реферат: Вакцина. РЕФЕРАТ. 1 Генноинженерные вакцины
 Скачать 123.46 Kb.
|
|
2.1. Синтетические пептидные вакцины Синтетические пептидные вакцины могут содержать различные эпитопы, способные формировать иммунитет к разным видам инфек- ций. Отличаются высокой степенью стандартности, безопасны, одна- ко слабо иммуногенны и требуют применения эффективных адъю- вантов. Идея использования синтетических пептидов в качестве 12 вакцин родилась при изучении клеточных и молекулярных механиз- мов развития иммунитета, прежде всего исследования начальных этапов развития иммунитета − процессинга антигена в вспомогатель- ных клетках и презентации антигена Т-клеткам. Вирусные и бактерийные пептиды, образующиеся из персисти- рующих в клетках возбудителей, взаимодействуют с антигенами гис- тосовместимости класса I и индуцируют прежде всего цитотоксиче- ские CD8 Т-клетки. Экзогенные антигены, попадающие в клетку в составе лизосом, расщепляются до пептидов, которые в комплексе с антигенами гистосовместимости класса II активируют СО4 Т-хел- перы. В 1974 г. М. Села впервые описал искусственно полученный пептид, вызывающий образование антител к яичному лизоциму. При определенных условиях синтетические пептиды могут обладать такими же иммуногенными свойствами, как и естественные антиге- ны, выделенные из возбудителей инфекционных заболеваний. Для получения хорошего иммунного ответа необходимо, чтобы синтетический антиген содержал на менее 8 аминокислотных остат- ков, хотя в структуру антигенной детерминанты могут входить 3−4 аминокислоты. Минимальный молекулярный вес такой детерми- нанты составляет около 4000 кД. Получены многочисленные виды искусственных антигенов: ли- нейные полимеры, состоящие из L-аминокислот, разветвленные мно- гоцепочечные сополимеры, конъюгаты различного рода пептидов с аминокислотами гомополимерами. Синтезированы и испытаны полисахариды, аналогичные есте- ственным антигенам, например сальмонеллезным полисахаридам. Молекула синтетических вакцин может содержать разнородные эпи- топы, которые способны формировать иммунитет к разным видам инфекций. Экспериментальные синтетические вакцины получены против: дифтерии, холеры, стрептококковой инфекции, гепатита В, гриппа, ящура, клещевого энцефалита, пневмококковой, сальмонеллезной инфекций. Несмотря на значительные успехи в теоретическом обоснова- нии возможности использования синтетических пептидов для созда- ния вакцин, ни один препарат такого типа не зарегистрирован в меж- дународной медицинской практике. Однако есть все основания считать, что синтетические пептиды найдут применение в качестве вакцин. 13 У синтетических пептидов нет недостатков, характерных для живых вакцин (реверсия патогенных свойств, остаточная вирулент- ность, неполная инактивация и т.п.). Синтетические вакцины отли- чаются высокой степенью стандартности, обладают слабой реакто- генностью, они безопасны, с помощью таких вакцин можно избежать развития аутоиммунных процессов при иммунизации, а при исполь- зовании доминантных пептидов можно получить вакцины против возбудителей с высокой степенью изменчивости. ВОЗ одобрила рекомендации по разработке и контролю синте- тических пептидных вакцин (1997). Прежде всего должен быть де- тально отработан метод искусственного синтеза выбранных пептидов и получены доказательства устойчивости такого синтеза. Должны быть идентифицированы отдельные пептиды, определены модифи- цирующие гликозильные, липидные и другие группировки, охаракте- ризованы примеси, которые могут быть при синтезе пептидного мо- номера, описаны методы его очистки. Все контрольные измерения необходимо производить с использованием референс-препаратов. Следует определить лимиты конечной концентрации всех добавок (консерванты, стабилизаторы и пр.). Консерванты не добавляются в препараты, расфасованные по одной дозе. Синтетические пептиды обладают слабой иммуногенностью. Для их стабилизации, доставки к иммунокомпетентным клеткам и стимуляции иммунного ответа необходим носитель или какой-либо другой адъювант (иммуностимулирующий комплекс, микросферы, липосомы и пр.). Носитель не только помогает пептиду, он способен индуцировать ответ на себя, но