1. Биотехнология растительных тканей

• Название: 1. Биотехнология растительных тканей
• Дата: 20.06.2021
• Размер: 488.95 Kb.
• Имя файла: 00093fb6-74699c39 (1).docx
• Тип: Документы; #219376
• страница: 1 из 2

1. Биотехнология растительных тканей

1. История развития биотехнологии. Основные этапы культуры клеток и тканей.

Человек использовал биотехнологию на протяжении многих тысяч лет: люди занимались пивоварением, пекли хлеб, придумали способы хранения и переработки продуктов путем ферментации (производство сыра, уксуса, соевого соуса), научились делать мыло из жиров, изготавливать простейшие лекарства и перерабатывать отходы. Однако только разработка методов генетической инженерии, основанных на создании рекомбинантных ДНК, привели к тому «биотехнологическому буму», свидетелями которого мы сейчас и являемся.

Биотехнология как самостоятельная прикладная наука сформировалась в середине 50-х годов XXвека, когда человечество осознало необходимость первоочередного решения на принципиально новых основах главнейших проблем современности – продовольственной, энергетической, ресурсной, загрязнения окружающей среды и др. Биотехнологические процессы базируются на использовании биосинтетического потенциала микроорганизмов, растительных и животных клеток, тканей и органов, культивируемых на искусственных питательных средах.

Возникновение, становление и развитие биотехнологии условно можно подразделить на четыре периода: эмпирический, этиологический, биотехнический и генотехнический.

Эмпирический(от греч. empeirikos - опытный)илидоисторический период - самый длительный, охватывающий примерно 8000 лет, из которых более 6000 тысяч лет - до нашей эры и около 2000 лет - нашей эры. Древние люди интуитивно использовали приемы и способы изготовления хлеба, пива и некоторых других продуктов. В течение нескольких тысячелетий известен уксус, издревле приготавливавшийся в домашних условиях; первая дистилляция вина осуществлена в XII в., водку из хлебных злаков получили в XVI в., шампанское известно с XVII в., но получение почти абсолютного этанола впервые удалось в XIV в. испанцу Раймунду.

К тому же эмпирическому периоду относятся получение кисло-молочных продуктов, квашенной капусты, медовых алкогольных напитков, силосование кормов, мочка лубоволокнистых растений.

Таким образом, народы исстари пользовались на практике микробиологическими процессами, ничего не зная о микробах. Эмпиризм также был характерен и в практике использования полезных растений и животных.

Второй, этиологический(от греч. aitia - причина)период в развитии биотехнологии охватывает вторую половину XIX в. и первую треть ХХ в. (1856 - 1933 г.г.). Он связан с выдающимися исследованиями великого французского ученого Луи Пастера (1822 - 1895 г.г.) - основоположника научной микробиологии и ряда микробиологических дисциплин (промышленной, медицинской, химической, санитарной). Пастер вскрыл микробную природу брожения, доказал возможность жизни в бескислородных условиях, экспериментально опроверг ходившее тогда представление о самопроизвольном зарождении живых существ, создал научные основы вакцинопрофилактики и вакцинотерапии, предложил метод стерилизации, называемый по его имени пастеризацией и т.д.

Этиологический период знаменателен тем, что удалось доказать индивидуальность микробов и получить их в чистых культурах. Более того, каждый вид мог быть размножен на питательных средах и использован в целях воспроизведения соответствующих процессов (бродильных, окислительных и др.). В этот период было начато изготовление пищевых прессованных дрожжей, а также некоторых продуктов обмена (метаболизма) ацетона, бутанола, лимонной и молочной кислот. Во Франции приступили к созданию биоустановок для микробиологической очистки сточных вод.

Третий периодразвития биотехнологии -биотехнический, начался в 1933 году, тогда была опубликована работа А. Клюйвера и Л.Х.Ц. Перкина "Методы изучения обмена веществ у плесневых грибов", в которой изложены основные технические приемы, а также подходы к оценке и интерпретации получаемых результатов при глубинном культивировании грибов. После этого началось внедрение в биотехнологию крупномасштабного герметизированного оборудования, обеспечивающего проведение процессов в стерильных условиях.

Особенно мощный толчок в развитии промышленного биотехнологического оборудования был отмечен в период становления и развития производства антибиотиков (1939 - 1945). Работами многих ученых была показана возможность механизации процессов брожения, культивирования различных клеток и различных клеточных продуктов для нужд человека и, прежде всего, в качестве или в составе лечебных и профилактических средств: антибиотики (пенициллин, стрептомицин, тетрациклин), декстран, ряд аминокислот и другие.
Четвертый периодв биотехнологии -генотехнический(от греч. genesis - происхождение, возникновение, рождение) начался с 1972 года. В этом году П. Берг со своими сотрудниками (США) создали первую рекомбинантную молекулу ДНК.

Однако, без фундаментальных работ Ф. Крика и Дж. Уотсона (1953) по установлению структуры ДНК было невозможно достичь современных результатов в области биотехнологии. Выяснение механизмов функционирования и регуляции ДНК, выделение и изучение специфичных ферментов привело к формированию строго научного подхода к разработке биотехнологических процессов на основе генно-инженерных работ. В этом суть генотехнического периода.

В течение последних 10 - 15 лет происходит бурное развитие биотехнологии, определились сферы приоритетного внедрения конкретных результатов биотехнологических разработок и, как следствие, были выделены основные направления и разделы биотехнологии. К ним относятся: медицинская биотехнология, иммунобиотехнология, биогеотехнология, инженерная энзимология, биоэнерготехнология, космическая биотехнология и др.

В развитии метода культуры тканей, клеток и изолированных протопластов растений можно выделить следующие основные этапы:

1892 -1902 гг. Этот период связан с работами немецких ученых X. Вёхтинга, К. Рехингера и Г. Габерландта. Они пытались выращивать in vitro изолированные из растений кусочки ткани на растворах сахарозы, однако длительно растущих культур не получили. В то же время X. Вёхтинг показал, что полярность присуща не только органам растений, но и самым маленьким фрагментам ткани, и предположил, что она является свойством отдельной клетки. К. Рехингер получил каллусную ткань из сегментов стебля тополя, корня одуванчика, свеклы и других культур и определил минимальный размер фрагмента (1,5 мм), способного образовывать каллус. Г. Габерландт пытался культивировать in vitro эпидермис, клетки тычиночных волосков традесканции и полисад- ной паренхимы листа. Его расчет на то, что хлорофиллоносные клетки паренхимы обеспечат себя органическими веществами за счет фотосинтеза, оказался ошибочным. Использованные им в качестве объекта полностью дифференцированные, утратившие эмбриональную активность клетки не делились, а способа вызвать их дедифференциацию Г. Габерландт не нашел. Он выдвинул гипотезу о тотипотентности любой живой клетки растения, т. е. способности любой соматической клетки полностью реализовать свой потенциал развития — образовать целый организм.

Таким образом, на основании работ данного этапа были выдвинуты следующие идеи: 1) полярность свойственна не только органам растения, но и отдельной клетке; 2) любая живая клетка растения тотипотентна.

