лекция 3-4. низкая концентрация ксенобиотика для индукции ферментов ме таболизма
 Скачать 0.66 Mb.
|
|
13 Условия окружающей среды играют важную роль в процессе де- градации ксенобиотиков микроорганизмами-деструкторами. Биодо- ступность и активность биодеградации соединения ограничивают следующие факторы: 1. Неоптимальное значение или отсутствие какого-либо фактора, необходимого для роста микроорганизмов-деструкторов: • низкая концентрация ксенобиотика для индукции ферментов ме- таболизма; • физическая недоступность загрязнения из-за его адсорбции, свя- зывания, механического включения, низкой растворимости; • недоступность акцепторов электронов или косубстратов; • дефицит элементов питания; • неоптимальные температура, влажность, рН, Eh и др. 2. Инактивация необходимых внеклеточных ферментов. 3. Токсическое действие окружающей среды, обусловленное ток- сичностью ксенобиотика или органическими ингибиторами, генери- руемыми другими биологическими системами, а также токсинами микроорганизмов. 1.2. Микроорганизмы-деструкторы Основная роль в биодеструкции органических загрязнителей принадлежит микроорганизмам, особенно бактериям, синтезиру- ющим разнообразные ферментные системы. К микроорганизмам- деструкторам относят значительную часть от всего микробиоцено- за (рис. 2), доля деструкторов еще больше в искусственно созданных экосистемах, направленных на очищение сред — аэротенках, метан- тенках, полях фильтрации и др. В настоящее время известно большое количество видов микроор- ганизмов, принадлежащих к эубактериям, дрожжам, грибам, способ- ных к утилизации нормальных и разветвленных, насыщенных и не- насыщенных углеводородов, циклических углеводородов, ПАУ, ПАВ, пестицидов, галогенорганических соединений. Микроорганизмы — деструкторы органических загрязнителей известны среди предста- вителей родов бактерий Pseudomonas, Rhodococcus, Azotobacter, Bacillus (рис. 3), Arthrobacter, Acinetobacter, Zooglea, Nocardia, дрож- жей Yarrowia, Candida, Torulopsis, Сryptococcus, Rhodotorula, Pichia, грибов Aspergillus, Cladosporium, Verticillium, Alternaria, Fusarium. 14 Рис. 2. Микробное разнообразие почвенной экосистемы, включающее биодеструкторы (агаризованная питательная среда) Рис. 3. Обитатели водных и почвенных экосистем — представители спорообразующих бактерий рода Bacillus: А — колония на поверхности агаризованной среды; Б – Г — клетки и споры (фазово-контрастная микроскопия) А В Б Г 15 Рис. 4. Альгобактериальное сообщество микробного мата (слева) и входящие в его состав бактерии (справа) Смешанные популяции, как правило, быстрее и полнее разруша- ют многие синтетические соединения. Это характерно для ситуации, когда отдельный вид организмов трансформирует одно соединение в другое, но не имеет ферментативной системы для его дальнейшей де- Известны деструкторы среди цианобактерий: Agmenellum, Anabaena, Oscillatoria, Microcoleus, Phormidium, Nostoc. Но циано- бактерии не способны к полной минерализации загрязнителей, их роль заключается в синтезе полисахаридов, способствующих обра- зованию эмульсии ПАУ, других нефтепродуктов и загрязнителей в воде, что является первым шагом к биодеструкции. Продуцируемые цианобактериями внеклеточные полисахариды привлекают бактери- альные клетки, формирующие разнообразную сопутствующую ми- кробиоту. Ассоциативные с водорослями бактерии, цианобактерии входят в альгобактериальное сообщество, функционирующее как над- организменная система, что способствует более эффективной биоде- градации ксенобиотиков (рис. 4). 16 градации. Этой споcобностью обладает другой организм, в результа- те соединение разлагается полностью. Способность к биодеструкции в биоценозе зависит от состава и разнообразия фито-, микроценоза, скорости роста организмов, обме- на питательными веществами и генетическим материалом. Накапли- ваемые метаболиты могут быть токсичны для одного компонента со- общества и усваиваться другими микроорганизмами, что ускоряет в совокупности процесс разложения (феномен детоксификации). Самоочищение природных экосистем от загрязнителей с помо- щью микроорганизмов подтолкнуло к их выделению и дальнейшему усовершенствованию с целью направленного использования для био- деструкции конкретных ксенобиотиков. Разработка таких биологи- ческих способов очистки на основе штаммов-деструкторов способна существенно интенсифицировать процессы восстановления природ- ной среды. Эффективность селекции микроорганизмов-деструкторов повышается, если придерживаться следующих принципов: • выделять монокультуры или сообщества микроорганизмов (изо- ляты) из сред, загрязненных теми или иными ксенобиотиками; • использовать биологический агент, изолированный из той же за- грязненной природной или техногенной среды, для очистки которой он предназначен; • выделять микроорганизмы из мест с застарелыми загрязнения- ми или с неоднократным поступлением ксенобиотиков. В этом слу- чае велика вероятность, что число организмов, деградирующих ксе- нобиотик, увеличилось