Ответы на коллок по микробиологии МГМУ. Микра 4 коллок. 1. Иммунитет. Определение, виды и их сравнительная характеристика
 Скачать 0.68 Mb.
|
|
Радиоиммунный анализ (РИА), также радиоиммунологический или изотопный иммунологический анализ, ( англ. Radioimmunoassay, RIA) — метод количественного определения биологически активных веществ в биологических жидкостях, основанный на конкурентном связывании искомых стабильных и аналогичных им меченных радионуклидом веществ со специфическими связывающими системами, с последующей детекцией на специальных счетчиках — радиоспектрометрах. Впервые метод был разработан Соломоном Берсоном и Розалин Сасмен Ялоу в 1950-х годах. С помощью этого метода они изучали клиренс инсулина у больных диабетом . Р. Ялоу получила за это Нобелевскую премию в 1977 году Для метки антител или антигенов чаще всего используется изотоп йода, который имеет период полураспада 60 дней и высокую удельную радиоактивность 55. Реакция связывания комплемента Антитела, взаимодействуя с соответствующим антигеном, свя- зывают добавленный комплемент (1-я система). Индикатором свя- зывания комплемента служат эритроциты, сенсибилизированные гемолитической сывороткой, т.е. антителами к эритроцитам (2-я система). Если комплемент не фиксируется в 1-й системе, т.е. не происходит реакция антиген—антитело, то сенсибилизированные эритроциты полностью лизируются (отрицательная реакция). При связывании комплемента иммунными комплексами 1-й системы после добавления сенсибилизированных эритроцитов гемолиз отсутствует (положительная реакция). Реакция связывания компле- мента используется для диагностики инфекционных болезней (го- нореи, сифилиса, гриппа и др.). 56. Реакция нейтрализации Микробы и их токсины оказывают повреждающее действие на органы и ткани организма человека. Антитела способны связывать- ся с этими повреждающими агентами и блокировать их, т.е. ней- трализовать. На этой особенности антител основана диагностиче- ская реакция нейтрализации. Ее проводят путем введения смеси антиген—антитело животным или в чувствительные тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). Например для обнаружения токси- нов в материале больного животным 1-й группы вводят материал больного. Животным 2-й группы вводят аналогичный материал, предварительно обработанный соответствующей антисывороткой. Животные 1-й группы при наличии токсина в материале погиба- ют. Вторая группа животных выживает, повреждающее действие токсина не проявляется, так как происходит его нейтрализация. 57. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ,методКунса) Этот метод используется для экспресс-диагностики. С его помо- щью можно выявлять как микробные антигены, так и антитела. Прямойметод РИФ — иммунная реакция взаимодействия анти- тел с антигенами, причем антитела метят флюорохромом — ве- шеством, способным при попадании света определенной длины волны испускать кванты света также определенной длины волны. Особенность постановки этого метода заключается в необходимо- сти удаления непрореагировавших компонентов, чтобы исключить выявление неспецифического свечения. Для этого проводят от- мывание от непрореагировавших антител. Результаты оценивают с помощью люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обра- ботанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся на тем- ном фоне по периферии клетки. Непрямой метод РИФ используется чаще-предыдущего. Эта реакция проводится в два этапа. На первом этапе антигены взаимодейстиуют с соответствующими антителами, образуя иммунные комплексы. Все компоненты, которые не прореагировали (т.е. не в составе иммунных комплексов), должны быть удалены отмывани- ем. На втором этапе образовавшийся комплекс антиген—антитело выявляется с помощью флюорохромированной антиглобулино- вой сыворотки. В результате образуется комплекс микроб + анти- микробные кроличьи антитела + антитела к иммуноглобулинам кролика, меченные флюорохромом. Результаты оценивают с по- мощью люминесцентного микроскопа. 58. Иммуноферментный метод или анализ ИФА — наиболее распространенный современный метод, ис- пользуемый для диагностики вирусных, бактериальных, прото- зойных инфекций, в частности для диагностики ВИЧ-инфекции, вирусных гепатитов и др. Модификаций ИФА очень много. Широко используется твердофазный неконкурентный вариант ИФА. Его проводят в 96-луночных полистироловьгх планшетах (твердая фаза). При проведении реакции необходимо на каждом этапе отмывать непро- реагировавшие компоненты. При определении антител в лунки, на которых сорбированы антигены, вносят исследуемую сыворотку крови, затем антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом. Проявляют реакцию, добавляя субстрат для фермента. В присут- ствии фермента субстрат изменяется, причем фермснтсубстратный комплекс