1907-1930 гг. В этот период были достигнуты существенные успехи в культивировании животных тканей на питательных средах природного происхождения (плазма крови, зародышевая жидкость) (работы Р. Гаррисона, А. Каррела и др.). Но, когда в 1927 г. X. Чех и С. Прат попытались по аналогии вырастить изолированные ткани растения на растительных экстрактах, их постигла неудача. Причина ее заключалась в том, что в опытах использовались мало пригодные для проявления ростовой активности ткани высших растений.

Общей тенденцией в те годы была оптимизация состава питательных сред с целью обеспечить длительное существование in vitro изолированных клеток и тканей растений. Однако первый успех определил не выбор питательной среды для культивирования, а удобный для выращивания в культуре in vitro объект. В 1922 г. В. Роббинс и независимо от него В. Котте осуществили культивирование на синтетической питательной среде меристем кончиков корня томата и кукурузы, тем самым положив начало методу культуры изолированных органов растений. Корни некоторое время росли, но не размножались, а как их поддерживать длительное время в культуре, ученые не знали.

1932-1939 гг. связаны с именами двух исследователей: американца Ф. Уайта и француза Р. Готре. Они повторили опыты В. Роббинса и В. Котте, показав, что изолированные корни могут расти на питательной среде неограниченно долго, если их кончики периодически пересаживать на свежую питательную среду. Успех работ Ф. Уайта и Р. Готре был обусловлен удачным выбором объектов исследования. Р. Готре использовал каллусные ткани древесных растений (камбиального происхождения) и запасающей паренхимы, а Уайт работал с тканями растительных опухолей и корневыми меристемами. Они установили, что ткани камбиального и паренхимного происхождения, а также опухолевые можно длительно поддерживать in vitro, если их периодически субкультивировать. Исследователи ввели в культуру in vitro ткани разных органов большого количества видов растений, относящихся к двудольным травянистым и деревянистым формам, а также к однодольным, голосеменным и споровым. Ф. Уайт и Р. Готре по праву считаются основоположниками метода культуры тканей и клеток растений.

Большое влияние на развитие метода культуры in vitro клеток и тканей растений в нашей стране оказал обзор Ф. Уайта (1943), опубликованный на русском языке в 1949 г. В нем изложены подробная методика культивирования растительных тканей, требования, предъявляемые к работам in vitro, приведены составы питательных сред и физические факторы, влияющие на рост изолированных тканей.

1940-1960-е гг. В вышедшей в 1959 г. монографии Р. Готре уже упоминалось 142 вида растений, ткани которых выращиваются in vitro. В этот период для многих культур были разработаны специальные питательные среды, изучено значение макро- и микроэлементов для поддержания ростовой активности каллусной ткани, выявлена потребность культур в витаминах и стимуляторах роста.

Ф. Скуг и С. Миллер в 1955 г. при изучении способности к делению и образованию каллуса в клетках сердцевинной паренхимы стебля табака открыли новый класс фитогормонов - цитокинины. Они показали, что кинетин в комбинации с ИУК стимулировал деление клеток сердцевинной паренхимы, лишенной камбия и проводящих пучков. Клетки на среде с ИУК, но без кинетина не делились. В зависимости от соотношения и концентраций регуляторов роста можно было усиливать деление клеток экспланта (фрагмента ткани или органа, инкубируемого на питательной среде или используемого для получения первичного каллуса), поддерживать рост каллусной ткани, индуцировать морфогенез.

В то время исследовались также натуральные экстракты — эндосперм кокосового ореха, каштана, кукурузы и других растений - по их способности поддерживать неорганизованный клеточный рост и стимулировать процессы органогенеза и соматического эмбриогенеза в каллусной культуре и суспензиях клеток (Ф. Стюард, 1962). Были разработаны метод получения и выращивания больших количеств клеточных суспензий (3. Никель, В. Тулеке, 1959) и метод культивирования отдельной, выделенной из суспензии, клетки, деление которой индуцировали с помощью ткани-«няньки» (Л. Джонс, 1960).

1960-1973 гг. Этот период связан с разработкой Е. Кокингом (1960) метода получения изолированных протопластов из тканей корня и плодов томатов путем обработки их смесью пектолитических и целлюлолитических ферментов и исследованием их физиологии. Стало возможным вывести клетку из «деревянной тюрьмы» (по образному выражению А. Галстона) и манипулировать с ней. Были найдены условия культивирования изолированных протопластов, при которых они образуют новую клеточную стенку, делятся и дают начало клеточным линиям, способным в ряде случаев к морфогенезу (И. Такебе, 1971). Протопласты были использованы для разработки методов гибридйзации соматических клеток путем их слияния, для введения в них вирусных РНК, клеточных органелл, клеток бактерий. На соматических гибридах изучалось поведение ядерного и цитоплазматических геномов в гибридных клеточных линиях.

В этот период разработан метод культуры апикальных меристем, позволяющий быстро и эффективно размножать растения (Дж. Морель, 1959; Р. Г. Бутенко, 1960-1964). Полученные растения часто не содержали вирусных, бактериальных и микоплазменных инфекций. Была открыта индукция андрогенеза при культивировании изолированных пыльников, а андрогенез использован для получения гаплоидных и дигаплоидных линий. Обнаружено явление сомаклональной изменчивости, получены и изучены растения-регенеранты табака - сомаклональные варианты (СКВ) исходной формы.

В рассмотренный период совершенствовались методы и аппаратура для культивирования суспензии клеток.

1974—1990-е гг. Происходит развитие техники in vitro, изучение биологии культивируемых объектов и создание технологий на их основе. У. Циммерманом в 1974 году был разработан метод электрослияния изолированных протопластов. На основе методов гибридизации соматических клеток, мутагенеза и клеточной селекции, получения СКВ и гаплоидов создано множество новых форм и сортов сельскохозяйственных растений. С использованием изолированных протопластов и генетических векторов на основе плазмид, разнообразных способов введения генов в клетки стало возможным и приобрело массовый характер получение трансгенных растений. В настоящее время де­лаются попытки создать симбиотические системы гетеротрофных эукариотических клеток высших растений с азотфиксирующими фототрофными цианобактериями

2. Использование достижений биотехнологии в отраслях производства.

С помощью биотехнологии получено множество продуктов для здравоохранения, сельского хозяйства, продовольственной и химической промышленности.

Причем важно то, что многие из них не могли быть получены без применения биотехнологических способов.

Особенно большие надежды связываются с попытками использования микроорганизмов и культур клеток для уменьшения загрязнения среды и производства энергии.

В молекулярной биологии использование биотехнологических методов позволяет определить структуру генома, понять механизм экспрессии генов, смоделировать клеточные мембраны с целью изучения их функций и т.д.

Конструирование нужных генов методами генной и клеточной инженерии позволяет управлять наследственностью и жизнедеятельностью животных, растений и микроорганизмов и создавать организмы с новыми полезными для человека свойствами, ранее не наблюдавшимися в природе.