не должен доминировать над ответом к пептиду и нарушать его специфичность. Необходимо изучить, на какие иммунокомпетентные клетки действует конъюгат пептида с носителем. На стадии конъюгирования пептида с носителем надо следить за постоянством весовых соотношений пептида с носителем, которые не должны колебаться от серии к серии. Носитель должен иметь соб- ственную спецификацию по характеристике его биологических свойств и структуры, включая молекулярные параметры. При использовании других адъювантов следует описать способ взаимодействия пептида с адъювантом и изучить процесс десорбции пептида с адъюванта в течение срока годности препарата. Конъюгирование и полимеризация, необходимые для получе- ния вакцин, не должны вызывать побочных реакций у эксперимент- ных животных и человека. Образующиеся антитела должны быть 14 проверены на перекрестные реакции с антигенами из различных тка- ней человека. Все химические и биологические реагенты, используемые в процессе получения вакцины, должны удовлетворять требованиям международной или национальной фармакопеи. Доклиническая фаза изучения пептидных вакцин должна включать биологические, био- химические, иммунологические, токсикологические, гистопатологи- ческие исследования, испытания разных доз и схем введения препа- рата, получение доказательств его стабильности и безвредности. В рамках рутинного контроля определяются пирогенность, стериль- ность, иммуногенность и другие параметры безопасности и активно- сти вакцин. 2.2. ДНКвакцины ДНК-вакцины − вакцины из плазмидных ДНК, кодирующих протективные антигены возбудителей инфекционных заболеваний. Такая ДНК при введении в организм проникает в ядро клетки, дли- тельное время существует вне хромосом без репликации, транскри- бируется и экспрессирует соответствующие антигены, вызывающие в организме формирование T- и B-клеточного иммунитета. Идея использовать фрагменты ДНК для вакцинации появилась в 1950−60-е гг. После серии опытов было установлено, что генетиче- ская информация ДНК сохраняет способность транскрибироваться и транслироваться после переноса в другую клетку. В том же году обнаружили, что введение животным генома вируса полиомиелита стимулирует выработку антител. Позже активацию гуморального иммунитета показали для молекул ДНК, полученных из неинфекци- онных агентов. Начиная с 1990-х гг. научные лаборатории начали все активнее исследовать иммуностимулирующие свойства ДНК. В 1992 г. Танг вместе с коллегами показал, что ген гормона роста человека, встроенный в плазмиду, стабильно экспрессируется в организме мы- ши, а синтезированный гормон распознается иммунной системой как антиген и стимулирует выработку антител. Процесс ввода плазмид- ной ДНК для стимуляции гуморального иммунитета был назван Тан- гом «генетическая иммунизациия». Однако уже в следующем году другая группа ученых заявила, что введение плазмиды, кодирующей белки вируса гриппа, вызывает как гуморальный, так и клеточный ответ. Индуцирование обеих ветвей иммунитета в том же году обна- ружили и для плазмиды, содержавшей гены ВИЧ. С 1995 г. начали 15 появляться данные, что ДНК-вакцинация способна активировать им- мунную систему против раковых заболеваний. Около 20 лет назад состоялись первые клинические испытания ДНК-вакцин, которые прежде всего должны были продемонстрировать безопасность нового метода. Пациентам вводили гены ВИЧ, вируса гриппа, герпеса, гепа- тита B, возбудителя малярии. Результаты всех тестов оказались вполне обнадеживающими: ДНК-вакцины стабильно экспрессирова- лись, провоцировали иммунный ответ и не вызвали серьезных побоч- ных эффектов, что стало толчком для их дальнейшего исследования. Конструирование ДНК-вакцины. Структура ДНК-вакцины создана на основе плазмидного вектора, ориджин (с англ. origin) – точка начала репликации. По структуре ДНК-вакцина – это встроенная в вектор нуклео- тидная последовательность, кодирующая определенный антиген или антигены. Вектором в генной инженерии называют молекулу нук- леиновой кислоты, которая служит для доставки генетического мате- риала в клетки и обеспечивает его репликацию или экспрессию. Ра- нее для транспортировки генов в клетку применяли