подбирают таким образом, чтобы образующийся в ре- акции продукт был цветным. Таким образом, при положительной реакции наблюдается изменение цвета раствора. Для определения антигенов твердофазный носитель сенсибилизируется антителами, затем последовательно вносятся исследуемый материал (антигены) и сыворотка к антигенам, меченная ферментом. Для проявления реакции вносят субстрат для фермента. Изменение цвета раствора происходит при положительной реакции. Иммуноблоттинг Этот метод основан на сочетании электрофореза и ИФА. При проведении иммуноблоттинга (блоттинг от англ. blot — пятно) сложную смесь антигенов вначале подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле. Полученные фракционированные анти- генные пептиды переносят на нитроцеллюлозную мембрану. Затем блоты обрабатывают антителами к специфическому антигену, ме- ченными ферментом, т.е. проводят ИФА блота. Иммуноблоттинг используют в диагностике инфекций, например ВИЧ 59. Иммунная электронная микроскопия Метод заключается в микроскопировании в электронном ми- кроскопе вирусов (реже других микробов), предварительно об- работанных соответствующей иммунной сывороткой, меченной электроннооптически-плотными препаратами, например ферри- тином — железосодержащим белком 60. Проточная цитометрия Клетки крови дифференцируют на основе лазерной цитофлюо- рометрии. Для этого искомые клетки окрашивают флюоресциру- ющими моноклональными антителами к CD-антигенам. Образец крови после обработки мечеными антителами пропускают через тонкую трубку и через него пропускают лазерный луч, который возбуждает свечение флюорохрома. Интенсивность флюоресцен- ции коррелирует с плотностью антигенов на поверхности клеток и может быть количественно измерена с помощью фотоумножителя. Полученные результаты преобразуются в гистограмму.Проточную цитометрию применяют для определения иммун- ного статуса (содержание основных популяций лимфоцитов, со- держание внутриклеточных и внеклеточных цитокинов, функциональная активность NK-клеток, активность фагоцитоза и др.). 61. Серологические реакции, используемые для диагнос тики вирусных инфекций. Иммунные реакции используют при диагностических и иммунологических исследованиях у больных и здоровых людей. С этой целью применяют серологические методы, т. е. методы изучения антител и антигенов с помо- щью реакций антиген—антитело, определяемых в сыворотке крови и других жидкостях, а также тканях организма. Обнаружение в сыворотке крови больного антител против антигенов возбудителя позволяет поставить диагноз болезни. Серологические исследования применяют также для идентификации антигенов микробов, различных биологически активных веществ, групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, иммунных комплексов, рецепторов клеток и др. При выделении микроба от больного проводят идентификацию возбудителя путем изучения его антигенных свойств с помощью иммунных диагностических сывороток, т. е. сывороток крови гипериммунизированных животных, содержащих специфические антитела. Это так называемая серологическая идентификация микроорганизмов. В микробиологии и иммунологии широко применяются реакции агглютинации, преципитации, нейтрализации, реакции с участием комплемента, с использованием меченых антител и антигенов (радиоиммунологический, иммуноферментный, иммунофлюоресцентный методы). Перечисленные реакции различаются по регистрируемому эффекту и технике постановки, однако, все они основаны на реакции взаимодействия антигена с антителом и применяются для выявления как антител, так и антигенов. Реакции иммунитета характеризуются высокой чувствительностью и специфичностью. Особенности взаимодействия антитела с антигеном являются основой диагностических реакций в лабораториях. Реакция in vitro между антигеном и антителом состоит из специфической и неспецифической фазы. В специ- фическую фазу происходит быстрое специфическое связывание активного центра антитела с детерминантой антигена. Затем наступает неспецифическая фаза — более медленная, которая проявляется видимыми физическими явлениями, например образованием хлопьев (феномен агглютинации) или преципитата в виде помутнения. Эта фаза требует наличия определенных условий (электролитов, оптимального рН среды). Связывание детерминанты антигена (эпитопа) с активным центром Fab- фрагмента антител обусловлено ван-дер-ваальсовыми силами, водородными связями и гидрофобным взаимодействием. Прочность и количество связавше- гося антигена антителами зависят от аффинности, авидности антител и их валентности. 