под действием естественного отбора. Для вы- деления таких изолятов эффективен метод накопительных культур; • накапливать биологический материал для деградации вещества- загрязнителя лучше всего на этом же субстрате либо на его легко ути- лизируемых аналогах; • использовать уже известные штаммы-деструкторы (музейные культуры) или на базе существующих конструировать рекомбинант- ные штаммы. Существует два принципиальных подхода к биодеградации ксе- нобиотиков и восстановлению экосистем: 1. Активизация аборигенной микробиоты путем создания опти- мальных условий для ее развития. Этот вариант подходит для участ- ков с застарелыми загрязнениями, где почти всегда обитает дикая микробиота, способная трансформировать загрязнитель. Очистка в 17 этом случае происходит in situ (по месту) без внесения биопрепара- тов и зависит от условий окружающей среды и свойств загрязнителя. 2. Введение в загрязненную экосистему активных микроор- ганизмов-деструкторов в виде биопрепаратов. Такой способ необхо- дим в случае, если самоочищающая способность экосистемы угнете- на токсикантом или условия неблагоприятны (например, свежие раз- ливы нефти в северных регионах с суровым климатом). Кроме селектирования штаммов, перспективно получение реком- бинантных микроорганизмов методами генной инженерии. Способ- ность микроорганизмов разрушать ксенобиотик или другой поллю- тант зависит от наличия в клетках генов, определяющих синтез фер- ментов, участвующих в деградации соединения. Конструирование рекомбинантных штаммов — деструкторов ксенобиотиков заклю- чается в объединении нескольких генов или их блоков, ответствен- ных за первичный метаболизм соединений. Преимущество такого объединения состоит в том, что генетически модифицированные ми- кроорганизмы могут синтезировать различные ферментные систе- мы, что позволяет эффективно и быстро разрушать широкий спектр химических загрязнений. Генетическая модификация позволяет по- высить устойчивость микроорганизмов к неблагоприятным факто- рам среды, придать им новые важные для практического применения свойства. Например, внедрив гены синтеза био-ПАВ, можно расши- рить спектр биодоступных гидрофобных контаминантов. Гены бактерий, ответственные за деградацию, находятся в хромо- сомах (гены центрального метаболизма) или сосредоточены во вне- хромосомных элементах — катаболических плазмидах, плазмидах деградации (гены периферийного метаболизма). В генной инжене- рии бактериальные плазмиды используют в качестве векторов с це- лью передачи части генетического материала от хозяина (клетки до- нора) в клетки реципиента. Они представляют собой саморегулирую- щиеся кольцевые двунитевые молекулы ДНК и способны стабильно и автономно существовать в клетке в характерном для каждого типа плазмид числе копий. Саморепликация плазмиды осуществляется с помощью ферментных систем клетки-хозяина. Плазмиды относятся к подвижным элементам (векторам), т. е. способны к внутривидово- му переносу между клетками популяции, клетками различных видов и родов микроорганизмов. 18 Новые сочетания генов, получаемые в результате внутри- и меж- плазмидной рекомбинации, между плазмидой и хромосомой хозяина, могут приводить к возникновению новых комбинаций генов и рас- пространению катаболических путей деградации, кодируемых плаз- мидами (модулярная эволюция). Поскольку кольцевая хромосома бактерий содержит ограничен- ное количество генов, она обеспечивает основной метаболизм бак- терий, их развитие в благоприятных условиях. При изменении усло- вий выживание популяций бактерий обеспечивается наследствен- ными элементами в форме подвижных, легко передаваемых струк- тур, которые кодируют биосинтез ферментов, необходимых для су- ществования бактерий в изменившихся условиях обитания. Напри- мер, один из выделенных штаммов бактерии Pseudomonas оказался способным использовать более 100 видов органических соединений. Бактериальная хромосома не может содержать все гены, ответствен- ные за синтез ферментов, необходимых для деградации такого боль- шого количества соединений. Очевидно, что в этом случае метабо- лизм большинства соединений осуществляется при участии фермен- тов, кодируемых плазмидами. Плазмиды обладают изменчивой структурой и существуют в ста- бильной форме только в том случае, если этому способствуют усло- вия среды. Например, когда с определенной плазмидой связана ката- болическая функция, присутствие субстрата-ксенобиотика стабили- зирует ее структуру в процессе популяционной автоселекции. При отсутствии селективного давления (ксенобиотика) автономные плаз- миды быстро элиминируются, но стабильны после включения их в хромосому. Особенности генетического аппарата бактерий и меха- низмы горизонтального переноса генов обеспечивают необходи- мую пластичность генома и включения в метаболизм ксенобиоти- ков, адаптацию к различным соединениям и быстрое распростране- ние необходимых генов внутри популяции. Некоторые плазмидные системы хорошо изучены, например, кон- тролирующие окисление толуола, о-, м-, п-ксилолов, нафталина, 3-хлорбензоата, 2,4-дихлорфеноксиацетата. Системы биодеграда- ции таких соединений, как камфора и н-алканы, изучены недостаточ- но из-за очень больших размеров соответствующих плазмид (до 500 тыс. пар нуклеотидов). 