векторы на основе вирусов: модифицированного (ослабленного) вируса нату- ральной оспы, аденовирусов и ретровирусов. Вирусные векторы яв- ляются достаточно эффективными, однако имеют значительную ве- роятность развития побочных эффектов, связанную с относительно высокой иммуногенностью самого вектора. Поэтому на сегодня в ка- честве вектора чаще используют бактериальную плазмиду – неболь- шую стабильную кольцевую молекулу ДНК, способную к автоном- ной репликации. Сама по себе плазмида не вызывает нужного специфического иммунного ответа, для этого в нее вшивают гены им- муногенных белков. Также ДНК-вакцина должна содержать регулятор- ные последовательности, необходимые для экспрессии генов в клетках эукариот. Готовую ДНК-конструкцию доставляют в бактериальную клетку, где наращивается количество ее копий. После этого проводят выделение и очистку плазмид, которые несут нужную вставку. Дизайн плазмидного вектора. Важным этапом создания ДНК- вакцин является дизайн (конструирование) вектора. Обязательными структурами плазмидного вектора являются сайты рестрикции, се- лективный маркер и точка начала репликации ДНК-вакцины в бакте- риальной клетке. Чтобы осуществлялся синтез антигена, ДНК-вакци- на должна содержать промотор и сигнал полиаденилирования. Промотор является важным фактором эффективности вакцины, по- скольку определяет силу иммунного ответа: чем больше экспрессия 16 гена, кодирующего вирусный или опухолевый антиген, тем сильнее иммунный ответ. Чаще всего используют промотор вируса SV40 или цитомегаловируса (CMV). Для стабилизации мРНК-транскриптов в плазмиду встраивают сигнал полиаденилирования, чаще всего по- лученный из гена гормона роста быка (BGH) или вируса SV40. В ка- честве селективных маркеров выбирают бактериальные гены устой- чивости к антибиотикам; часто это ген устойчивости к канамицину. При конструировании ДНК-вакцин наиболее популярна точка начала репликации Escherichia coli. Выбор гена для иммунизации. Вектор является важным ком- понентом ДНК-вакцины, однако ее иммуногенность определяется именно вставкой – последовательностью ДНК, которая кодирует ан- тиген. Среди вирусных антигенов для иммунизации лучше всего подходят белки слияния – это относительно консервативные белки, которые обеспечивают проникновение вируса в клетку. Для вакцина- ции против граммположительных бактерий в плазмидный вектор це- лесообразно встраивать гены тех бактериальных белков, которые оп- ределяют патогенез заболевания. Среди белков грамотрицательных бактерий высокую иммуногенность имеют порины. Для терапевтиче- ских противоопухолевых ДНК-вакцин используют белки-маркеры раковых клеток. Способы доставки ДНК-вакцин в клетку. Готовую вакцину нужно доставить в организм человека или животного, где ее точка назначения – антигенпредставляющие клетки (АПК) – макрофаги, дендритные клетки, B-лимфоциты. Здесь будет происходить синтез и посттрансляционная модификация антигена, после чего он будет встроен в мембрану клетки, чтобы привлечь внимание иммунной системы. Основная проблема заключается в доставке достаточного количества плазмиды в АПК. Методы доставки генетического мате- риала в клетку обычно разделяют на две группы: вирусные и неви- русные. Поскольку вирусные векторы имеют ряд существенных не- достатков, в данном разделе представлены лишь невирусные методы доставки ДНК-вакцин. Микроинъекция. В начале 1990-х гг. для введения ДНК в клет- ку наиболее распространенными были внутримышечные микроинъ- екции, что обусловлено простотой метода. Для этого ДНК растворя- ют в воде или изотоническом растворе, при необходимости добавляют адъювант (вещество, которое усиливает иммунный ответ). Далее с помощью тонкой стеклянной трубки раствор вводят в мы- шечную ткань, где роль АПК выполняют дендритные клетки. Попав 17 в ядро дендритной клетки, вакцина начинает экспрессировать, и про- исходит синтез белков-антигенов. С помощью микроинъекций ДНК также можно вводить подкожно, в тимус, печень, опухолевую ткань, однако именно в мышечной ткани наблюдается наиболее длительная (до года) экспрессия ДНК-вакцины. Благодаря высокой концентрации клеток Лангерганса (подтип дендритных