62. Диагностикумы. Получение, применение. В диагностических целях при обнаружении антител в сыворотке крови больных, реконвалесцентов и бактерионосителей используются серологические реакции. Для постановки таких реакций применяются диагностикумы - препараты, содержащие взвесь обезвреженных микроорганизмов или определенные антигены. Необходимость использования диагностикумов для серологических реакций связана не только с явным их преимуществом перед живыми культурами микробов (безопасность в работе), но еще и потому, что для приготовления диагностикумов подбираются штаммы микроорганизмов с высокой чувст- вительностью к антителам и способностью длительно сохранять антигенные свойства. Для инактивации микроорганизмов при приготовлении диагностикумов чаще всего используются химические вещества, особенно формалин, являющийся лучшим консервантом. Убитые нагреванием микробы хуже сохраняют антигенные свойства и применяются редко. В серологических реакциях (реакции агглютинации, реакции пассивной гемагглютинации, реакции связывания комплемента, реакции торможения гемагглютинации) для выявления специфических антител применяются: бактериальные, эритроцитарные и вирусные диагностикумы. Бактериальные диагностикумы могут содержать инактивированную микробную взвесь или отдельные антигенные компоненты бактерий: О, Н или Vi-антигены и используются в реакциях агглютинации. Эритроцитарные диагностикумы представляют собой эритроциты (обработанные танином или формалином) с адсорбированными на них антигенами, извлеченными из бактерий, и применяются в РПГА (реакции пассивной гемагглютинации). В том случае, когда РПГА используется для выявления антигена в выделениях больных, в тканях и др., применяют «антительные диагностикумы», т. е. эритроциты, сенсибилизированные антителами. Вирусные диагностикумы — препараты, содержащие инактированные вируссодержащие жидкости (культуральные, из куриных эмбрионов или организма животных, зараженных соответствующим вирусом), применяются в РСК (реакции связывания комплемента), реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и реакции нейтрализации. В настоящее время в лабораториях используются следующие диагностикумы. 1. Бактериальный диагностикум сальмонелл тифа. Применяется в реакции агглютинации для обнаружения антител в сыворотке больных. 2. Сальмонеллезные О-диагностикумы содержат О-антигены различных групп сальмонелл (инактивированных 15%-ным раствором глицерина). Применяются для выявления О-антител при сальмонеллезных инфекциях в реакции агглю- тинации с сывороткой больных. 3. Сальмонеллезные Н-монодиагностикумы. Используются в реакции агглютинации для определения заболевания в прошлом (анамнестическая реакция агглютинации) и реже с диагностической целью. 4. Vi — брюшнотифозный диагностикум. Применяется в реакции агглютинации при выявлении брюшнотифозного бактерионосительства. 5. Единый бруцеллезный диагностикум — взвесь бруцелл (инактивированных фенолом), подкрашенная метиленовым синим. Применяется для определения антител в сыворотках крови больных бруцеллезом людей и животных в реакциях агглютинации Райта и Хеддльсона. 6. Эритроцитарный сальмонеллезный О-диагностикум — взвесь эритроцитов с адсорбированными на них О-антигенами различных групп сальмонелл. Используется для постановки РПГА с сывороткой больного при уточнении клинического диагноза сальмонеллезной инфекции. 7. Эритроцитарный Vi-диагностикум — эритроциты, сенсибилизированные очищенным Vi-антигеном S. typhi, применяется в РПГА при выявлении брюшнотифозного бактерионосительства. 8. Гриппозный диагностикум представляет собой аллантоисную жидкость инфицированных вирусом гриппа (типов А, В) куриных эмбрионов и инактивированную мертиолатом или формалином. Диагностикумы необходимы при постановке РТГА с парными сыворотками больных для уточнения клинического диагноза и циркулирующего типа вируса гриппа. 9. Диагностикум вируса клещевого энцефалита получают из суспензии мозга белых мышей, зараженных вирусом клещевого энцефалита. Суспензию подвергают центрифугированию (для осветления) и инактивируют химическими веществами. Диагностикум используется в РТГА и РСК с сывороткой больных при диагностике заболевания. 63. Моноклональные антитела. Получение, применение. Моноклональные антитела. Каждый В-лимфоцит и его потомки, образовавшиеся в результате пролиферации (т.е. клон), способны синтезировать антитела с паратопом строго определенной специфичности. Такие антитела получили название моноклональных. В природных условиях макроорганизма получить моноклональные антитела практически невозмож- но. Дело в том, что на одну и ту же антигенную детерминанту одновременно реагируют до 100 различных клонов В-лимфоцитов, незначительно различающихся антигенной специфичностью рецепторов и, естественно, аффинностью. Поэтому в результате иммунизации даже монодетерминантным антигеном мы всегда получаем поликлональные антитела. Принципиально получение моноклональных антител выполнимо, если провести предварительную селекцию антителопродуцирующих клеток и их клонирование (т.