19 В 1970 г. был создан первый бактериальный штамм, способный расщеплять большинство углеводородов нефти, который был назван «супербацилла». Для его получения использовали плазмиды, каждая из которых кодировала фермент, расщепляющий определенный класс углеводородов (рис. 5). Рис. 5. Схема создания бактериального штамма, способного разрушать камфару, октан, ксилол и нафталин [Глик, Пастернак, 2002] Штамм А, несущий плазмиду САМ (детерминирует разрушение камфары), скрещивают со штаммом В, несущим плазмиду ОСТ (раз- рушение октана), при этом образуется штамм Е, который содержит гибридную плазмиду, образовавшуюся в результате гомологичной рекомбинации между исходными плазмидами и обладающую функ- циями каждой из них. Штамм С, содержащий плазмиду XYL (разру- шение ксилола), скрещивают со штаммом D, содержащим плазмиду NAH (разрушение нафталина), и получают штамм F, который несет обе эти плазмиды. Наконец, скрещивают штаммы Е и F, в результа- те чего образуется штамм G, содержащий плазмиды САМ/ОСТ, XYL и NAH. Объединение разных метаболических путей в одном микроорга- низме с помощью конъюгации — это лишь один из способов соз- дания бактерий с новыми свойствами. Можно расширить их катабо- лические возможности, модифицируя гены, кодирующие ферменты Штамм G Плазмида САМ Плазмида САМ/ ОСТ Плазмида САМ/ ОСТ Плазмида ОСТ Плазмида XYL Плазмида XYL Плазмида XYL Плазмида NAH Плазмида NAH Плазмида NAH Штамм D Штамм C Штамм B Штамм A Штамм E Штамм F Скрещивание Скрещи- вание Рекомбинация плазмид Скрещи- вание 20 того или иного метаболического пути. Совершенствование какого- либо катаболического пути возможно с помощью технологии реком- бинантных ДНК, традиционного мутагенеза и соответствующих ме- тодов отбора. Благодаря плазмидам как объектам генной инженерии с помощью рестриктаз возможно in vitro сконструировать dе novo геном клетки, передать его в клетки реципиентов конъюгацией, трансформацией или трансдукцией и при включении в клетку большого числа плаз- мидных копий увеличить число необходимых генов. В последнее время созданы банки векторов и носителей, позволяющие конструи- ровать штаммы, способные к биодеструкции ксенобиотиков при раз- личных условиях среды и содержащие не только гены деструкции, но и, например, гены синтеза био-ПАВ или фермента люциферазы, что улучшает биодоступность ксенобиотиков и облегчает наблюдение за рекомбинантными штаммами в окружающей среде. Недостатком в конструировании микроорганизмов является не- стабильность систем «хозяин — вектор», что затрудняет интродук- цию штаммов в естественную среду. При возвращении микроорга- низма с новой катаболической функцией в исходную природную сре- ду ему приходится конкурировать с хорошо адаптированной к дан- ным условиям среды естественной микробиотой, сталкиваться с огромным разнообразием источников углерода, в том числе высоко- токсичных. В микробной утилизации поллютантов принципиальное значение имеют выживаемость и конкурентоспособность микроорганизмов- деструкторов, интродуцируемых в места загрязнения in situ. Исполь- зование катаболических генов представляется перспективным на- правлением биоремедиации, поскольку даже в том случае, если ин- тродуценты неконкурентоспособны и постепенно элиминируются, тем не менее они могут быть донорами генов биодеградации вслед- ствие конъюгационного переноса плазмид. Катаболические плаз- миды с генами, кодирующими биохимические пути микробной де- градации поллютантов, и другие мобильные генетические элемен- ты, способные повышать эффективность штаммов-деструкторов за счет приобретения ими новых катаболических способностей, явля- ются позитивным фактором, который при продуманном использова- нии может способствовать решению ряда экологических проблем. 21 ОСОБЕННОСТИ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ ОТДЕЛЬНЫХ КЛАССОВ ОРГАНИЧЕСКИХ КСЕНОБИОТИКОВ 2.1. Разложение нефти и нефтепродуктов Одни из наиболее опасных загрязнителей на Земле — нефть, не- фтепродукты и нефтесодержащие отходы, ежегодное попадание ко- торых в окружающую среду оценивается в сотни миллионов тонн. В результате интенсивного транспорта нефти к местам ее потребления, а также в условиях сурового климата, характерного для мест ее до- бычи и приводящего к быстрому износу и порывам нефтепроводов и емкостей для хранения, аварии и масштабные разливы нефти стали уже привычным явлением. Повышенные концентрации нефти и нефтепродуктов в почве и воде нарушают дыхательную активность почвы и микробное само- очищение почвенных и водных ресурсов. Изменяя соотношения между отдельными группами почвенных микроорганизмов, круп- ные нефтяные загрязнения меняют направление почвенного метабо- лизма, подавляют процессы