клеток), привлекательной мишенью для ДНК-вакцина- ции является кожа. Для интрадермального (подкожного) введения используют массив из микроигл, длина которых несколько сотен микрон. Существуют различные варианты интрадермальной вакци- нации. Простейший включает разрыхление массивом микроигл рого- вого слоя кожи (внешний слой кожи, обычно 10−20 мкм), чтобы увеличить ее проницаемость для дальнейшего местного введения раствора ДНК. Более эффективно использование микроигл, покры- тых сухой вакциной, которая растворяется уже под кожей [3]. Эффективность этого метода обычно низкая, поскольку сначала ДНК попадает в межклеточное пространство, а уже потом включает- ся в клетки. Принцип действия электропорации. Электрический ток пере- группировывает липиды плазмалеммы таким образом, что образуется гидрофильный (сверху) или гидрофобный (снизу) канал. Прохожде- ние гидрофильной молекулы ДНК возможно только через верхний вариант поры. Электропорация (рис. 1) – традиционный подход для доставки ДНК в бактериальные клетки и культуры клеток, который базируется на применении электрического импульса. Такой импульс создает по- ры в клеточной мембране, что способствует вхождению отрицатель- но заряженной ДНК. Этот способ был заимствован для доставки ДНК-вакцины в организм животных и человека и позволяет значи- тельно повысить эффективность обычной инъекции Прибор для электропорации имеет источник электрического то- ка и одноразовую сетку, которая состоит из шприца и игл-электро- дов. Шприц вводит вакцину в мышечную ткань, а электроды создают электрическое поле, которое облегчает вхождение ДНК в миоциты и дендритные клетки. На сегодня разработаны устройства, которые позволяют повысить эффективность вакцинации в 1000 раз по срав- нению с обычной инъекцией. Электропорацию можно применять как для внутримышечного, так и для подкожного введения ДНК-вак- цины. Недостатками являются незначительная болезненность в месте инъекции, потребность в специализированных устройствах. Вместо электрического поля можно использовать магнитное. Такие устрой- ства действуют по тому же принципу, однако в этом случае процеду- ра является полностью безболезненной и меньше повреждает клетки. Действие электрического поля не только усиливает поглощение ДНК-вакцины клетками, но и стимулирует выработку иммунного от- вета. Применение электропорации приводит к незначительному по- вреждению ткани – развивается локальный воспалительный процесс. Поврежденные клетки выделяют хемокины, поэтому к ним направ- ляются макрофаги, лимфоциты и дендритные клетки. Увеличение концентрации иммунных клеток в месте введения вакцины повышает ее эффективность [6]. Сонопорация – метод переноса чужеродной ДНК в клетки с помощью ультразвука. Ультразвук увеличивает проницаемость кле- точной мембраны, вследствие чего экзогенная ДНК легче проникает в клетку. Впервые сонопорация для переноса генов в клетку была применена в 1986 г. Этот метод применяется для ввода молекул ДНК в клетки роговицы, мозга, костной ткани, почек, поджелудочной же- лезы, эмбриональной ткани, скелетной и сердечной мышц. Относи- тельно других методов сонопорация является малоисследованной, необходимо еще немало усилий, чтобы повысить ее эффективность, особенно на уровне целого организма. Баллистическая трансфекция. Баллистическая трансфекция основывается на обстреливании (бомбардировке) органов и тканей микрочастицами тяжелых металлов (золото, вольфрам) диаметром 1−3 мкм, покрытых молекулами ДНК. Введенная таким образом ДНК-вакцина экспрессируется в клетках-мишенях, а их продукты попадают в кровь. Для придания ускорения частицам используется похожее на стрелковое оружие устройство – генный пистолет, или генную пушку. Микрочастицы проходят через клеточные мембраны и переносят генетическую конструкцию непосредственно в ядро 19 клетки. Глубина проникновения микрочастиц, как правило, невели- ка − до 1 мм, поэтому метод применяют преимущественно для транс- фекции кожи или прилегающей хрящевой ткани. Особые условия обстрела позволяют микрочастицам проникать на глубину до 4−5 мм и переносить генные конструкции в волокна поперечно- полосатых мышц. Обычно клетки, находящиеся непосредственно