Микробиологическая промышленность в настоящее время использует тысячи штаммов различных микроорганизмов. В большинстве случаев они улучшены путем индуцированного мутагенеза и последующей селекции. Это позволяет вести широкомасштабный синтез различных веществ.

Некоторые белки и вторичные метаболиты могут быть получены только путем культивирования клеток эукариот. Растительные клетки могут служить источником ряда соединений - атропин, никотин, алкалоиды, сапонины и др.

В биохимии, микробиологии, цитологии несомненный интерес вызывают методы иммобилизации как ферментов, так и целых клеток микроорганизмов, растений и животных.

В ветеринарии широко используются такие биотехнологические методы, как культура клеток и зародышей, овогенез in vitro, искусственное оплодотворение.

Все это свидетельствует о том, что биотехнология станет источником не только новых продуктов питания и медицинских препаратов, но и получения энергии и новых химических веществ, а также организмов с заданными свойствам.

Селекция строится на отборе растений (животных) с выраженными благоприятными признаками и дальнейшем скрещивании таких организмов, в то время как генная инженерия позволяет непосредственно вмешиваться в генетический аппарат клетки. Важно отметить, что в ходе традиционной селекции получить гибриды с искомой комбинацией полезных признаков весьма сложно, поскольку к потомству передаются очень большие фрагменты геномов каждого из родителей, в то время как генно-инженерные методы позволяют работать чаще всего с одним или несколькими генами, причем их модификации не затрагивают работу других генов. В результате, не теряя других полезных свойств растения, удается добавить еще один или несколько полезных признаков, что весьма ценно для создания новых сортов и новых форм растений. Стало возможным изменять у растений, например, устойчивость к климату и стрессам, или их чувствительность к насекомым или болезням, распространённым в определённых регионах, к засухе и т.д. Учёные надеются даже получить такие породы деревьев, которые были бы устойчивы к пожарам. Ведутся широкие исследования по улучшению пищевой ценности различных сельскохозяйственных культур, таких как кукуруза, соя, картофель, томаты, горох и др.

Генно-инженерные работы в животноводстве имеют другую задачу. Вполне достижимой целью при современном уровне технологии является создание трансгенных животных с определённым целевым геном. Например, ген какого-нибудь ценного гормона животного (например, гормона роста) искусственно внедряется в бактерию, которая начинает продуцировать его в больших количествах. Еще один пример: трансгенные козы, в результате введения соответствующего гена, могут вырабатывать специфический белок, фактор VIII, который препятствует кровотечению у больных, страдающих гемофилией, или фермент, тромбокиназу, способствующий рассасыванию тромба в кровеносных сосудах, что актуально для профилактики и терапии тромбофлебита у людей. Трансгенные животные вырабатывают эти белки намного быстрее, а сам способ значительно дешевле традиционного.

В конце 90-х годов XX в. учёные США вплотную подошли к получению сельскохозяйственных животных методом клонирования клеток эмбрионов, хотя это направление нуждается еще в дальнейших серьезных исследованиях. А вот в ксенотрансплантации - пересадке органов от одного вида живых организмов другому, - достигнуты несомненные результаты. Наибольшие успехи получены при использовании свиней, имеющих в генотипе перенесенные гены человека, в качестве доноров различных органов. В этом случае наблюдается минимальный риск отторжения органа.

Помимо широкого применения в сельском хозяйстве, на основе генной инженерии возникла целая отрасль фармацевтической промышленности, называемая “индустрией ДНК” и представляющая собой одну из современных ветвей биотехнологии. Более четверти всех лекарств, используемых сейчас в мире, содержат ингредиенты из растений. Генно-модифицированные растения являются дешевым и безопасным источником для получения полностью функциональных лекарственных белков (антител, вакцин, ферментов и др.) как для человека, так и для животных. Примерами применения генной инженерии в медицине являются также производство человеческого инсулина путем использования генно-модифицированных бактерий, производство эритропоэтина (гормона, стимулирующего образование эритроцитов в костном мозге. Физиологическая роль данного гормона состоит в регуляции продукции эритроцитов в зависимости от потребности организма в кислороде) в культуре клеток (т.е. вне организма человека) или новых пород экспериментальных мышей для научных исследований.

Разработка методов генной инженерии, основанных на создании рекомбинантных ДНК, привела к тому "биотехнологическому буму", свидетелями которого мы являемся. Благодаря достижениям науки в этой области стало возможным не только создание «биологических реакторов», трансгенных животных, генно-модифицированных растений, но и проведение генетической паспортизации (полного исследования и анализа генотипа человека, проводимого, как правило, сразу после рождения, для определения предрасположенности к различным заболеваниям, возможную неадекватную (аллергическую) реакцию на те или иные лекарства, а также склонность к определенным видам деятельности). Генетическая паспортизация позволяет прогнозировать и уменьшать риски сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний, исследовать и предотвращать нейродегенеративные заболевания и процессы старения, анализировать нейро-физиологические особенности личности на молекулярном уровне), диагностирование генетических заболеваний, создание ДНК-вакцин, генотерапия различных заболеваний и т.д.

3. Значение биотехнологий и направления в биотехнологии.

Основные направления биотехнологий.

Основными направлениями развития современных биотехнологий являются медицинские биотехнологии, агробиотехнологии и экологические биотехнологии. Новейшим и важнейшим ответвлением биотехнологии является генная инженерия.

Медицинские биотехнологии.

Медицинские биотехнологии подразделяются на диагностические и лечебные. Диагностические медицинские биотехнологии в свою очередь разделяют на химические (определение диагностических веществ и параметров их обмена) и физические (определение особенностей физических процессов организма).

Химические диагностические биотехнологии используются в медицине давно. Но если раньше они сводились к определению в тканях и органах веществ, имеющих диагностическое значение (статический подход), то сейчас развивается и динамический подход, позволяющий определять скорости образования и распада представляющих интерес веществ, активность ферментов, осуществляющих синтез или деградацию этих веществ, и др. Кроме того, современная диагностика разрабатывает методы функционального подхода, с помощью которого можно оценивать влияние функциональных воздействий на изменение диагностических веществ, а следовательно, выявлять резервные возможности организма.

В будущем возрастет роль физической диагностики, которая дешевле и быстрее, чем химическая, и состоит в определении физико-химических процессов, лежащих в основе жизнедеятельности клетки, а также физических процессов (тепловых, акустических, электромагнитных и др.) на тканевом уровне, уровне органов и организма в целом. На базе такого рода анализа в рамках биофизики сложных биологических систем будут развиваться новые методы физиотерапии, выяснится смысл многих так называемых нетрадиционных методов лечения, приемов народной медицины и т.д.

Биотехнологии широко используются в фармакологии. В древности для лечения больных применяли животные, растительные и минеральные вещества. Начиная с XIX в. в фармакологии получают распространение синтетические химические препараты, а с середины XX в. и антибиотики — особые химические вещества, которые образуются микроорганизмами и способны оказывать избирательно токсическое воздействие на другие микроорганизмы. В конце XX в. фармакологи обратились к индивидуальным биологически активным соединениям и стали составлять их оптимальные композиции, а также использовать специфические активаторы и ингибиторы определенных ферментов, суть действия которых — в вытеснении патогенной микрофлоры невредной для здоровья людей микрофлорой (использование микробного антагонизма).