дыхания, азотфиксации, нитрификации, биодеградации целлюлозы, приводят к накоплению трудноокисляе- мых продуктов. Удаление нефти и ее составляющих из контаминированных зон определяется совокупностью абиотических и биотических процес- сов. Естественные процессы самоочищения и восстановления почв, загрязненных нефтью, протекают достаточно медленно, особенно при высоких уровнях загрязнения. В первые недели после загрязне- ния почвы нефтью происходят в основном физические процессы ми- грации и рассеивания углеводородов в результате испарения и выще- лачивания. Скорость испарения различна и зависит от свойств сре- 2 22 ды, метеорологических условий, а также от состава нефти. Снача- ла испаряются фракции с точкой кипения ниже температуры 370 °С. Потери нефти вследствие испарения нефтяных масел и сырой неф- ти в южных регионах составляют до 40–70 %. В северной климати- ческой зоне испаряется значительно меньше нефти, в почве она мо- жет сохраняться десятки лет, и преобладает рассеивание ее циркули- рующими водами. В результате испарения нефти возрастает вязкость ее оставшейся части и замедляется скорость миграции, увеличивается количество углеводородов с длиной цепи более С 20 , ароматических и цикличе- ских углеводородов, так как испаряются в основном низкомолекуляр- ные углеводороды. В результате удаления наиболее токсичных лег- ких углеводородов уменьшается вредное действие оставшейся смеси на микроорганизмы-деструкторы, что облегчает последующую ми- кробиологическую деградацию, а также повышается доля компонен- тов, наименее летучих и растворимых, т. е. более стойких к разложе- нию. Пленка углеводородов на водной и почвенной поверхности может подвергаться химическому воздействию вследствие образования сво- бодных радикалов как результат термического или фотохимическо- го возбуждения. Этот процесс более существенен в водных средах и зонах с засушливым и жарким климатом и менее — в большинстве почв умеренного и холодного климата. В первом случае преобладают фотохимическое окисление, испарение и последующее механическое разрушение и рассеивание, в результате чего за 2–3 года происходит самоочищение контаминированных сред. Проникновение нефти в почву приводит к расширению площади и увеличению глубины загрязнения. При легком механическом со- ставе почв, например, супесчаных и суглинистых, легкие фракции нефти и нефтепродуктов могут проникать на глубину 1,5–2 м, пода- вляя биологическую активность почв. По мере удаления от источни- ка загрязнения соотношение между основными формами миграции меняется, при этом повышается доля растворенных, эмульгирован- ных, сорбированных нефтепродуктов. Через 1–4 нед после попадания нефтяных углеводородов в окру- жающую среду в благоприятных условиях для роста микрофлоры на- чинается биодеградация загрязнения. 23 Существуют два принципиальных подхода к биодеградации не- фтяных углеводородов в естественной среде: 1. Стимуляция природной нефтеокисляющей микробиоты путем создания оптимальных условий для ее развития (внесение азотно- фосфорных удобрений, аэрация и т. п.). 2. Введение в загрязненную экосистему активных углеводородо- кисляющих микроорганизмов. В настоящее время известно более 100 видов микроорганизмов, принадлежащих к 40 родам эубактерий, дрожжей, грибов, способ- ных к утилизации углеводородов. Практически все углеводороды, входящие в состав нефти, могут быть объектом микробиологическо- го воздействия, претерпевая разнообразные пути превращения. Угле- водороды в почве разлагаются в результате деятельности углеводород- окисляющих микроорганизмов, способных окислять их до СО 2 и воды или превращать в соединения, утилизируемые другими микро- организмами. По степени снижения окисляемости микроорганизмами компо- ненты нефти и нефтепродуктов располагаются в такой последова- тельности: алифатические > ароматические > смолы > асфальтены (почти не окисляются). Наиболее активно утилизируются углеводороды с прямой цепью, н-парафины с длиной цепи С 12 –С 22 . В зависимости от условий они разлагаются на 10–90 % в течение 1–2 мес при первоначальном сум- марном содержании нефтяных углеводородов 0,5–2 %. Большинство микроорганизмов не ассимилируют н-алканы, содержащие в цепоч- ке менее 9 атомов углерода. К их окислению способны бактерии ро- дов Flavobacterium, Mycobacterium, Nocardia. Низкомолекулярные н-алканы обычно угнетают развитие микробного сообщества, одна- ко вследствие летучести их действие непродолжительно; н-алканы с длиной цепи более С 20 при температуре окружающей среды пред- ставляют собой вязкие жидкости либо твердые вещества, поэтому транспорт их к клеткам затруднен. В смеси с н-алканами с меньшей длиной цепи они находятся в виде жидкости и потребляются относи- тельно легко. Более устойчивы к окислению изоалканы, циклоалканы и арома- тические углеводороды. Многие из них в виде моносубстратов не по- 24 Рис. 6. Клетки дрожжевого штамма Yarrowia lipolytica на поверхности микрокапель нефти в процессе биоэмульгации (фазово-контрастная микроскопия) требляются микроорганизмами, разлагаясь в режиме соокисления с другими более доступными углеводородами. На степень и скорость разложения углеводородов влияет агрегат- ное состояние, в котором они присутствуют в среде. Для водных сред важна растворимость углеводородов в воде, поскольку растворимые молекулы лучше транспортируются к клеткам микроорганизмов. Рас- творимость углеводородов низкая и уменьшается с увеличением их молекулярной массы. Насыщенный раствор тетрадекана (С 14 ), напри- мер, имеет концентрацию 1 · 10 –6 мг/л. На скорость окисления влия- ет также степень дисперсности углеводородов в воде. Транспорт их в клетку происходит непосредственно при контакте эмульгированной углеводородной фазы с поверхностью клеток. Дисперсность можно повысить механическим воздействием или с помощью детергентов. Многие микроорганизмы способны продуцировать ПАВ, эмульгиру- ющие углеводороды и ускоряющие их окисление. Способность микроорганизмов продуцировать внеклеточные эмульгирующие агенты является ключевой в биодеградации нефти. Сплошная пленка нефти под действием биоэмульгаторов микроорга- низмов разбивается на отдельные сферические структуры, более до- ступные для внеклеточных ферментов и транспортировки отдельных компонентов внутрь клетки (рис. 6). 25 Рис. 7. Клетки бактериального штамма Rodococcus (фазово-контрастная микроскопия) Биодеградация тяжелых фракций нефти, содержащих смолы и асфальтены, затруднена устойчивостью к воздействию ферментов и малой способностью диспергироваться в жидкой среде. Тяжелые фракции нефти содержат большое число полиароматических соеди- нений с конденсированными ядрами, из них относительно биоде- градируемы только соединения с тремя и четырьмя ароматически- ми кольцами. Время полураспада этих соединений варьирует от 3 до 2000 нед. Для почвенной среды средние скорости минерализации тя- желых фракций нефти, ила и сырых остатков варьируют между 0,02– 0,6 г углеводородов на 1 кг почвы в сутки. В подпочвенных гори- зонтах скорость разложения даже наиболее доступных фракций неф- ти составляет 0,01–0,02 г/кг в сутки, т. е. меньше, чем на поверхно- сти. За год в субтропиках биодеградируется около 40 % нефти, остав- шейся в почве после фотохимического разложения и испарения. В условиях холодного климата биодеградация нефти вследствие низ- кой активности естественных процессов может длиться десятки лет. При благоприятных условиях основной процесс биодеструкции мо- жет протекать за 3–4 нед, при этом численность углеводородокисля- Активные биоэмульгирующие комплексы способны образовы- вать бактерии Rodococcus (рис. 7), Acinetobacter, дрожжи Yarrowia lipolytica и другие микроорганизмы. 26 ющих микроорганизмов увеличивается в 100–1000 раз, изменяется и численность других гетеротрофных микроорганизмов. Заключительный и самый длительный этап в разложении нефти связан с трансформацией оставшихся высокомолекулярных соеди- нений и образованием связанных остатков. Небольшая часть компо- нентов нефти, находясь в почве, полимеризуется с образованием ас- фальтенов и полиароматических углеводородов. Эта часть устойчива к биологическому окислению. Чем более застарелое загрязнение, тем выше ее доля (от 1 до 20 %). В силу инертности новые высокомоле- кулярные соединения и связанные остатки мало опасны для окружа- ющей среды. Таким образом, в совокупности физическая и химиче- ская трансформация, биодеградация и образование связанных остат- ков приводят к устранению вредного действия нефти, попавшей в окружающую среду. Максимальное содержание нефти в среде, доступное для биоре- медиации, не превышает 5–10 % (по массе). К наиболее важным факторам, от которых зависит скорость био- деградации, относится температура. Для биодеградации углеводоро- дов оптимальная температура +30...+40 °С, однако существуют ми- кроорганизмы, способные окислять углеводороды как при более вы- соких, так и при более низких положительных температурах. Углево- дороды с большой длиной цепи утилизируются при температуре не ниже 25 °С. Оптимальное содержание влаги в почве для микроорганизмов- нефтедеструкторов 50–80 %. При меньшей влажности осмотические и матричные силы ограничивают доступность воды и, следователь- но, лимитируют их рост. Однако в переувлажненных почвах сниже- ние газового пространства затрудняет доступ кислорода. В почвах, загрязненных нефтью, водный баланс значительно нарушается из-за гидрофобности ее соединений. Окисление углеводородов микроорганизмами происходит в аэ- робных условиях. Углеводороды нефти — это полностью восстанов- ленные соединения, и первым этапом их окисления является включе- ние кислорода в их молекулу, поэтому при окислении углеводородов кислород выполняет как функцию источника питания, так и функ- цию акцептора электронов в катаболических процессах. После первичного окисления углеводородов разложение может продолжаться и в аэробных, и в аноксигенных условиях. Денитри- 27 фикаторы и сульфатредукторы, как