е. выделение отдельных клонов в чистые культуры). Однако задача осложняется тем, что В-лимфоциты, как и другие эукариотические клетки, имеют ограниченную продолжительность жизни и число возможных митотических делений. Проблема получения моноклональных антител была успешно решена Д. Келлером и Ц. Милыптейном. Авторы получили гибридные клетки путем слияния иммунных В-лимфоцитов с миеломной (опухолевой) клеткой. Полученные гибриды обладали специфическими свойствами антителопродуцента и «бессмертием» раковотрансформированной клетки. Такой вид клеток получил название гибридом. Гибридома хорошо размножается в искусственных питательных средах и в организме животных и в неограниченном количестве вырабатывает антитела. В результате дальнейшей селекции были отобраны отдельные клоны гибридных клеток, обладавшие наивысшей продуктивностью и наибольшей аффинностью специфических антител. Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, размножают или в аппаратах, приспособленных для выращивания культур клеток или же вводя их внутрибрюшинно особой линии (асцитным) мышам. В последнем случае моноклональные антитела накапливаются в асцитной жидкости, в которой размножаются гибридомы. Полученные как тем, так и другим способом моноклональные антитела подвергают очистке, стандартизации и используют для создания на их основе диагностических препаратов. Гибридомные моноклональные антитела нашли широкое применение при создании диагностических и лечебных иммунобиологических препаратов. 64 Методы приготовления и применения агглютинирую- щих, адсорбированных сывороток. В диагностике инфекционных болезней широко применяются иммунные реакции при идентификации возбудителя: при установлении родовой, видовой и типовой принадлежности микроба (вируса). Для постановки таких реакций необходимы специфические диагностические сыворотки, которые в зависимости от содержания соответствующих антител называются агглютинирующие, преципитирующие, гемолитические, противовирусные. Агглютинирующие сыворотки. Агглютинирующую сыворотку получают иммунизацией кроликов (внутривенно, подкожно или внутрибрюшинно) взвесью убитых бактерий, начиная с дозы 200 млн., затем 500 млн., 1 млрд., 2 млрд., микробных тел в 1 мл, с интервалами 5 дней. Через 7—8 дней после последней иммунизации берут кровь и определяют титр антител. Титром агглютинирующей сыворотки называется то максимальное разведение сыворотки, при котором происходит агглютинация с соответствующим микроорганизмом. Агглютинирующие сыворотки применяются при идентификации микроба в развернутой реакции агглютинации. Если изучаемый микроорганизм агглютинируется сывороткой до титра или до половины значения титра, его можно считать принадлежащим к тому виду, название которого указано на этикетке ампулы. Неадсорбированные агглютинирующие сыворотки обладают высоким титром — до 1 : 12 800 — 1 : 25 600. Недостатком таких сывороток является то, что они способны давать групповые реакции агглютинации, так как они содержат антитела к бактериям, имеющим общие антигены в пределах семейства, группы и рода. Поэтому в настоящее время большинство агглютинирующих сывороток выпускаются адсорбированными, монорецепторными и адсорбированными поливалентными, содержащими только типовые или видовые антитела и соответствующими или определенному типу или виду микроорганизма. Эти сыворотки не подлежат разведению. Для получения таких сывороток применяют метод Кастелляни — метод адсорбции, который состоит в том, что при насыщении агглютинирующей сыворотки родственными гетерогенными бактериями происходит адсорбция групповых антител, а специфические антитела остаются в сыворотке. В зависимости от полноты истощения групповых агглютининов можно получить монорецепторные сыворотки — сыворотки, имеющие антитела только к одному рецептору-антигену или адсорбированные, поливалентные, дающие реакции агглютинации с двумя — тремя родственными бактериями, имею- щими общий антиген, в отношении которого проводилась адсорбция. Адсорбированные сыворотки применяют при идентификации выделенных возбудителей в реакции агглютинации на стекле (пластинчатый метод). Агглютинирующие сыворотки наиболее широко применяются при диагностике заболеваний, вызываемых бактериями семейства Enterobacteriaceae. Так, при идентификации эшерихий используются поливалентные и типовые ОК-сыворотки; при дифференциации сальмонелл — набор сывороток: агглютинирующая адсорбированная поливалентная сальмонеллезная О-сыворотка (групп А, В, С, Д, Е) — для определения принадлежности к роду Salmonella, при положительном результате — определяют отдельно с каждой сывороткой (входящей в смесь) серологическую группу и в заключение определяется серологический тип выделенного возбудителя с моно-рецепторными Н-сыворотками сальмонелл, входящих в данную группу. |