по центру выстрела, погибают, в то время когда в зоне 0,6−1 см от цен- тра находятся наиболее удачно протрансформированные клетки. Эту технологию называют также биобаллистикой или биолистикой. Первый генный пистолет был создан группой ученых в период 1983−1986 гг. с целью трансформации клеток растений. Это был пис- толет, разработанный на основе устройства для автоматического за- бивания гвоздей. На вольфрамовый шар наносили ДНК с репортер- ным (маркерным) геном и выстреливали им в чашку Петри. Экспрессия репортерного гена свидетельствовала об эффективности иммунизации. На сегодня для доставки ДНК используют частицы из золота или серебра, так как они не являются токсичными для клетки, в отличие от вольфрамовых. Действие высокого давления. В 1999 г. были разработаны инъекционные приборы, которые способны вводить ДНК-вакцину без использования иглы. Такие устройства работают благодаря силе Лоренца: небольшой мощный магнит создает значительное давление, проводит в действие поршень, который выбрасывает лекарственный препарат со скоростью звука. Изменяя силу тока, можно выбирать глубину инъекции и дозировать лекарства. Процедура совершенно безболезненна и раньше использовалась для введения инсулина больным диабетом и при проведении масштабных вакцинаций. Су- щественным недостатком этого метода является то, что высокое дав- ление теоретически может изменять структуру вводимых молекул. Тем не менее данную технологию ввода продолжают совершенство- вать, и на сегодня разработаны приборы, которые могут доставить ДНК на глубину до 16 мм, в составе живого бактериального вектора. Живые бактериальные векторы − это штаммы сальмонелл, шигелл или листерии, которые несут мутации в генах биосинтеза или инва- зии, что устраняет их патогенность и способность сохранять свою жизнеспособность в организме хозяина или окружающей среде. Вза- мен в геном бактерий встраивают нужные гены иммуногенных про- теинов. Ослабленная бактерия вводится в организм пероральным пу- тем (через рот, путем проглатывания) или интраназально (путем впрыска в носовое отверстие), поэтому этот способ вакцинации не 20 требует никакого оборудования. Кроме того, такое введение стиму- лирует иммунный ответ слизистой оболочки, что важно, поскольку большинство патогенов попадают в организм через ротовое и назаль- ное отверстия. Минуя желудок, ослабленная бактерия попадает в тон- кий кишечник. Далее бактерия проникает в Пейеровы бляшки – лим- фоузлы кишечника. Оказавшись в середине Пейеровых бляшек, бактерии становятся мишенью для макрофагов и подвергаются фаго- цитозу. В цитоплазме макрофагов происходит высвобождение бакте- рией ДНК-вакцины, после чего ДНК попадает в ядро, а бактерия обезвреживается иммунной системой. Антиидиотипические вакцины. Антиидиотипические антите- ла являются зеркальным отражением антигена и поэтому способны вызывать образование антител и цитотоксических клеток, реагирую- щих с антигеном. Вакцины на основе антиидиотипических антител безопасны, так как идиотипы являются естественными эндогенными регуляторами иммунного ответа. Вакцины содержат продукты генов гистосовместимости. Каж- дой инфекции соответствует свой набор антигенов гистосовместимо- сти, отвечающий за высокий уровень иммунного ответа. Отсутствие на клетках таких антигенов является одной из основных генети- ческих причин слабой иммунной реакции. Введение в организм молекул гистосовместимости, несущих пептиды, соответствующие эпитопам инфекционных агентов, будет способствовать усилению иммунитета. 22 Растительные вакцины. Продемонстрировано, что в листьях трансгенного табака могут нарабатываться белки инфекционных ви- русов. После очистки такие белки можно использовать как компо- ненты вакцин. Немаловажное значение имеет высокая экономичность растительных вакцин и возможность их применения с пищей. Мукозальные вакцины. Один из подходов к созданию таких вакцин заключается в разработке средств, препятствующих колони- зации возбудителей инфекций на поверхности слизистых оболочек. Основу таких вакцин может составить белок адгезии на концах бак- териальных пилей, с помощью которых бактерии прикрепляются к поверхности слизистой [6]. |