правило, плохо окисляют исхо- дные углеводороды, а содержание сульфатов и нитратов в природных средах незначительно, поэтому кислород часто лимитирует деграда- цию углеводородов. Для поддержания аэробных условий при реме- диации почв, загрязненных нефтью, их периодически рыхлят. Дени- трификация и сульфатредукция могут играть существенную роль на стадии разложения промежуточных продуктов окисления углеводо- родов (жирных кислот, фенолов, продуктов их расщепления) и в цен- тральных зонах почвенных агрегатов. Здесь возможны процессы с восстановлением Fe 3+ и брожения. Адсорбция нефти и нефтепродуктов на поверхности почвенных частиц затрудняет их биодеструкцию вследствие образования круп- ных и плотных агломератов. В переувлажненной почве на почвен- ных частицах образуются рыхлые структурированные агрегаты, че- рез поры которых увеличивается поступление кислорода и повыша- ется скорость деградации углеводородов. Для утилизации углеводородов нефти бактериями наиболее благо- приятен нейтральный рН (от 6,5 до 8,0). Оптимальное развитие гри- бов и дрожжей происходит в кислой среде, в широком диапазоне рН развиваются смешанные популяции. Минеральных компонентов в нефтяных загрязнениях содержится мало, кроме того, природные среды, особенно в северных регионах, обеднены источниками азота и фосфора. Как правило, при загряз- нении нефтью дефицит биогенных элементов является лимитиру- ющим фактором активности микроорганизмов-нефтедеструкторов. Для биологической очистки и биоремедиации вносят минеральные компоненты в виде минеральных удобрений (азотных, фосфорных и др.). Оптимальное соотношение С : N составляет 9–200 : 1. Большин- ство минеральных удобрений хорошо растворяется в воде, что обе- спечивает доставку компонентов минерального питания к микроор- ганизмам. При исчерпании источников азота дальнейшее окисление углеводородов в почве может поддерживаться азотом, поставляемым азотфиксаторами. Для почв с застарелыми нефтяными загрязнениями или при их повторном появлении характерно присутствие микроорганизмов- нефтедеструкторов («диких» или аборигенных). В этом случае для активизации углеводородокисляющей способности аборигенной ми- крофлоры достаточно провести агротехнические мероприятия. При 28 ликвидации свежих нефтяных проливов в среду необходимо вносить препараты микроорганизмов-деструкторов. На основе моно- и сме- шанных культур разработано и активно используется огромное чис- ло биопрепаратов, предназначенных для очистки природных и тех- ногенных сред. В экстремальных условиях (в кислой среде, при де- фиците влаги, ограничении в питательных веществах) как деструкто- ры нефти более эффективны дрожжи и грибы. Мицелиальный рост позволяет грибам распространяться между локальными источника- ми компонентов питания, проникать в почвенно-нефтяные агломера- ты и в совокупности с устойчивостью к низкому содержанию влаги и низкому рН обеспечивает их активность на поздних стадиях разло- жения остатков нефти. В разложении нефти наряду с микроорганизмами косвенно могут участвовать растения и животные. При попадании нефти в почву воз- можно ограничение роста растений и активности почвенных живот- ных, что, в свою очередь, может влиять на микробную активность. Разрыхление почвы корнями растений, земляными червями и рою- щими артроподами облегчает дренаж и проникновение газов. Кроме того, роющие животные могут транспортировать органический мате- риал к биологически активным поверхностным слоям почвы. По сравнению с другими вредными веществами загрязнение угле- водородами в большей степени влияет на макрофлору и макрофауну, на эстетическое восприятие окружающей среды и оказывает воздей- ствие на микробную составляющую биоты. Микрофлора реагирует на изменения и способствует восстановлению окружающей среды, однако этот процесс может длиться довольно долго. Цель биореме- диации — ускорить его. В настоящее время биологические методы восстановления загряз- ненных углеводородами природных объектов (микробиологические и фиторемедиация) справедливо признаны наиболее безопасными для окружающей среды и экономически целесообразными. Исполь- зование биопрепаратов, созданных на основе ассоциаций культур- нефтедеструкторов, способных окислять широкий спектр углеводо- родов нефти (от длинноцепочечных алканов до полиароматических соединений), позволяет рекультивировать нефтезагрязненные терри- тории. Биопрепараты (табл. 1) предназначены для очистки от нефти и нефтепродуктов, для восстановления функций самоочищения почвы и водоемов, очистки сточных вод промышленных предприятий, сто- 29 ков автомоек, СТО, АЗС, территорий нефтедобывающей и нефтепе- рерабатывающей промышленности, депарафинизации скважин, тех- нических резервуаров. Широкое применение для очистки от нефте- загрязнений находят препараты Путидойл, Деградойл и др. В состав этих препаратов входят монокультуры (Путидойл, Экойл, Дестройл и др.) или ассоциации с двумя и более чем двадцатью видами различ- ных нефтеокисляющих