Биотехнологии помогают в борьбе современной медицины с сердечно-сосудистыми заболеваниями (прежде всего с атеросклерозом), с онкологическими заболеваниями, с аллергиями как патологическим нарушением иммунитета (способность организма защищать свою целостность и биологическую индивидуальность), старением и вирусными инфекциями (в том числе со СПИДом). Так, развитие иммунологии (науки, изучающей защитные свойства организма) способствует лечению аллергии. При аллергии организм отвечает на воздействие некоторого специфического аллергена чрезмерной реакцией, повреждающей его собственные клетки и ткани в результате отека, воспаления, спазма, нарушений микроциркуляции, гемодинамики и др. Иммунология, изучая клетки, осуществляющие иммунный ответ (иммуноциты), позволяет создавать новые подходы к лечению иммунологических, онкологических и инфекционных заболеваний.

Человек пока не умеет лечить СПИД и плохо лечит вирусные инфекции. Химиотерапия и антибиотики, эффективные в борьбе с бактериальной инфекцией, неэффективны в отношении вирусов (например, возбудителей атипичной пневмонии). Предполагается, что здесь существенный прогресс будет достигнут благодаря развитию иммунологии, молекулярной биологии вирусов, в частности изучению взаимодействия вирусов со специфическими для них клеточными рецепторами.

Биотехнологическими способами производят витамины, диагностические средства для клинических исследований (тест-системы на наркотики, лекарства, гормоны и т.п.), биоразлагаемые пластмассы, антибиотики, биосовместимые материалы. Новая область биоиндустрии — производство пищевых добавок.

Агробиотехнологии.

Сельскохозяйственные

В XX в. произошла «зеленая революция» — за счет использования минеральных удобрений, пестицидов и инсектицидов удалось добиться резкого повышения продуктивности растениеводства. Но сейчас понятны и ее отрицательные последствия, например насыщение продуктов питания нитратами и ядохимикатами. Основная задача современных агробиотехнологий — преодоление отрицательных последствий «зеленой революции», микробиологический синтез средств защиты растений, производства кормов и ферментов для кормопроизводства и др. При этом упор делается на биологические методы восстановления плодородия почвы, биологические методы борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур, на переход от монокультур к поликультурам (что повышает выход биомассы с единицы площади сельхозугодий), выведение новых высокопродуктивных и обладающих другими полезными свойствами (например, засухоустойчивостью или устойчивостью к засолению) сортов культурных растений.

Продовольственные сельскохозяйственные культуры служат сырьем для пищевой промышленности. Биотехнологии используются при изготовлении пищевых продуктов из растительного и животного сырья, их хранении и кулинарной обработке, при производстве искусственной пищи (искусственной икры, искусственного мяса из сои, бобы которой богаты полноценным белком), при производстве корма для скота из продуктов, полученных из водорослей и микробной биомассы (например, получение кормовой биомассы из микробов, растущих на нефти).

Поскольку микроорганизмы чрезвычайно разнообразны, микробиологическая промышленность на их основе вырабатывает самые разные продукты, например ферментные препараты, находящие широкое применение в производстве пива, спирта и т.д.

Экологические биотехнологии.

Биотехнологии выступают одним из важнейших способов решения экологических проблем. Они применяются для уничтожения загрязнений окружающей среды (например, очистка воды или очистка от нефтяных загрязнений), для восстановления разрушенных биоценозов (тропических лесов, северной тундры), восстановления популяций исчезающих видов или акклиматизации растений и животных в новых местах обитания.

Так, с помощью биотехнологий решается проблема освоения загрязненных территорий устойчивыми к этим загрязнениям видами растений. Например, зимой в городах для борьбы со снежными заносами используются минеральные соли, от которых гибнут многие виды растений. Однако некоторые растения устойчивы к засолению, способны поглощать цинк, кобальт, кадмий, никель и другие металлы из загрязненных почв; конечно, они предпочтительнее в условиях больших городов. Выведение сортов растений с новыми свойствами — одно из направлений экологической биотехнологии.

Важные направления экологических биотехнологий — ресурсная биотехнология (использование биосистем для разработки полезных ископаемых), биотехнологическая (с использованием бактериальных штаммов) переработка промышленных и бытовых отходов, очистка сточных вод, обеззараживание воздуха, генно-инженерные экологические биотехнологии.

Многообразие сфер применения биотехнологий. Биотехнологии успешно применяются в некоторых «экзотических» отраслях. Так, во многих странах микробная биотехнология используется для повышения нефтеотдачи. Микробиологические технологии исключительно эффективны и при получении цветных и благородных металлов. Если традиционная технология включает в себя обжиг, при котором в атмосферу выбрасывается большое количество вредных серосодержащих газов, то при микробной технологии руда переводится в раствор (микробное окисление), а затем путем электролиза из него получают ценные металлы.

Использование метанотрофных бактерий позволяет снизить концентрацию метана в шахтах. А для отечественной угледобычи проблема шахтного метана всегда была одной из самых острых: по статистике, из-за взрывов метана в шахтах каждый добытый 1 млн т угля уносит жизнь одного шахтера.

Созданные биотехнологическими методами ферментные препараты находят широкое применение в производстве стиральных порошков, в текстильной и кожевенной промышленности.

Космическая биология и медицина изучают закономерности функционирования живых организмов, прежде всего человеческого, в условиях космоса, космического полета, пребывания на других планетах и телах Солнечной системы. Одним из важных направлений в этой области является разработка космических биотехнологий — замкнутых биосистем, предназначенных для функционирования в условиях длительного космического полета. Созданная отечественной наукой система такого рода способна обеспечить жизнедеятельность космонавтов в течение 14 лет. Этого вполне достаточно для реализации космической мечты человечества — полета к ближайшим планетам Солнечной системы, прежде всего к Марсу.

Таким образом, современные биотехнологии исключительно разнообразны. Не случайно XXI в. нередко называют веком биотехнологии. Важнейшим ответвлением биотехнологии, открывающим самые ошеломляющие перспективы перед человечеством, является генная инженерия.

Генная инженерия.

Генная инженерия возникла в 1970-е гг. как раздел молекулярной биологии, связанный с целенаправленным созданием новых комбинаций генетического материала, способного размножаться (в клетке) и синтезировать конечные продукты. Решающую роль в создании новых комбинаций генетического материала играют особые ферменты (рестриктазы, ДНК-лигазы), позволяющие рассекать молекулу ДНК на фрагменты в строго определенных местах, а затем «сшивать» фрагменты ДНК в единое целое. Только после выделения таких ферментов стало практически возможным создание искусственных гибридных генетических структур — рекомбинантных ДНК(молекул ДНК, которые получаются в результате ковалентного объединения вектора и чужеродного фрагмента ДНК). Рекомбинантная молекула ДНК содержит искусственный гибридный ген (или набор генов) и «вектор-фрагмент» ДНК, обеспечивающий размножение рекомбинированной ДНК и синтез ее конечных продуктов — белков. Все это уже происходит в клетке-хозяине (бактериальной клетке), куда вводится рекомбинированная ДНК.

