. 3. Готовят срезы методом замораживания, толщина их определяется задачами исследования и колеблется довольно широко (от 20 до 100 мкм, а в среднем 30—50 мкм). 4. Срезы с ножа замораживающего микротома переносят в ту же воду, в которой промывался кусочек. (Количество промывной воды должно составлять, примерно, 150—200 мл на 1 небольшой кусочек). 5. После короткого промывания в дистиллированной воде (1—2 мин.) срезы помещают в 20% раствор азотнокислого серебра на 5—10 минут (можно держать до 30 мин.). 6. Из азотнокислого серебра срезы переносят, минуя воду, в 20% формалин, приготовленный на водопроводной воде и разлитый в 4—5 небольших чашках (или баночках 7. Из последней порции формалина срезы поступают в опалесцирующий раствор аммиачного серебра, налитый на часовое стекло таких размеров, чтобы оно свободно помещалось на столике микроскопа; примерно, емкостью на 5— 10 мл. Перед тем, как срезы переносить в аммиачный раствор серебра, к нему добавляют еще 25% нашатырного спирта в количестве от 1 до 15 капель. 8. Когда микроскопическое исследование покажет достаточно резкую импрегнацию нервных элементов, срезы переносят в разведенный нашатырный спирт (1 часть 25% нашатырного спирта и 2 части дистиллированной воды) на 10— 15 минут. 9. Тщательно промывают в нескольких порциях дистиллированной воды в течение нескольких часов (можно оставлять на ночь). 10. Переносят в слабый раствор хлорного золота (из расчета 1—2 капли 1% раствора хлорного золота на 2—3 мл дистиллированной воды) на 30 мин. — 1 час и дольше, до приобретения срезами серо-стального или фиолетового тона. 11. Минуя воду, помещают в 5% раствор гипосульфита на 5— 10 минут. 12. Тщательно промывают (несколько часов) в дистиллированной воде, многократно меняя ее. 13. Промытые срезы, подкрашивают любыми красителями. 14. Обезвоживают, просветляют и заключают в полистирол. Результат окрашивания: элементы нервной системы выявляются в виде черных образований на общем светло-коричневом или серо-стальном фоне. Исследования костной ткани. После декальцинации костную ткань можно резать на замораживающем микротоме, а также заливать в целлоидин или целлоидин-парафин обычным путем, заливка в парафин не рекомендуется, т. к. он плохо пропитывает декальцинированную кость. В настоящее время имеются специальные санные микротомы, которые позволяют получать срезы из кости толщиной 20-50 мкм, без предварительной декальцинации. Наиболее распространенный метод окрашивания декальцинированной костной ткани по Шморлю. Методика окраски 1. Срезы промывают дистиллированной водой 10 мин. 2. Окрашивают в рабочем растворе тионина 5—10 мин и более. 3. Промывают дистиллированной водой. 4. Обрабатывают насыщенным водным раствором пикриновой кислоты 30 – 60 с. 5. Промывают дистиллированной водой. 6. Дифференцируют в 70 % этиловом спирте до тех пор, пока перестанут образовываться голубовато-синие скопления красителя 5—10 мин или более. 7. Быстро обезвоживают, просветляют в ксилоле и заключают. Результат: лакуны и канальцы темные, коричнево-черные; костный матрикс желтый или коричнево-желтый, костные клетки и их отростки красные. Окраска бактерий в срезах. Для окраски бактерий лучше всего пользоваться парафиновыми срезами, менее удобны замороженные и целлоидиновые. Парафиновые срезы перед окраской бактерий должны быть освобождены от парафина по общим правилам, т. е. обработаны ксилолом и спиртом. Что касается целлоидиновых срезов, то целлоидин удаляется не всегда и лишь в тех случаях, когда после пробных препаратов устанавливается сильное закрашивание его, препятствующее исследованию. Целлоидин проще всего удалять в смеси спирта с эфиром. Срезы приклеивают либо до удаления из них целлоидина, либо после, как замороженные. Лучший фиксатор для бактерий – спирт (абсолютный или 96%); хороши растворы сулемы, несколько хуже – формалин. При желании получить замороженные срезы из объектов, фиксированных в спирте, кусочки предварительно промывают в проточной воде в течение нескольких часов (пока они упадут на дно банки). Окраска микроорганизмов в срезах несколько отличается от таковой в мазках. В срезах обычно ограничиваются метиленовым синим Лёфлера или карбол-тионином Николя – как универсальными красками, окраской по Граму в модификации Вейгерта и карбол-фуксином Циля для кислотоустойчивых бактерий. Срезы для окраски бактерий должны быть максимально тонкими. Нужно обращать сугубое внимание на качество фильтровальной бумаги. Плотная бумага мало пригодна для фильтрования красящих растворов, ибо она задерживает много красителя и благодаря этому может повести к неудовлетворительной окраске бактерий. Для лучшей сохранности препаратов рекомендуется пользоваться хорошим ксилолом (не содержащим кислоты) и заключать препараты в нейтральный бальзам. Учитывая необходимость исследования с иммерсионным объективом, следует подбирать тонкие покровные стекла. |