микроорганизмов: бактерий, грибов, дрож- жей (Деворойл, Simbinal, Родоторин). Таблица 1 Коммерческие препараты для биоремедиации на основе нефтеокисляющих микроорганизмов Препарат Входящие в его состав микроорганизмы Деградойл Azotobacter vinelandii Путидойл Pseudomonas putida Экойл Pseudomonas sp. Эконадин P. fluorescens Дестройл Acinetobacter sp. Деворойл Rhodococcus sp. (два вида), P. aeruginosa, Candida sp. БАК Rhodococcus sp. (несколько штаммов) Десна Bacillus megaterium Бацисперин Bacillus sp. Simbinal Aeromonas sp., Arthrobacter globi�ormis, Bacillus sp., B. sub� sp., Arthrobacter globi�ormis, Bacillus sp., B. sub� tilis, Citrobacter sp., Flavobacterium tirrenicum, Nocardia sp., Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, P. putida, P. stutzeri, Aspergillus candidus, A. glaucus, A. Terreus, Penicillium �re� quentans Родоторин Комплекс грибов и бактерий на сорбентах — капроне и по- листироле С помощью методов генной инженерии стало возможным созда- ние рекомбинантных микроорганизмов на основе природных с це- лью получения штаммов с наиболее ценными свойствами. Так, в ге- ном микроорганизмов могут быть клонированы гены, белковые про- дукты которых обусловливают биодеградацию крайне токсичных ароматических соединений. Катаболические плазмиды с генами, ко- 30 дирующими биохимические пути микробной деградации поллютан- тов, и другие мобильные генетические элементы способны повышать эффективность штаммов-деструкторов за счет приобретения ими но- вых катаболических способностей. 2.2. Биодеградация ПАВ Поверхностно-активные вещества — химические соедине- ния, способные адсорбироваться на поверхности раздела фаз «жид- кость — твердое тело», «жидкость — газ», «жидкость — жидкость» и т. д. и существенно изменять физико-химические системы, в пер- вую очередь поверхностное (межфазное) натяжение. Классификация ПАВ, принятая на III Международном конгрессе по ПАВ и рекомен- дованная Международной организацией по стандартизации (ISO) в 1960 г., основана на химический природе молекул и включает четы- ре основные класса ПАВ: анионактивные, катионактивные, неионо- генные и амфотерные. Мировое производство ПАВ составляет 2–3 кг на душу населения в год. Примерно 50 % производимых ПАВ используется для быто- вой химии (моющие и чистящие средства, косметика), остальное — в промышленности и сельском хозяйстве. ПАВ находят примене- ние более чем в 100 отраслях народного хозяйства. К крупным по- требителям ПАВ относятся нефтяная и химическая промышленно- сти, промышленность строительных материалов и ряд других. Одно- временно с ежегодным ростом производства ПАВ соотношение меж- ду их применением в быту и промышленности изменяется в пользу последней. Широкое использование ПАВ в различных технологиче- ских процессах обусловливает накопление их в сточных водах, почве, отходах производств. Предельно допустимая концентрация ПАВ в воде водоемов со- ставляет 0,5 мг/дм 3 , неионогенных — 0,1 мг/дм 3 . Попадая в водое- мы и водотоки, ПАВ оказывают значительное влияние на их физико- биологическое состояние, ухудшая кислородный режим и органолеп- тические свойства, и сохраняются там долгое время, так как разлага- ются очень медленно. Сточные воды, содержащие продукты гидроли- за полифосфатных ПАВ, могут вызвать интенсивный рост растений, что приводит к загрязнению ранее чистых водоемов: по мере отмира- ния растений начинается их гниение, а вода обедняется кислородом, 31 что, в свою очередь, ухудшает условия существования других форм жизни в воде. Отрицательное с гигиенической точки зрения свойство ПАВ — их высокая пенообразующая способность. Хотя ПАВ не яв- ляются высокотоксичными веществами, имеются сведения о косвен- ном их воздействии на гидробионты. При концентрациях 5–15 мг/дм 3 рыбы теряют слизистый покров, при более высоких концентрациях может наблюдаться кровотечение жабр. Попадая внутрь живых ор- ганизмов, у высших животных и человека ПАВ вызывают генетиче- ские нарушения, снижают иммунитет, способствуют возникновению злокачественных опухолей. Для микроорганизмов токсичная доза 0,8–4,0 мг/дм 3 , для водорослей — 0,5–6,0, для беспозвоночных — 0,01–0,9 мг/дм 3 . Поэтому в настоящее время большую актуальность приобретают исследования, направленные на создание эффективных методов очистки окружающей среды от загрязнения поверхностно- активными веществами. Среди способов очистки сточных вод в отстойниках — перевод ПАВ в пену, адсорбция активным углем, использование ионообмен- ных смол, нейтрализация катионактивными веществами и другие, однако эти методы дороги и недостаточно эффективны. Главными факторами понижения концентрации ПАВ являются процессы био- химического окисления, сорбция взвешенными веществами и дон- ными отложениями. Степень биохимического окисления ПАВ зави- сит от их химического строения и условий окружающей среды. Биодеградация — основной процесс удаления ПАВ из водных и почвенных природных сред. По отношению к этому процессу все