Методами генной инженерии сначала были получены трансгенные микроорганизмы, несущие гены бактерии и гены онко-генного вируса обезьяны, а затем — микроорганизмы, несущие в себе гены мушки дрозофилы, кролика, человека и т.д. Впоследствии удалось осуществить микробный (и недорогой) синтез многих биологически активных веществ, присутствующих в тканях животных и растений в весьма низких концентрациях: инсулина, интерферона человека, гормона роста человека, вакцины против гепатита, а также ферментов, гормональных препаратов, клеточных гибридов, синтезирующих антитела желаемой специфичности, и т.п.

Генная инженерия открыла перспективы конструирования новых биологических организмов — трансгенных растений и животных с заранее запланированными свойствами. По сути, непреодолимых природных ограничений для синтеза генов нет (так, существуют программы по созданию трансгенной овцы, покрытой вместо шерсти шелком; трансгенной козы, молоко которой содержит ценный для человека интерферон; трансгенного шпината, который вырабатывает белок, подавляющий ВИЧ-инфекции, и др.). Возникла новая отрасль промышленности — трансгенная биотехнология, занимающаяся конструированием и применением трансгенных организмов. (Сейчас в США функционирует уже около 2500 генно-инженерных фирм.)

В неразрывной связи с разработкой технологий генной инженерии развиваются фундаментальные исследования в молекулярной биологии. Одним из важнейших направлений молекулярной биологии и генной инженерии является изучение геномов растительных и животных видов и разработка способов их реконструкции. Геном — это совокупность генов, характерных для гаплоидного, т.е. одинарного набора хромосом данного вида организмов. В отличие от генотипа геном представляет собой характеристику вида, а не отдельной особи. Общая логика исследования ведет молекулярную биологию от выяснения способов воссоздания генома вида к разработке способов воссоздания генотипа особи.

Огромное значение имеет изучение генома человека. В рамках одного из самых трудоемких и дорогостоящих в истории науки международного проекта «Геном человека» (начат в 1988 г., задействовано несколько тысяч ученых из более чем 20 стран; стоимость — до 9 млрд долл.) была поставлена задача — выяснить последовательность нуклеотидных оснований во всех молекулах ДНК человека и локализовать их, т.е. полностью картировать все гены человека. Ожидается, что затем исследователи определят все функции генов и разработают технологические способы использования этих данных.

К настоящему времени удалось установить, что геном человека состоит из 3 млрд нуклеотидов, 30 млн из которых (около 10% всей хромосомной ДНК) объединяется в 40 тысяч генов. (Можно предложить такую аналогию. Геном человека — это созданный природой грандиозный текст, состоящий из 3 млрд букв, в качестве которых выступают молекулы-нуклеотиды — аденин, гуанин, цитозин и тимин.) В 2003 г. было объявлено о завершении важной части проекта — выявлены последовательности нуклеотидов в 40 тыс. генов человека. (Функции остальных 90% нуклеотидов ДНК не вполне понятны, и сейчас они выясняются.) Интересно, что различия между двумя людьми на уровне ДНК составляют в среднем один нуклеотид на тысячу, они и обусловливают наследственные индивидуальные особенности каждого человека.

В ходе выполнения проекта «Геном человека» разработано много новых методов исследования, большинство из которых в последнее время автоматизировано. Это значительно ускоряет и удешевляет расшифровку ДНК, что является важнейшим условием для их широкого использования в медицинской практике4, фармакологии, криминалистике и т.д. Среди этих методов есть и такие, которые позволяют расшифровывать генотип отдельного человека и создавать генные портреты людей5. Это дает возможность эффективнее лечить болезни, оценивать способности и возможности каждого человека, выявлять различие между популяциями, оценивать степень приспособленности конкретного человека к той или иной экологической обстановке6. По последовательностям ДНК можно устанавливать степень родства людей. Разработан метод «генетической дактилоскопии», который с успехом применяется в криминалистике. Сходные подходы можно использовать в антропологии, палеонтологии, этнографии, археологии.

Вместе с тем, как говорят специалисты, изучение генома человека прояснило гораздо меньше загадок, чем ожидалось. Удалось только «поставить указатели» для дальнейших исследований. Прочтение генома — это первый этап в понимании его функционирования. Задача следующего этапа — разобраться в том, каковы функции генов, как и какие белки они синтезируют, как функционируют гены по отдельности и как они взаимодействуют между собой; иначе говоря, как работают вместе 3 млрд нуклеотидов. Это, пожалуй, главная проблема биологии XXI в.

Трансгенные организмы: проблема жизни в генетически модифицированном мире.

Уже сейчас молекулярная генетика открывает широкие перспективы для генной инженерии. Одно из таких перспективных направлений — создание трансгенных растений, животных, микроорганизмов, т.е. таких организмов, в собственный генетический материал которых «встроены» чужеродные гены.

На этом пути получены замечательные результаты. Так, за последние 15 лет прошли полевые испытания около 25 000 различных трансгенных растительных культур, одни из которых устойчивы к вирусам, другие — к гербицидам, третьи — к инсектицидам. Площадь посевов трансгенных гербицидоустойчивых сои, хлопка, кукурузы занимают 28 млн га во всем мире. Стоимость урожая трансгенного зерна 2000 г. оценен в 3 млрд долл. Развита и индустрия трансгенных животных. Они широко используются для научных целей как источник органов для трансплантации, как производители терапевтических белков, для тестирования вакцин и др. Например, в Германии трансгенный бык (по кличке Герман) содержит в своем геноме человеческий ген лактоферина, кодирующий синтез особого белка женского молока, от которого младенцы сладко спят.

Составной частью проектов создания трансгенных организмов являются исследования и разработки в области генной терапии — лечебные процедуры, такие, как введение нужных трансгенов в клетки больного организма, замена больных генов здоровыми, адресная доставка лекарств в пораженные клетки. Трансгены, попадая в клетку, компенсируют ее генетические дефекты, ослабляя или усиливая синтез того или иного белка.

В дальнейшем трансгенные технологии предполагается использовать для решения широкого круга проблем. Так, для решения ряда экологических проблем разрабатывается программа конструирования трансгенных микробов, которые могут: активно поглощать СО2 из атмосферы, а следовательно, снижать парниковый эффект; активно поглощать воду из атмосферы, значит превращать пустыни в плодородные земли; конструировать трансгенные микроорганизмы, повышающие плодородие почв, утилизирующие загрязнители, конвертирующие отходы, ослабляющие проблему дефицита сырья (трансгенные микробы, синтезирующие каучук) и т.п.

Для повышения эффективности сельского хозяйства предполагается создавать трансгенные растения с повышенной пищевой и кормовой ценностью, трансгенные деревья для производства бумаги, для наращивания древесины, трансгенных животных с повышенной продуктивностью биомассы и молока, трансгенные виды ценных пород рыб, в частности лососевых; и др.

Повышение эффективности здравоохранения с помощью трансгенных технологий предполагает, в частности, решение проблем контроля над наследственными заболеваниями (трансгенные вирусы для генной терапии, трансгенные микробы как живые вакцины и др.). Обсуждаются проблемы клонирования (см. 17.2.7) животных (и людей) и даже создания новых форм живого (для нового генетического кода синтезируются новые нуклеотиды и новые аминокислоты), способных осваивать другие планеты (обсуждается проект создания микробов для Марса, способных выделять углекислый газ, что приведет к потеплению марсианского климата).

4. Клеточная инженерия. Тотипотентность растительных кл иеток.

КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ, совокупность методов, используемых для конструирования новых клеток. Включает культивирование и клонирование клеток на специально подобранных средах, гибридизацию клеток, пересадку клеточных ядер и другие микрохирургические операции по «разборке» и «сборке» (реконструкции) жизнеспособных клеток из отдельных фрагментов.

Начало клеточной инженерии относят к 1960-м гг., когда возник метод гибридизации соматических клеток. К этому времени были усовершенствованы способы культивирования животных клеток и появились способы выращивания в культуре клеток и тканей растений. Соматическую гибридизацию, т. е. получение гибридов без участия полового процесса, проводят, культивируя совместно клетки различных линий одного вида или клетки различных видов. При определённых условиях происходит слияние двух разных клеток в одну гибридную, содержащую оба генома объединившихся клеток. Удалось получить гибриды между клетками животных, далёких по систематическому положению, напр. мыши и курицы. Соматиче-ские гибриды нашли широкое применение как в научных исследованиях, так и в биотехнологии. С помощью гибридных клеток, полученных от клеток человека и мыши и человека и китайского хомячка, была проделана важная для медицины работа по картированию генов в хромосомах человека. Гибриды между опухолевыми клетками и нормальными клетками иммунной системы (лимфоцитами) – т. н. гибридомы – обладают свойствами обеих родительских клеточных линий. Подобно раковым клеткам, они способны неограниченно долго делиться на искусственных питательных средах (т. е. они «бессмертны») и, подобно лимфоцитам, могут вырабатывать моноклональные (однородные) антитела определённой специфичности. Такие антитела применяют в лечебных и диагностических целях, в качестве чувствительных реагентов на различные органические вещества и т. п.

При гибридизации соматических клеток растений их предварительно освобождают от плотной клеточной оболочки, а затем проводят слияние изолированных протопластов. В этом случае, как и при гибридизации клеток животных, также удаётся преодолевать барьеры нескрещиваемости, которые существуют при обычной (половой) гибридизации растений разных видов и родов. Из гибридной растительной клетки на специальной среде можно вырастить клеточную массу – каллюс, дифференцирующуюся в нормальное целое растение с корнями, стеблями и т. д. Такое гибридное растение можно высадить в землю и выращивать и размножать обычными способами. Эти методы, в отличие от традиционных, позволяют сравнительно легко и быстро получать достаточное количество генетически разнообразного исходного материала для селекции. Их применение привело, напр., к увеличению урожайности ряда культур – картофеля, цитрусовых и др.

Другое направление клеточной инженерии – манипуляции с безъядерными клетками, свободными ядрами и другими фрагментами, сводящиеся к комбинированию разнородных частей клетки. Эти эксперименты, а также микроинъекции в клетку хромосом, красителей и т. п. проводят для выяснения взаимных влияний ядра и цитоплазмы, факторов, регулирующих активность генов, и т. п.

Путём соединения клеток разных зародышей на ранних стадиях их развития выращивают мозаичных животных, или химер, состоящих из двух различающихся генотипами видов клеток. С помощью таких экспериментов изучают процессы дифференцировки клеток и тканей в ходе развития организма.

Ведущиеся уже не одно десятилетие опыты по пересадке ядер соматических клеток в лишённые ядра (энуклеированные) яйцеклетки животных с последующим выращиванием зародыша во взрослый организм с кон. 20 в. получили широкую известность как клонирование животных.

Преимущество клеточной инженерии в том, что она позволяет экспериментировать с клетками, а не с целыми организмами. Последнее гораздо сложнее, а иногда и невозможно, особенно в случае млекопитающих животных и человека или при получении отдалённых гибридов. Методы клеточной инженерии в медицине, сельском хозяйстве или биотехнологии часто применяют в сочетании с генной инженерией.

Методы культивирования изолированных фрагментов растений основаны на использовании важного свойства растительной клетки — тотипотентности. Тотипотентность (лат. Totus - весь, potentia - сила) - это свойство клетки реализовать генетическую информацию, обеспечивающую ее дифференцировку и развитие до целого организма. Тотипотентностью обладают оплодотворенные яйцеклетка растений и яйцо животных организмов. Что касается дифференцированных клеток, то у животных тотипотентность присуща только некоторым клеткам кишечнополостных. Так, соматические клетки гидры дают начало новому организму. У высших животных с ранних этапов эмбриогенеза, с началом специализации клеток, тотипотентность не реализуется. Однако клетки, изолированные из эмбрионов млекопитающих, в условиях культивирования могут сохранять плюрипотентность - способность дифференцироваться во все типы клеток как собственно зародыша, так и экстраэмбриональных тканей. Такие клетки получили название эмбриональных стволовых клеток. У растений в природных условиях (in vivo) тотипотентность могут проявлять и специализированные клетки. Пример тому - вегетативное размножение, в том числе наблюдаемое в результате развития растений из клеток листьев бегонии, узумбарской фиалки или каланхое. Тотипотентность у растений реализуется и при заживлении ран. В этом случае на раневой поверхности растений в результате неорганизованной пролиферации клеток происходит развитие каллуса (лат. callus - толстая кожа, мозоль). Образование каллуса можно наблюдать при прививках в местах срастания привоя и подвоя. Каллус способствует заживлению ран и первоначально состоит из недифференцированных клеток, начало которым на раневой поверхности дают клетки тканей, способные к дедифференциации (камбий, флоэма, молодые клетки ксилемы). Впоследствии в каллусе может иметь место вторичная дифференциация с образованием специализированных тканей и органов. Однако в природных условиях растения ряда систематических групп тотипотентность не проявляют. Ввиду высокой специализации клеток многие однодольные растения утратили способность к раневой реакции и вегетативному размножению. Возможность реализации супрессированной in vivo и активной тотипотентности предоставляется в условиях in vitro при выращивании фрагментов тканей, органов или клеток на искусственных питательных средах. Этот переход специализированных клеток к эмбриональным синтезам, последующему делению с образованием недифференцированных клеток, а затем и к повторной дифференциации осуществляется под действием экзогенных фитогормонов.

5. Клональное микроразмножение растений in vitro.