поверхностно-активные вещества принято делить на три группы: 1) легкоокисляемые, или так называемые биологически мягкие анионные ПАВ, — алкилсульфат и хлорсульфанол. Эти вещества сравнительно легко окисляются микроорганизмами. В аэротенках очистных сооружений они разлагаются на 80 %, в почве летом — от нескольких суток до 1 мес, зимой — в течение 3–4 мес; 2) трудноокисляемые, или биологически жесткие ПАВ, типа суль- фанолов НП-1 и НП-3; 3) вещества с промежуточной степенью доступности для биоде- градации. При попадании в водную среду и почву молекулы ПАВ подверга- ются деструкции в результате биохимических и физико-химических 32 процессов и «потребляются» (разрушаются) микроорганизмами, присутствующими в воде, почве и активном иле. По стадийности деструкции и потребления молекул ПАВ в про- цессе их биоразложения различают: 1) первичную биоразлагаемость — разрушение структуры моле- кулы с отщеплением гидрофильных групп, обусловливающее поте- рю поверхностно-активных свойств молекул ПАВ, что проявляется в первую очередь исчезновением пенообразования; 2) полную биоразлагаемость — дальнейшее усвоение осколков молекул ПАВ микробными сообществами вплоть до разложения на СО 2 и Н 2 О. В России действует национальный стандарт ГОСТ Р 50595-93 «Вещества поверхностно-активные. Метод определения биоразла- гаемости в водной среде», распространяющийся на метод опреде- ления биоразлагаемости поверхностно-активных веществ и уста- навливающий условия, приемы и метод определения их биоразлага- емости как таковых, так и в составах бытовых и технических пре- паратов. Поверхностно-активные вещества при попадании в водную среду разлагаются с различной скоростью под воздействием физико- химических и биохимических факторов в зависимости от условий среды и вида ПАВ. Метод позволяет устанавливать кинетические ха- рактеристики процессов биоразложения ПАВ в аэробных условиях в водной среде, а также ориентировочно-допустимый уровень содер- жания ПАВ в сточных водах, подаваемых в аэротенки. Показатели биоразлагаемости ПАВ, определяемые по ГОСТ Р 50595-93, учиты- ваются при санкционировании ассортимента, объемов производства и применения ПАВ, а также при выборе условий и способов очист- ки сточных вод. Метод основан на определении способности молекул ПАВ подвергаться биоразложению в аэробных условиях биологиче- ских очистных сооружений и водных объектов. Биохимическое окисление ПАВ проводят как в естественных условиях на полях фильтрации, орошения и в биологических прудах, так и в искусственно созданных условиях — в биофильтрах и в аэро- тенках. Поля фильтрации, поля орошения и биофильтры функциони- руют за счет почвенных биоценозов; биологические пруды и аэротен- ки — за счет биоценозов водоемов. В природных условиях процессы деструкции многих ПАВ проис- ходят очень медленно и определяются уровнем загрязнения и видом 33 загрязняющего вещества, рН, температурой воды (чем выше темпе- ратура, тем интенсивнее идет окисление), особенностями микробио- ценоза, а в почве — типом и влажностью почвы, содержанием по- чвенного органического вещества, механическим составом. Для раз- вития микроорганизмов, осуществляющих биоразложение ПАВ в почве, особенно большое значение имеют ее сорбционные свойства. В тяжелых почвах с высоким содержанием глинистых минералов и органического вещества ПАВ разлагаются значительно медленнее, чем в легких песчаных и супесчаных почвах. В процессах трансформации и детоксикации анионных ПАВ в почве ведущая роль принадлежит бактериям родов Pseudomonas и Bacillus, которые могут адаптироваться к детергентам и использовать их в качестве единственного источника углерода. Активные деструк- торы ПАВ встречаются также среди бактерий родов Xanthomonas, Mycobacterium, Nocardia, Achromobacter. Данные по биоразлагаемости ПАВ свидетельствуют о необходи- мости, с одной стороны, синтеза и внедрения в производство легко биоразрушаемых соединений, а с другой — о разработке новых, бо- лее интенсивных методов очистки окружающей среды от ПАВ. Эти методы должны основываться на использовании специально полу- ченных высокоактивных чистых культур микроорганизмов — де- структоров ПАВ. Применение таких культур в микробном методе очистки будет способствовать защите окружающей среды от загряз- нения синтетическими соединениями и сохранению окружающей че- ловека природы. 2.3. Разложение ПАУ Одна из важнейших причин современного экологического кризи- са — все возрастающее химическое загрязнение окружающей при- родной среды. В ряду приоритетных загрязнителей находятся и по- лициклические ароматические углеводороды, являющиеся широко распространенными продуктами неполного сгорания ископаемых то- плив и органических веществ. ПАУ в виде промышленных выбро- сов предприятий химической, нефтехимической промышленности, ливневого стока попадают в природные экосистемы, одним из важ- нейших элементов которых выступает почва. В загрязненных водных экосистемах ПАУ входят в пищевые цепи через биоаккумуляцию и |