В природе существует два способа размножения растений: половой (семенной) и вегетативный. Эти способы имеют свои преимущества и недостатки. К недостаткам семенного размножения следует отнести генетическую пестроту получаемого посадочного материала и длительность ювенильного периода. При вегетативном размножении сохраняется генотип материнского растения и сокращается продолжительность ювенильного периода. Однако для большинства видов (в первую очередь для древесных пород) проблема вегетативного размножения остается до конца не решенной. Это обусловлено следующими причинами: 1) не все породы, даже на ювенильной стадии, могут размножаться вегетативным способом с требуемой эффективностью (дуб, сосна, ель, орехоплодные и др.); 2) практически невозможно с помощью черенкования размножать многие виды древесных пород в возрасте старше 10-15 лет; 3) не всегда удается получать стандартный посадочный материал (существует возможность накопления и передачи инфекции); 4) операции при размножении взрослых (древесных) растений с помощью прививок отличаются трудоемкостью и сложностью; 5) разработанные технологии не эффективны для получения достаточного количества генетически однородного материала в течение года. Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения - клонального микроразмножения (получение в условиях in vitro (в пробирке) неполовым путем растений, генетически идентичных исходному экземпляру). В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность, т.е. под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму. Для обозначения растений, полученных бесполым размножением, в 1903 г. Уэббер из Министерства сельского хозяйства США ввел термин клон от греч. clon - черенок (побег), пригодный для размножения. Клон - популяция клеток, - получение in vitro неполовым путем растений, генетически идентичных исходному. возникших из одной клетки посредством митоза, или группа растений, развившихся вегетативным или бесполым путем, все члены которой произошли из одной повторно культивируемой клетки. Клональное микроразмножение

6. Основные этапы клонального микроразмножения растений.

Процесс клонального микроразмножения можно разделить на четыре этапа:

1 - выбор растения-донора (донор - растение, часть которого вводится в культуру), изолирование эксплантов (эксплант - ткань, взятая из своего оригинального места и перенесенная в искусственную среду для роста и поддержания жизнедеятельности) и получение хорошо растущей стерильной культуры;

2 - собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества мериклонов (микропобегов);

3 - укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре (2-10 С);

4 - выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле .

Существует много методов клонального микроразмножения. Различные авторы, проводя индивидуальные исследования по влиянию условий культивирования эксплантов на процессы морфогенеза, наблюдали разные ответные морфогенетические реакции на изменение условий выращивания, что, в свою очередь, способствовало созданию новых классификаций методов клонального микроразмножения. В литературе предложены следующие методы микроразмножения растений: активация развития уже существующих в растении меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки стебля); индукция возникновения адвентивных почек непосредственно тканями экспланта; индукция соматического эмбриогенеза; дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани. Первый метод, используемый при клональном микроразмножении растений, - это активация развития уже существующих в растении меристем, основывающийся на снятии апикального доминирования. Это может быть достигнуто двумя путями: 1. Удаление верхушечной меристемы стебля (снятие апикального доминирования) и последующее микрочеренкование побега in vitro на безгормональной среде. Апикальное доминирование - подавление роста боковых почек растительного побега или наличие терминальной почки. 2. Добавление в питательную среду веществ цитокининового типа действия, индуцирующих развитие многочисленных пазушных побегов. Как правило, в качестве цитокининов используют 6-бензиламинопурин (БАП) или 6-фурфуриламинопурин (кинетин), а также 2-изопентениладенин (2-iр) и зеатин. Полученные таким образом побеги отделяют от первичного материнского экспланта (инокулюм (трансплант) - часть суспензионной или каллусной культуры, переносимой в свежую питательную среду) и вновь самостоятельно культивируют на свежеприготовленной питательной среде, стимулирующей пролиферацию пазушных меристем и возникновение побегов более высоких порядков

Активация развития уже существующих в растении меристем, основывающаяся на снятии апикального доминирования:

1 -снятие апикального доминирования и последующее микрочеренкование побега in vitro на безгормоналыюй среде;

2 - индуцированное развитие многочисленных пазушных побегов под действием веществ цитокининового типа действия В настоящее время этот метод широко используется в производстве безвирусного посадочного материала сельскохозяйственных культур, таких как технические (сахарная свекла, хмель, табак, топинамбур, стахис) и овощные (томаты, картофель, огурец, перец, тыква, спаржа и др.), а также для размножения культур промышленного цветоводства (гвоздика, хризантема, роза, гербера), тропических и субтропических растений (рододендрон, азалия, камелия, чай и др.), плодовых и ягодных культур (яблоня, слива, вишня, груша, виноград, малина, смородина, крыжовник и др.) и древесных растений (тополь, ива, ольха, береза, рябина, секвойя, туя, можжевельник и др.). Для некоторых сельскохозяйственных культур, таких как картофель, технология клонального микроразмножения поставлена на промышленную основу.

Применение метода активации развития существующих в растении меристем позволяет получать из одной меристемы картофеля более 105 растений в год, причем технология предусматривает получение в пробирках микроклубней - ценного безвирусного семенного материала.

Развитие растений из необычных точек происхождения, например, почечные или корневые ткани, возникающие из каллуса, или зародыши, развивающиеся из других источников, а не из зигот. Этот термин также может быть использован для описания агентов, загрязняющих клеточные культуры). Он основан на способности изолированных частей растения при благоприятных условиях питательной среды восстанавливать недостающие органы и таким образом регенерировать целые растения.

7. Экспланты: происхождение и их стерилизация.

С целью получения эксплантов для каллусной и опухолевой культур, микроклонального размножения, изучения гормональной регуляции используют стерильные проростки. Семена для проращивания высевают либо на воду, либо на питательную среду.

Растительные объекты перед стерилизацией тщательно отмывают проточной водой, иногда с моющими средствами, очищают от излишних тканей. С корнеплодов и корней снимают кожуру, с побегов – кору, с почек – кроющие чешуи.

Растительные экспланты стерилизуют растворами веществ, содержащими активный хлор (хлорамином, гипохлоритом Nа), бром (бромной водой), tween-20, перекисью водорода, спиртом, нитратом серебра, диацидом, антибиотиками. Следует подбирать такие концентрации стерилизующих агентов, которые не повреждали бы сами семена, не угнетали их всхожесть и обеспечивали максимальную стерильность.

Этиловый спирт часто применяют для предварительной стерилизации, протирая им поверхность материала или погружая материал на несколько секунд в абсолютный спирт. Иногда такой стерилизации достаточно, ее используют при работе с плодами, семенами, побегами, завязями.
Гипохлорит кальция (хлорная известь) используется в виде 5-7 % раствора для обработки почек, завязей, цветков, семян, побегов в течение 5-8 минут.

Гипохлорит натрия используется в виде 0,5-5 % раствора для обработки любых эксплантов в течение 1-20 минут. Это вещество является клеточным ядом, поэтому время стерилизации и концентрацию подбирают экспериментально. Например: для изолированных зародышей используют 2-3 % раствор в течение 10-15 минут, а для сухих семян 3-5 % раствор в течение 1 часа. Остатки гипохлорита натрия сначала удаляют 0,01 н HCl, а затем 8 раз промывают автоклавированной дистиллированной водой.

Хлорамин применяют в концентрации 1-6 %. Пыльники и молодые зародыши обрабатывают в течение 1-3 минут, сухие семена – 30-60 минут, затем промывают стерильной дистиллированной водой 2-3 раза.

Сулема – токсичное вещество и требует особой тщательности, как при хранении, так и при подборе концентрации для отдельных объектов. Для стерилизации зародышей используют 0,1 % раствор в течение 1-3 минут, для корней и клубнеплодов – до 10-20 минут.

Растворы, содержащие активный хлор используются 1 раз и готовят их непосредственно перед работой.

Диацид используется в 0,2 % растворе для стерилизации корнеплодов, семян, кусочков, тканей, верхушечных меристем, изолированных зародышей, пыльников. Диацид готовят, растворяя отдельно 330 мг этанолмеркурхлорида и 660 мг цетилпиридиния хлорида в горячей воде (330 мл), затем их смешивают и доводят объем жидкости до 1 л, добавляют несколько капель детергента твин-80; хранят в плотно закрытой колбе в темноте.

Антибиотики применяют для стерилизации растительного материала, инфицированного бактериями (ткани корончатогалловых опухолей). Наиболее часто применяют стрептомицин и тетрамицин 10-80 мг/л, ампициллин 200-400 мг/л, левомицитин, канамицин и другие.

В качестве стерилизующего агента применяют также перекись водорода, которая менее всего повреждает экспланты и после которой не требуется отмывка в стерильной воде, так как она быстро разлагается.

Стерилизацию эксплантов необходимо проводить в стерильных (асептических) условиях: в ламинарном боксе.

Колбы с эксплантами после помещаются в абсолютную темноту при комнатной температуре на неделю для выявления степени стерильности. Те колбы, в которых началось заражение, следует сразу удалять (Шевелуха В.С., 1998).

Снизить риск попадания вирусов в здоровые ткани можно путем применения предварительной термотерапии или химиотерапии исходных растений. Метод термотерапии применяется как в условиях in vivo, так и in vitro и предусматривает использование горячего сухого воздуха. Для объяснения механизма освобождения растений от вирусов в процессе термотерапии существуют различные гипотезы. Согласно одной из них при высоких температурах разрушаются белковая оболочка и нуклеиновая кислота вируса. Вторая гипотеза предполагает действие высоких температур на вирусы через метаболизм растений. При такой температуре начинает преобладать деградация вирусных частиц, а синтез их, наоборот, уменьшается. Растения, подвергающиеся термотерапии, помещают в термокамеры, где температура в течение первой недели повышается с 25 до 37 оС путем ежедневного увеличения температуры на 2 градуса. Все остальные режимы обязательно поддерживаются в оптимальном состоянии: освещенность, высокая относительная влажность воздуха, определенный фотопериод. Продолжительность термостатирования зависит от состава вирусов и их термостойкости. Если для гвоздики достаточно 10 - 12 недельного воздействия теплом, то для хризантемы этот период превышает 12 недель.

Помимо положительного действия высоких температур на освобождение от вирусов, выявлено аналогичное влияние их на точку роста и процессы морфогенеза некоторых цветочных культур (гвоздики, фрезии) в условиях in vitro. Высокие температуры увеличивают коэффициент размножения на 50 - 60%, повышают адаптацию пробирочных растений к почвенным условиям и позволяют получить больше безвирусных маточных растений.

Другой способ оздоровления - химиотерапия. В питательную среду, на которой культивируют апикальные меристемы, добавляют препарат вирозола в концентрации 20 - 50 мг/л, не больше. Это противовирусный препарат широкого спектра действия. Применение его позволяет увеличить число безвирусных растений с 40% до 80 - 100%.
Метод предполагает использование химических соединений - ингибиторов вирусов, которые добавляются в состав питательной среды. Наиболее часто для этих целей применяют 1 β- Д- рибофуранозил –1,2,4 – триазол – 3 карбоксимид ( коммерческое название виразол). Виразол стерилизуется путем фильтрации и добавляется в охлажденную среду. Концентрации препарата зависят от вида растений (1- 100 мг/л), длительность обработки подбирается эмпирически. По мере возрастания концентрации усиливается процесс элиминации вирусов, однако при концентрации выше 20-50 мг/ л уменьшается темп роста и может наблюдаться фитотоксический эффект. Виразол показал высокую эффективность при оздоровлении картофеля, черешни, сливы, малины, декоративных растений.

В Белорусском НИИ картофелеводства успешно испытан метод оздоровления посадочного материала картофеля на основе применения 2–5- олигоаденилатов – соединений, относящихся к классу олигонуклеотидов и являющихся посредниками противовирусного действия интерферона. Для 2-5– олигоаденилатов обнаружен большой спектр биологической активности, включая противовирусную, фитостимулирующую, цитокинино подобную и др (Калашникова Е.А. 2001).

8. Питательные среды для клонального размножения, каллусообразования и морфогенеза in vitro.

Изолированные клетки и ткани культивируют на многокомпонентных питательных средах. Они отличаются по составу, но, в состав всех сред входят необходимые растениям макро- и микроэлементы, углеводы, витамины,фитогормоны и их синтетические аналоги. Углеводы (сахароза или глюкоза) входят в состав любой питательной смеси в концентрации 2–3 %. Они необходимы в качестве питательного компонента, так как большинство каллусных тканей лишено хлорофилла и неспособно к автотрофному питанию.

Поэтому их выращивают в условиях рассеянного освещения или в темноте. Исключение составляет каллусная ткань мандрагоры, амаранта и некоторых других растений.Обязательными компонентами питательных сред должны быть ауксины ,вызывающие дедифферинцировку клеток экспланта индуцирующие клеточные деления. При изменении соотношения между этими фитогормонами и при добавлении других фитогормонов могут быть вызваны разные типы морфогенеза.

Высокое содержание нитратов, ионов аммония, калия, фосфатов способствуют быстрому росту клеток. Истощение среды значительно снижает рост и процессы вторичного метаболизма, однако низкое содержание фосфатов питательной среде стимулирует синтез вторичных метаболитов. Так культивирование

Каллусов солодки голой на среде с половинной концентрацией азота и фосфора в темноте увеличивает содержание фенольных соединении в 1,6 раза по сравнению с каллусами, растущими на полной питательной среде. В среду могут быть добавлены эндоспермы незрелых зародышей (кокосовый орех, конский каштан), патока некоторых деревьев, различные экстракты (солодовый, дрожжевой, томатный сок). Так, добавление

в питательную среду отдельных фракций кокосового молока не давало никаких результатов, а нефракционированный эндосперм вызывал деление клеток. При приготовлении твёрдых питательных сред для поверхностного выращивания каллусных тканей используют очищенный агар-агар полисахарид, получаемый из морских водорослей. Среда Мурасиге и Скуга используется для образования каллусов, поддержания неорганизованного каллусного роста, индукции морфогенеза у большинства двудольных растений. Так, изменение соотношения ауксина и кинетина приводит к образованию корней(преобладание

ауксина) или стеблевых культур (преобладание кинетина).

Среда Гамборга и Эвелега подходит для культивирования клеток и тканей бобовых растений и злаков, среда Уайта обеспечивает укоренение побегов и нормальный рост стебля после регенерации, а среда Нича и Нич пригодна для андрогенеза в культуре пыльников.